Agrobiotechnologia
Temat:
A
ańcuchowa reakcja polimerazy (PCR).
Agrobiotechnologia
A
AC
CUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY
PCR jest jedną z najpotężniejszych
technik wykorzystywanych w biologii
molekularnej
Wymyślona i zaprojektowana przez
Kary Mullis a w 1983 (1993 Nobel, w
dziedzinie chemii)
http://www.leelofland.com/wordpress/?p=6815
Agrobiotechnologia
Fragment Klenowa Polimerazy I E.coli
http://eshop.intronbio.com/index.php?var=Good&Good_no=452
- pierwsza polimeraza użyta do PCR
- nie jest termostabilna
- po każdej denaturacji nowa porcja enzymu
Agrobiotechnologia
Polimerazy termostabilne
Wiele termostabilnych polimeraz o aktywności DNA polimerazy
typu I, izolowanych jest z ekstremotermofili należących do
Archebacteria (temp. optymalna powyżej 800C) izolowanych z dna
oceanów w pobliżu kominów geotermalnych.
http://wiedza.ekologia.pl/energia-odnawialna/
http://pl.wikipedia.org/wiki/Ziemia-%C5%9Bnie%C5%BCka
Agrobiotechnologia
Przebieg reakcji PCR
Cykliczne zmiany temperatury:
950C  denaturacja DNA
550C-650C  przyłączanie starterów do DNA
680C-720C  synteza nowego fragmentu DNA
Agrobiotechnologia
Przebieg reakcji PCR
550C
Agrobiotechnologia
Do reakcji PCR jest potrzebne:
1. Matryca DNA (lub RNA)
2. Startery (dwa różne)
3. Wolne nukleotydy (dNTP)
4. Polimeraza termostabilna
5. Bufor, jony Mg2+
Agrobiotechnologia
Matryca DNA
Ilość matrycowego DNA mieści się w zakresie:
Plazmidowy lub fagowy DNA 0,01-1 ng
Genomowy DNA 100-1000 ng
Większa ilość matrycowego DNA, zwiększa
ilość niespecyficznych produktów PCR.
Agrobiotechnologia
CZY MOŻNA AMPLIFIKOWAC RNA ?
Termostabilna POLIMERAZA DNA wymaga matrycy DNA, nie będzie
kopiować RNA mRNA musi zostać najpierw  przepisane na cDNA z
użyciem ODWROTNEJ TRANSKRYPTAZY (RT-PCR)
cDNA jest matrycą w reakcji PCR  DNA nie musi być dwuniciowe
KIEDY AMPLIFIKUJEMY RNA ?
- badany organizm nie zawiera DNA, np. retrowirusy
- chcemy zbadać aktywność genu a nie jedynie jego obecność
w genomie
Agrobiotechnologia
Startery  krótkie fragmenty oligonukleotydowe (16-24 pz)
komplementarne do matrycy, flankują amplifikowany fragment
powinny mieć wyrównaną zawartość zasad G/C i A/T
Tm 55-65�C, oba startery powinny mieć zbliżoną temperaturę topnienia
nie powinny zbyt silnie wiązać się na końcu 3
specyficzność końca 3 decyduje o powodzeniu amplifikacji
nie powinny tworzyć wewnętrznych struktur 2-rzędowych
nie mogą komplementować między sobą
stężenie 0.1-0.5 źM (za dużo - pomyłki, za mało - mniej produktu).
Agrobiotechnologia
Wolne nukleotydy (dNTP)
- W mieszaninie reakcyjnej stężenie dNTP po 200 m�M
- Nierówna ilość dNTP redukuje wydajność amplifikacji
Optymalne stężenie dNTP zależy od:
- Długości amplifikowanego produktu
- Stężenia MgCl2
- Stężenia starterów
Agrobiotechnologia
Stężenia MgCl2
" Stężenia waha się od 1-5 mM
" Jony magnezu wraz z nukleotydami są substratem dla polimerazy
" Podwyższając stężenie dNTP należy zwiększać stężenie jonów Mg2+
" Nukleotydy redukują pulę wolnych jonów Mg2+
" Za dużo jonów Mg2+  rośnie ilość niespecyficznych produktów
PCR i obniżona wierność syntezy
" Jeżeli próbka DNA zawiera EDTA zawartość jonów Mg2+ powinna
proporcjonalnie wzrosnąć
Agrobiotechnologia
Bufor
- Zapewnia optymalne pH ok. 8 i optymalne stężenie soli
- Może zawierać dodatki (np. BSA, Triton, siarczan amonu),
które mogą stabilizować polimerazę oraz modyfikować
oddziaływania między matrycą i starterami
Agrobiotechnologia
Taq polimeraza
" Stężenie 0,5  2,5 U na reakcję (wyjątkowo 4-5U)
" Wyższe stężenie  synteza niespecyficznych produktów
" Dodaje nukleotyd z adeniną na końcu 3
" Maksymalna aktywność katalityczna 75-800C (370C 10%
aktywności)
http://getglue.com/topics/p/taq_polymerase