HODOWLANE I NIEHODOWLANE
METODY WYKRYWANIA
DROBNOUSTROJÓW
Celem diagnostyki mikrobiologicznej
jest:

Identyfikacja czynnika etiologicznego
odpowiedzialnego za zakażenie.

Określenie profilu wrażliwości drobnoustroju na
chemioterapeutyki.

Nadzór mikrobiologiczny i epidemiologiczny.
Metody wykorzystywane w mikrobiologi
można podzielić na:

Bezpośrednie -polegające na wykryciu
drobnoustroju w materiale badanym.

Pośrednie  oparte na wykrywaniu swoistych
przeciwciał.
Inny podział tych metod to:

Metody konwencjonalne (hodowlane)

Metody niehodowlane.
Metody hodowlane
Metody hodowli drobnoustrojów połączone są z
izolacją i identyfikacją mikroorganizmu. W
pobranym i badanym materiale występują różne
gatunki drobnoustrojów, w celu ich wyizolowania,
namnożenia i uzyskania czystej hodowli , próbkę
posiewa się na odpowiednie podłoża wzrostowe.
Oprócz identyfikacji czynnika etiologicznego
powinny być wykonane też testy wrażliwości na
antybiotyki.
 Posiew bakterii
Posiew- zakładanie kolonii (hodowli).
Podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej
i mikrobiologicznej w mikrobiologii klinicznej jak i
badawczej to metoda uzyskiwania pojedynczych,
odosobnionych kolonii bakterii (grzybów) na
podłożu mikrobiologicznym.
Hodowla drobnoustrojów- stworzenie
odpowiednich warunków, w których bytują
drobnoustroje.
Warunki hodowli muszą być dostosowane
do rodzaju i wymagań drobnoustroju.
Warunki hodowli drobnoustrojów:
- odpowiedni rodzaj pożywki (zawartość
składników odżywczych)
- czynniki chemiczne (pH, tlenowość)
- czynniki fizyczne (temperatura inkubacji)
Rodzaje hodowli
hodowla mieszana-
hodowla czysta-
zawiera drobnoustroje
zawiera jeden
z różnych gatunków
gatunek
drobnoustrojów
Hodowla statyczna
Krzywa rzeczywista wzrostu populacji bakterii w hodowli statycznej.
Faza zastoju (lag faza) - następuje po wsianiu bakterii do podłoża. Ilość bakterii w tej
fazie nie wzrasta, a nawet czasami następuje ich spadek liczebności. Jest to okres w
którym drobnoustroje przystosowują się do nowego środowiska
Faza młodości fizjologicznej - komórki intensywnie oddychają, szybko powiększają
swoje wymiary ale nie dzielą się. Komórki w tej fazie są bardziej wrażliwe na różne
niekorzystne czynniki. Faza ta jest bardzo krótka i kończy się w momencie kiedy komórki
zaczynają się dzielić.
Faza logarytmicznego wzrostu - na początku fazy wielkość komórek ulega zmniejszeniu
by następnie utrzymywać się na stałym poziomie. Komórki bardzo intensywnie dzielą się
przy zachowaniu stałej częstości podziału. Nie zmienia się wiek osobniczy komórek.
Długość tej fazy zależy od czynników środowiskowych jak i od cech danej bakterii. Faza ta
może ulec skróceniu na skutek wyczerpania się składników pokarmowych, nadmiernego
nagromadzenia toksycznych produktów metabolizmu itp.
Faza równowagi - następuje zwolnienie tępa podziałów. Przyrost liczby komórek z
podziału i ich ubytek powodowany zamieraniem jest w stanie równowagi w wyniku czego
liczba żywych komórek pozostaje na stałym poziomie. Komórki ulegają zmianom stają się
nieregularne, powstają formy rozdęte.
Faza zamierania - podziały stają się bardzo rzadkie, a przypadki śmierci komórek stają się
coraz częstsze a w rezultacie liczba komórek maleje.
Faza logarytmicznego zamierania - podziały komórek prawie całkowicie ustają, a
komórki zamierają. W rezultacie liczba komórek stale maleje. W niekorzystnych
warunkach zamieranie może zachodzić bardzo szybko wówczas mówimy o fazie śmierci
logarytmicznej.
Hodowla ciągła
W przeciwieństwie do hodowli statycznej
umożliwia ona ciągły wzrost bakterii w fazie
logarytmicznego wzrostu. Uzyskuje się je
zapewniając stały dopływ jałowej (czystej)
pożywki do miejsca hodowli drobnoustrojów oraz
odpływ nadmiaru podłoża, który zawiera produkty
metabolitu, wraz z nadmiarem hodowli.
Hodowle zsynchronizowane
Ich cechą charakterystyczną jest podobny czas
dzielenia się drobnoustrojów.
Hodowlę tą otrzymujemy:
- poprzez przeniesienie bakterii do temp. 4o C, pod
wpływem szoku termicznego bakterie przestają
rosnąć. Przeniesienie bakterii do temp. 37o C
powoduje wzrost bakterii.
- wirowanie
- sączenie bakterii poprzez sączki bakteryjne. Używa
się filtrów membranowych z małymi porami (metoda
selektywna)
Podział drobnoustrojów ze względu na:

