laboratorium przemysłowe
dr Paweł Sroka
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza w Krakowie
Instrumentalne metody wykrywania
skazy korkowej w winach
Streszczenie Summary
Skaza korkowa jest poważnym problemem w przemyśle winiar- Cork taint is an important problem in wine industry. Tainted wines
skim. Wadliwe wina charakteryzujÄ… siÄ™ nieprzyjemnym zapachem are characterized by unpleasant musty, mouldy odour of chloro-
stęchlizny i pleśni, którego z
ródłem są związki chlorofenolowe. phenolic compounds. In bottles, these compounds migrate from
Substancje odpowiedzialne za niekorzystny zapach migrujÄ… do bu- the cork to wine or are formed during winification. In this paper
telkowanego wina z korka lub powstajÄ… w trakcie produkcji napoju. the instrumental methods used for chloroanisole detection and
W pracy tej przedstawiono instrumentalne metody wykrywania quantification are presented. This compounds are responsible for
i ilościowego oznaczania chloroanizoli  związków odpowiedzial- the most cases of cork taint.
nych za większość przypadków skazy korkowej.
SÅ‚owa kluczowe Key words
wino, aromat wina, skaza korkowa, 2,4,6-chloroanizol wine, wine aroma, cork taint, 2,4,6-chloroanisole
Skaza (wada) korkowa stanowi poważny problem dotykający, jak szacują mikrobiologicznej, przy katalitycznym udziale pleśni, powstaje 2,4,6-
różne z
ródła informacji, ok. 2-5% wszystkich produkowanych win -trójchloroanizol. Procesy te zachodzą podczas produkcji i przecho-
(16). Zapach korka w winie jest bardzo specyficzny i oceniany jako wywania korka oraz na dębowych beczkach stosowanych w produkcji
nieprzyjemny. Może on być ostry, podobny do zapachu stęchlizny wina (20). Z powodu dużej lotności i zdolności do adsorbowania się
czy pleśni, lub prawie niewyczuwalny. Szerokie badania prowadzone na powierzchni różnych materiałów TCA szybko przenosi się poprzez
na winach dotkniętych skazą korkową wykazały, że głównym z
ródłem sprzęt stosowany w winiarni. Pleśnie tworzące 2,4,6-trójchloroanizol
zapachu korkowego jest 2,4,6-trójchloroanizol (TCA) obecny w więk- są tlenowcami wrażliwymi na obecność etanolu oraz siarczanów(IV),
szości wadliwych napojów. Niepożądanymi substancjami w winach dlatego nie rozwijają się na wewnętrznych ściankach pełnych beczek,
o nieprzyjemnym zapachu pleśniowym są także: gwajakol, 2-metylo- ale na ich zewnętrznej powierzchni. Każdy etap produkcji wina,
izoborneol, 1-okten-3-on, 1-okten-3-ol oraz inne chlorowcopochodne taki jak: rozdrabnianie owoców, fermentacja w otwartych tankach
anizolu: 2,3,4,6-czterochloroanizol (TeCA), pięciochloroanizol (PCA), (kontakt z powietrzem zawierającym TCA), czy obciąg wina mogą
2,4,6-trójbromoanizol (TBA) (15). prowadzić do jego skażenia. Dodatkowe z
ródło zanieczyszczenia
y
ródła skażenia wina mogą być różne, jednym z nich są mikro- stanowią pestycydy zawierające chlor, obecne w surowcu winiarskim,
biologiczne zanieczyszczenie korka lub obecność substancji zawiera- często metabolizowane przez pleśnie do chloropochodnych fenoli
jących chlor. Związki zapachowe korka mogą migrować do napoju (9, 15).
