ćwiczenie 5
ODZYSKIWANIE FRAGMENTÓW DNA Z ŻELI ELEKTROFORETYCZNYCH
W pracach genetyki molekularnej często zachodzi konieczność odzyskania z żelu elektroforetycznego określonych frakcji
DNA lub RNA. Czynność ta, zwana elucją, wykorzystywana jest między innymi w następujących pracach:
1. DNA uzyskany w wyniku klonowania zazwyczaj poddawany jest subklonowaniu, tzn. insert lub jego fragment zostaje
przeniesiony z jednego wektora do innego. Przeniesienie insertu do nowego wektora jest konieczne, gdyż wektory stosowane do
klonowania DNA nie dają takich możliwości badawczych, jakie można uzyskać z wykorzystaniem innych wektorów, np.
wektorów ekspresyjnych lub wektorów do transformacji organizmów eukariotycznych.
2. Subklonowanie konieczne jest również wówczas, gdy w wyniku klonowania uzyskano duży fragment DNA, np. klon
genomowy obejmujący kilka genów, a celem pracy jest sklonowanie pojedynczego genu lub jego fragmentu.
3. Elucja z żelu elektroforetycznego wykonywana jest również wtedy, gdy sklonowany fragment DNA, chcemy oddzielić od
wektora a aby poddać go reakcji znakowania, np. radioaktywnym izotopem. W niektórych przypadkach DNA po znakowaniu,
ponownie poddawany jest elektroforezie, tym razem w celu oddzielenia wyznakowanej cząsteczki od radioaktywnych
nukleotydów, które nie zostały do niej wbudowane.
Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli
agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy
niskotopliwe, dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29oC i
depolimeryzują w temp. +65oC, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną
frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia
DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w  80oC. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje
odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości,
umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej
agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach.
Używane do elucji agarozy o normalnej temperaturze topnienia nie mogą zostać stopione termicznie gdyż temperatura, którą
należałoby zastosować, czyli ponad +60oC, spowodowałaby denaturację DNA. Dlatego do stopienia wyciętego fragmentu agarozy
wykorzystuje się niektóre związki chemiczne, np. NaJ. Po chemicznym rozpuszczeniu agarozy, do odzyskania DNA z roztworu
często wykorzystuje się zdolność mikrokuleczek krzemowych do adsorpcji kwasów nukleinowych na swojej powierzchni. Kuleczki
z przyłączonym DNA tworzą zawiesinę, którą może łatwo oddzielić od roztworu na drodze wirowania. Dodanie do uzyskanego
osadu wody lub buforu TE powoduje oddysocjowanie DNA z kuleczek. Metoda ta, ze względu na krótki czas trwania i wysoką
wydajność jest obecnie bardzo często wykorzystywana.
Elucja wykonana przy zastosowaniu DEAE-celulozy (dietyloaminoetyl) nie
wymaga topienia agarozy. Przeniesienie DNA na DEAE celulozę odbywa się w trakcie
rozdziału elektroforetycznego, podczas którego fragment bibułki DEAE celulozy należy
umieścić w żelu na drodze migracji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się właściwości
jonowymienne DEAE celulozy. W warunkach elektroforetycznych, czyli przy
stosunkowo niskim stężeniu soli i neutralnym pH, grupy funkcyjne DEAE-celulozy,
obdarzone ładunkiem dodatnim (+), wiążą cząsteczki DNA. Przeniesienie DEAE
celulozy do buforu o wysokim st. soli, np. NaCl, powoduje elucję DNA do roztworu.
DNA można również eluować z agarozy stosując wirowanie w probówce z filtrem. Wycięty fragment agarozy po nałożeniu na
filtr i odwirowaniu uwolni DNA, który wraz z buforem obecnym w żelu przedostanie się do probówki pod filtrem.
W przypadku elucji dużych fragmentów DNA, tzn. powyżej 5 tpz, gdy inne metody okazują się mało wydajne, zaleca się
stosowanie elektroelucji w woreczkach dializacyjnych. W metodzie tej wycięty fragment żelu z frakcją DNA przenosi się do
woreczka dializacyjnego a następnie całość umieszcza się w aparacie elektroforetycznym. Pod wpływem pola elektrycznego, DNA
migruje z żelu i zatrzymuje się przy wewnętrznych ściankach woreczka. Po usunięciu agarozy, DNA łatwo może zostać wypłukany z
woreczka do nowej probówki.
Oprócz przedstawionych technik spotkać można wiele innych sposobów odzyskiwania DNA z żeli agarozowych.
DNA z żeli poliakryloamidowych często eluowany jest po reakcji znakowania. W tym przypadku, przed przystąpieniem do
elucji należy zidentyfikować pozycję DNA z wykorzystaniem autoradiografii. Następnie fragment żelu z DNA lub RNA zostaje
wycięty, zmacerowany i zawieszony w buforze elucyjnym (1 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 M octan amonu; 10mM octan magnezu; 0,1%
SDS). Całość poddawana jest następnie kilkunastogodzinnej inkubacji, podczas której kwasy nukleinowe dyfundują z
rozdrobnionego żelu do buforu. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę żelu należy odwirować od buforu zawierającego uwolniony
DNA. Na zakończenie, DNA z roztworu należy wytrącić etanolem.