alkoholowego. Korek nie jest jednak jedynym z
ródłem kontaminacji Skaza korkowa jest istotnym problemem ekonomicznym w prze-
wina. Dodatkowe zagrożenie stwarza stosowanie w produkcji wody myśle winiarskim (14). Roczne straty producentów win w samych
chlorowanej lub środków zawierających chlor, przeznaczonych do Stanach Zjednoczonych szacuje się na sto milionów dolarów, dlate-
odkażania sprzętu w winiarni. Skaza korkowa częściej związana jest go niezbędne stało się opracowanie metod analitycznych znacznie
ze stanem higieny w winiarni i warunkami przechowywania napojów bardziej czułych niż zmysły ludzkie (23). Ze względu na niskie
alkoholowych niż z samym korkiem (19). Związki odpowiedzialne za stężenie chlorowcopochodnych anizolu w winie oraz lotność tej
skazę korkową wykryto zarówno w pomieszczeniach winiarni, ujęciach grupy związków najczęściej stosowaną metodą analizy ilościowej jest
wody, jak i w beczkach. Obecność wyżej wymienionych substancji chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC-MS).
stanowi duży problem dla winiarzy, ponieważ wymaga zachowania Zamiast detektora mas (MS) można zastosować znacznie tańszy de-
szczególnej ostrożności podczas produkcji, aby nie dopuścić do tektor wychwytu elektronów (ECD). Ponieważ omawiane pochodne
skażenia produktu (7, 14). anizolu są oznaczane w różnego rodzaju materiałach (wina, korki,
Najlepiej przebadanym związkiem wpływającym na powstawanie woda, powietrze, opakowania), dotychczas opracowano wiele sposo-
skazy korkowej jest 2,4,6-trójchloroanizol. TCA charakteryzuje się bów przygotowania prób do analiz z zastosowaniem nowoczesnych
niskim progiem wyczuwalności zapachowej, wobec czego związek ten technik ekstrakcyjnych.
wykrywany jest już w śladowych ilościach. Próg wyczuwalności TCA Obecnie większość badań skupia się na wykryciu TCA w winach
w winie wynosi poniżej 10 ng/L i zależy bezpośrednio od indywidu- i materiałach korkowych przez wykorzystanie: ekstrakcji rozpuszczal-
alnych cech sensorycznych człowieka i rodzaju wina (16). Wina, które nikiem (4), ekstrakcji płynem w stanie nadkrytycznym (SFE) (22),
są dotknięte skazą korkową, zawierają 20-370 ng/L TCA (2). ekstrakcji ciecz  ciało stałe (SPE) (20), mikroekstrakcji do fazy stałej
TCA w korkach powstaje ze związków fenolowych w wyniku (SPME) (11) i wielokrotnej mikroekstrakcji MHS-SPME (5), ekstrakcji
dwuetapowego mechanizmu. Fenole obecne w korku ulegają reak- sorpcyjnym prętem mieszającym (SBSE) (8) oraz technik dynamicz-
cji chlorowania za pomocą podchlorynu wapnia, w wyniku czego nej analizy fazy nadpowierzchniowej (PT) (3) i różnych modyfikacji
powstaje 2,4,6-trójchlorofenol, z którego po bezpośredniej metylacji perwaporacji (PV) (7).
Laboratorium | 3/2008
34
laboratorium przemysłowe
Granica wykrywalności Względne
Technika (oznaczalności) odchylenie Odzysk (%) Sposób detekcji Literatura
(ng/L) standardowe (%)
Ekstrakcja
900-1190
rozpuszczalnikiem 6-30 43-110 MS, ECD 2, 4, 10
(3950)
organicznymk
3-13b
PT 12,5 4-11cz 88-102 MS 3
3-12k
PV 4-26 2-6 82-118 MS 7
0,03b-0,06cz
SBSE 2-4 b.d. MS 24
(0,1-0,2)
5 pg
SFEk 797 MS 22
(9 pg)
0,1
SPE 2-6 86-102 MS 20
(2)
0,15-5,0
SPME 1-13 28-113 MS, ECD 1, 7, 11
(0,4-18)
Tabela 1. Parametry oznaczania TCA w winach i korkach uzyskane za pomocą chromatografii gazowej z różnymi technikami przygotowania prób
b  wina białe, cz  wina czerwone, k  korek, PT  zatężanie techniką wymywania i wychwytywanie na złożu stałego sorbentu, PV  pewaporacja,
SBSE  ekstrakcja z wykorzystaniem wirującego elementu sorpcyjnego, SFE  ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym, SPE  ekstrakcja do fazy stałej,
SPME  mikroekstrakcja do fazy stałej, b.d.  brak danych
Poszczególne metody różnią się granicą wykrywalności i oznaczal-
nością oraz parametrami, takimi jak względne odchylenie standardowe
(RDS) i odzysk metody (tabela 1).