Sprzęt i odczynniki
 agaroza niskotopliwa  DEAE celuloza (Schleicher & Schuell  chloroform
 trawiony DNA NA-45�)  bufor TE 10/1
 aparaty elektroforetyczne  buf. NTE "low"  octan amonu 10M
 obciążacz LB  buf. NTE "high"  etanol 96%
 skalpel pęseta  fenol  etanol 75%
Postępowanie
I. Odzyskiwanie DNA z agarozy z wykorzystaniem ekstrakcji fenolowej
1. Przygotować 1% żel z agarozy niskotopliwej, 7. Po rozpuszczeniu agarozy preparat ekstrahować 1 objętością
fenolu, przez ok. 2 min., a następnie próbę zwirować w
zawierający bromek etydyny o stęż. 2,5 źg/ml.
mikrowirówce przez 5 min.
2. Do kieszonek nałożyć preparat DNA połączony z
8. Fazę wodną, zawierającą DNA, przenieść do nowej
barwnikiem elektroforetycznym.
probówki eppendorfa uważając, aby nie pobrać interfazy
3. Aby uniknąć wzrostu temperatury, prowadzącej do
występującej pomiędzy fazą wodną i fenolową, gdyż
depolimeryzacji żelu, elektroforezę prowadzić przy
zawiera ona agarozę.
niskim napięciu prądu (<100V).
9. Fazę wodną ekstrahować 1 objętością mieszaniny
4. W świetle UV wyciąć fragment żelu zawierający
chloroform: alkohol izoamylowy (24:1) przez 2 min. i
prążek DNA i przenieść go do probówki eppendorfa.
wirować w mikrowirówce przez 5 min.
Należy skrócić do minimum czas ekspozycji DNA w
10. Z zebranej fazy wodnej wytrącić DNA dodając 0,2 objętości
świetle UV oraz odciąć większość agarozy, która nie
10 M octanu amonu i 2,5 objętości schłodzonego, 95%
zawiera DNA.
etanolu. Próbę trzymać 10 min w -20oC.
5. Stopić wycięty fragment żelu w temp. +65oC.
11. Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić
6. Do rozpuszczonej agarozy dodać 4 objętości buforu TE
elektroforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.
i wymieszać. Jeżeli w próbie widoczne są fragmenty
nierozpuszczonego żelu, kontynuować topnienie.
II. Odzyskiwanie DNA z agarozy z wykorzystaniem zamrażania.
1. Przygotować 1% żel z niskotopliwej agarozy 6. Do rozpuszczonej agarozy dodać 4 objętości buforu TE i
wymieszać całość. Jeżeli w próbie widoczne są
zawierający bromek etydyny o stęż. 2,5 źg/ml.
fragmenty nierozpuszczonego żelu, kontynuować
2. Do kieszonek nałożyć preparat DNA połączony z
topnienie.
barwnikiem elektroforetycznym.
7. Po stopieniu agarozy próbę zamrozić w -80oC.
3. Aby uniknąć wzrostu temperatury, prowadzącej do
8. Po rozmrożeniu preparat wirować przez 5 min. przy 12
depolimeryzacji żelu, elektroforezę prowadzić przy
tyś. RPM.
niskim napięciu prądu (<100V).
9. Ostrożnie oddzielić supernatant, zawierający DNA, od
4. W świetle UV wyciąć fragment żelu zawierający prążek
osadu zawierającego agarozę.
DNA i przenieść go do probówki Eppendorfa. Należy
skrócić do minimum czas ekspozycji DNA w świetle UV
10. DNA z supernatantu wytrącić dodając 0,2 objętości 10M
oraz odciąć większość agarozy, która nie zawiera DNA.
octanu amonu i 2,5 objętości schłodzonego, 95% etanolu.
Próbę inkubować przez 10 min w temp. -20oC.
5. Fragment żelu zawierający DNA stopić w temp. +65oC.
11. Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić
elekoforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.
III. Odzyskiwanie DNA z wykorzystaniem DEAE-celulozy.
Bufor NTE "low" Bufor NTE "high Przygotowanie DEAE celulozy do pracy
Przycięte skrawki DEAE-celulozy płukać w następujących warunkach:
150 mM NaCl 1,0 M NaCl
1. 5 min w 10mM EDTA
2. 5 min w 0,5N M NaOH
0,1 mM EDTA 0,1 mM EDTA
3. 6 razy w sterylnej wodzie
4. bibułki przechowywać w wodzie w +4oC.
20 mM Tris-HCl pH 8,0 20 mM Tris-HCl pH 8,0
8. Bibułkę pociąć sterylnymi nożyczkami, umieścić w
1. Przygotować 1% żel agarozowy zawierający bromek
probówce eppendorfa i zalać 500 źl medium NTE
etydyny o stęż. 2,5 źg/ml.
"low", po czym wytrząsać ok. 30 sek. w celu usunięcia
2. Na żel nałożyć DNA plazmidowy, po reakcji
resztek agarozy.
restrykcyjnej.
9. Po usunięciu buf.  low zalać bibułkę 100 źl buforu
3. Prowadzić elektroforezę.
NTE "high". Próbę inkubować przez 15 min. w temp.
4. Wykonać skalpelem nacięcie tuż pod prążkiem DNA
+65oC. W roztworze o wysokiej sile jonowej następuje
przeznaczonym do elucji.
uwolnienie DNA z DEAE celulozy.
5. W uzyskanej szczelinie umieścić odpowiednio
10. Roztwór znad bibułki przenieść do nowej probówki
przycięty fragment bibułki DEAE-celulozy.
eppendorfa i wytrącić DNA 2,5 objętościami
6. Żel ponownie umieścić w aparacie schłodzonego, 98% etanolu. Próbę trzymać 10 min w
elektroforetycznym i kontynuować rozdział do czasu, temp. -20oC.
aż prążek zostanie całkowicie zaadsorbowany przez
11. Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić
bibułkę (ok. 5-10 min).
elekoforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.
7. Bibułki wyjąć z żelu i sprawdzić w świetle UV czy
cały DNA został na nie przeniesiony.