Jako rozpuszczalniki do ekstrakcji TCA z wina i korków używano
n-pentanu, n-heksanu oraz mieszaninÄ™ n-pentanu z eterem dietylowym
lub octanem etylu. Ekstrakcje wykonywano poprzez mieszanie za po-
mocÄ… aparatu Soxhleta, Kuderna-Danisha oraz w Å‚az
ni ultradz
więkowej
(2, 9, 10, 14, 15).
W przypadku rozdziału chromatograficznego ważnymi zagadnie-
niami podczas wyboru metody oznaczenia 2,4,6-trójchloroanizolu są
dostępność i koszt aparatury do przygotowywania próby oraz możli-
wość automatyzacji oznaczeń, co jest niezwykle istotne w przypadku
rutynowych analiz. Powyższe wymagania spełnia analiza TCA oparta
na nadpowierzchniowej mikroekstrakcji do fazy stałej (HS-SPME),
opisana we wcześniejszych numerach  Laboratorium  Przeglądu
Ogólnopolskiego (21). Dotychczas do tego celu stosowano różne
typy włókien SPME, pokryte polidimetylosiloksanem (PDMS) 7 µm
i 100 µm, kopolimerem polidimetylosiloksanu z diwinylobenzenem
(PDMS-DVB) 65 µm, poliakrylanem (PA) 85 µm, CAR-PDMS 65 µm
i DVB-CAR-PDMS 50/30 µm (5, 11). Badania prowadzone przez
Martínez-UruÅ„uela i współpracowników (12) wykazaÅ‚y, że w przy-
padku win czerwonych TCA jest najlepiej absorbowane przez włókna
DVB-CAR-PDMS 50/30 µm w temperaturze 70°C, a optymalny
czas ekstrakcji wynosi 60 min. W przypadku stosowania włókien
PDMS 100 µm optymalna temperatura ekstrakcji jest niższa i wynosi
20°C. Udowodniono również, że mieszanie próby w czasie ekspozycji
włókna w fazie nadpowierzchniowej oraz wysycenie próby chlorkiem
sodu zwiększa względną odpowiedz
detektora (6).
Soleas wraz ze współpracownikami (20) przebadali 2400 różnych win,
stosując ekstrakcję ciecz  ciało stałe (SPE) za pomocą kolumn C18.
Złoże kolumny kondycjonowano octanem etylu i roztworami etanolu,
a eluowano dwuchlorometanem, uzyskując 125-krotne zatężenie ana-
litu względem wyjściowej próby. Na podstawie uzyskanych wyników
wykazano największe skażenie TCA win zamykanych korkami aglo-
merowanymi (tabela 2).
Ze względu na specyfikę chromatografii gazowej oznaczenia
chlorowcopochodnych anizolu mogą być wykonywane jedynie przez
Laboratorium | 3/2008
35
35
laboratorium przemysłowe
wykwalifikowany personel, a nakłady inwestycyjne przeznaczone 6. Fischer C., Fischer U.: Analysis of cork taint in wine and cork material at olfac-
na zakup aparatury analitycznej wynoszą kilkaset tysięcy złotych. tory subthreshold levels by solid phase microextraction.  J. Agric. Food Chem. ,
Nadal prowadzone są prace mające na celu oznaczanie związków 1997, 45, 1995-1997.
odpowiedzialnych za skazÄ™ korkowÄ… za pomocÄ… znacznie taÅ„szych 7. Gómez-Ariza J.T., García-Barrera T., Lorenzo F.: Analysis of anisoles in
od GC metod instrumentalnych, które można zastosować w przy- wines using pervaporation coupled to gas chromatography-mass spectrometry.
zakładowych laboratoriach winiarni. Przykładowo zespół Moore a  J. Chromatogr. A , 2004, 1049, 147-153.
(13) opracował biosensor do detekcji TCA. Jednak bezpośrednie 8. Hayasaka Y., MacNamara K., Baldock G.A., Taylor R.L., Pollnitz A.P.:
oznaczenie 2,4,6-trójchloroanizolu w winach wymienioną metodą Application of stir bar sorptive extraction for wine analysis.  Anal. Bioanal.
nie było możliwe ze względu na zbyt wysokie stężenie etanolu Chem. , 2003, 375, 948 955.
w badanych próbach. 9. Hill J.L., Hocking A.D., Whitfield F.B.: The role of fungi in the production of
Obiecujące rezultaty uzyskał Sanvicens ze współpracownikami (18), chloroanisoles in general purpose freight containers.  Food Chem. , 1995, 54,
którzy opracowali metodę selektywnej ekstrakcji TCA i TBA z wyko- 161-166.
rzystaniem specyficznych przeciwciaÅ‚, poÅ‚Ä…czonÄ… z testem immuno- 10. Juanola R., Subirá D., Salvadó V., Garcia-Regueiro J.A., Anticó E.: Evaluation
enzymatycznym (ELISA). Metoda ta umożliwia oznaczenie w winach of an extraction method in the determination of the 2,4,6-trichloroanisole content
obecności chloro- oraz bromopochodnych anizolu w stężeniu od of tainted cork.  J. Chromatogr. A , 2002, 953, 207-214.
200-400 ng/L. Metodyka testów ELISA pozwala na przeprowadzenie 11. Lizarraga E., Irigoyen A., Belsue V., González-PeÅ„as E.: Determination of
wielu oznaczeń równocześnie, a dzięki stosunkowo niskiemu kosz- chloroanisole compounds in red wine by headspace solid-phase microextraction and gas
towi aparatury i jej prostocie może być wykonywana bezpośrednio chromatography-mass spectrometry.  J. Chromatogr. A , 2004, 1052, 145-149.
w winiarniach. 12. Martínez-UruÅ„uela A., González-Sáiz J.M., Pizarro C.: Optimisation of
Podejmuje się także próby wykrycia skazy korkowej przy użyciu a headspace solid-phase microextraction method for the direct determination of
tzw. sztucznego nosa. Do tego celu zastosowano brytyjskie urzÄ…dze- chloroanisoles related to cork taint in red wine.  J. Chromatogr. A , 2004, 1056,
nie AromaScan (A32S/8S) z jednostkÄ… analizujÄ…cÄ… A32S, zawierajÄ…cÄ… 49-56.
32-elementowy zestaw czujników. W celu kontroli jakości badane korki 13. Moore E., Pravda M., Guilbault G.G.: Development of a biosensor for the
umieszczono w termostatowanym pojemniku, z którego pobierano quantitative detection of 2,4,6-trichloroanisole using screen printed electrodes.  Anal.
powietrze zawierające lotne składniki korka (faza nadpowierzchniowa). Chim. Act. , 2003, 484, 15-24.
Zarejestrowane sygnaÅ‚y byÅ‚y przetwarzane przez specjalne oprogra- 14. PeÅ„a-Neira A., Fernández de Simón B., García-Vallejo M.C, Hernández T.,
mowanie, a po kalibracji umożliwiaÅ‚y szybkie i proste klasyfikowanie Cadahía E., Suárez J.A.: Presence of cork-taint responsible compounds in wines
prób na dwie grupy: do zaakceptowania i niespełniające wymagań and their cork stoppers.  Eur. Food Res. Technol. , 2000, 211, 257-261.
jakościowych (17). 15. Pereira C.S., Pires A., Valle M.J., Boas L.V., Marques J.J.F., San-Rom
o M.V.:
W związku z wysokimi kosztami ponoszonymi przez producentów Role of Chrysonilia sitophila in the quality of cork stoppers for sealing wine bottles.
win, związanymi z występowaniem skazy korkowej, wprowadzono  J. Ind. Microbiol. Biotechnol. , 2000, 24, 4, 256-261.
pewne zmiany. Obecnie coraz częściej stosowane są butelki z winem 16. Prescott J., Norris L., Kunst M., Kim S.: Estimating a   consumer rejection
zamykane korkami syntetycznymi lub zakrętkami. Wyeliminowano threshold  for cork taint in white wine.  Food Qual. Pref. , 2005, 16, 345-349.
środki dezynfekujące na bazie chloru, jak również zwrócono większą 17. Rocha S., Delgadillo I., Ferrer Correia A. J., Barros A., Wells P.: Application
uwagę na warunki przechowywania surowców i materiałów do pro- of an electronic aroma sensing system to cork stoppers quality control.  J. Agric.
dukcji win, w tym korków, palet, kartonów oraz tektury. Stosowanie Food Chem. , 1998, 46, 145-151.
tradycyjnych zamknięć wymaga stałej, ścisłej kontroli jakościowej 18. Sanvicens N., Moore E.J., Guilbault G.G., Marco M.P.: Determination
korków, szczególnie pod względem zawartości składników lotnych oraz of haloanisols in white wine by immunosorbent solid-phase extraction followed
przechowywania ich w odpowiednich warunkach uniemożliwiających by enzyme-linked immunosorbent assay.  J. Agric. Food Chem. , 2006, 54,
wtórne skażenie. 9176-9183.
19. Smoliński M.: Wada korkowa wina  2,4,6-trójchloroanizol (TCA)  występowanie
Piśmiennictwo i zapobieganie.  Przem. Ferm. Owoc. Warzyw. , 2005, 3, 21-22.
1. Alzaga R., Ortiz L., Sánchez-Baeza F., Marco M.P., Bayona J.M.: Accurate 20. Soleas G.J., Yan J., Seaver T., Goldberg D.M.: Method for the gas chromatogra-
determination of 2,4,6-trichloroanisole in wines at low parts per trillion by solid- phic assay with mass selective detection of trichloro compounds in corks and wines
-phase microextraction followed by GC-ECD.  J. Agric. Food Chem. , 2003, applied to elucidate the potential cause of cork taint.  J. Agric. Food Chem. ,
51, 3509-3514. 2002, 50, 1032-1039.
2. Buser H.R., Zanier C., Tanner H.: Identification of 2,4,6-trichloroanisole as 21. Sroka P., Tuszyński T.: Zastosowanie mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME)
a potent compound causing cork taint in wine.  J. Agric. Food Chem. , 1982, i chromatografii gazowej do oznaczania związków lotnych w napojach. Cz. II.
30, 359-362. Napoje alkoholowe.  Laboratorium  Przegląd Ogólnopolski , 2007, 9,
3. Campillo N., Aguinaga N., ViÅ„as P., López-García I., Hernández-Córdo- 42-43.
ba M.: Purge-and-trap preconcentration system coupled to capillary gas chromato- 22. Taylor M.K., Young T.M., Butzke C.E., Ebeler S.E.: Supercritical fluid
graphy with atomic emission detection for 2,4,6-trichloroanisole determination in extraction of 2,4,6-trichloroanizole from cork stoppers.  J. Agric. Food Chem. ,
cork stoppers and wines.  J. Chromatogr. A , 2004, 1061, 85-91. 2000, 48, 2208-2211.
4. Chatonnet P., Bonnet S., Boutou S., Labadie M.D.: Identification and 23. Vlachos P., Kampioti A., Kornaros M., Lyberatos G.: Development and
responsibility of 2,4,6-tribromoanisole in musty, corked odors in wine.  J. Agric. evaluation of alternative processes for sterilization and deodorization of cork barks
Food Chem. , 2004, 52, 1255-1262. and natural cork stoppers.  Eur. Food Res. Technol. , 2007, 225, 653-663.
5. Ezquerro O., Tena M.T.: Determination of odour-causing volatile organic 24. Zalacain A., Alonso G. C., Lorenzo C., IÅ„iguez M., Salinas M. R.: Stir bar
compounds in cork stoppers by multiple headspace solid-phase microextraction. sorptive extraction for the analysis of wine cork taint.  J. Chromatogr. A , 2004,
 J. Chromatogr. A , 2005, 1068, 201-208. 1033, 173-178.
Laboratorium | 3/2008
36