Wymagania tlenowe:
- tlenowce- rosną tylko w obecności tlenu
- beztlenowce (bezwzględne)- nie rosną w obecności tlenu: Clostridium
- mikroaerofile (względne beztlenowce)- rosną w warunkach beztlenowych jak i przy
zawartości tlenu 2-8%

Wymagania temperaturowe:
- psychrofile (zimnolubne, rosną w temp. od minusowych do +20oC)
- mezofile (optimum wzrostu w temp. od 30oC do 40oC)- większość drobnoustrojów
występujących w środowisku, mikroorganizmy saprofityczne, mikroorganizmy
chorobotwórcze
- termofile (ciepłolubne, temp. wzrostu 35oC  60oC a nawet 90oC)

Kwasowość:
- alkalifile- rozwijają się w środowisku alkalicznym (pH 8-11)
- neutrofile- rozwijają się w pH 6,5-7
- acidofile- rozwijają się w pH 2-5
Charakterystyczne cechy podłoży
mikrobiologicznych
- odpowiednia zawartość substancji odżywczych
- odpowiednie pH
- klarowność, jednorodność
- jałowość
Podział podłoży
1.Ze względu na konsystencję:
3.Ze względu na ilość i jakość składników
odżywczych:
- stałe (>1% agaru)
- proste dla drobnoustrojów o niskich
- półpłynne (0,5-1%)
wymaganiach odżywczych
- płynne- buliony
- złożone- wzbogacone dla drobnoustrojów
o wysokich wymaganiach odżywczych
2.Ze względu na zawartość substancji:
4.Ze względu na wzrost drobnoustrojów:
- syntetyczne
- wybiórczo-namnażające
- półsyntetyczne
- wybiórczo-różnicujące
- naturalne
- podłoża specjalne
- podłoża transportowe
- podłoża transportowo-namnażające
Identyfikacja drobnoustrojów na podstawie
charakterystycznego wzrostu na podłożach
1.Na podłożach płynnych wzrost związany jest ze sposobem
oddychania bakterii
- typ denny- osad na dnie probówki (beztlenowce-
Clostridium, Saccharomyces cerevisiae)
- typ dyfuzyjny- zmętnienie (Escherichia coli)
- typ powierzchniowy- błonka, nalot, kożuszek (tlenowce)
- typ mieszany- błonka i zmętnienie (mikroaerofile)
- obecność lub brak gazu (rurka Durchama lub bezpośrednie
gazowanie podłoża)
Identyfikacja drobnoustrojów na podstawie
charakterystycznego wzrostu na podłożach
2.Na podłożach stałych (agarowych)- morfologia kolonii
Kształt -okrągły, owalny, promienisty, rozgałęziony, soczewkowata, nitkowata,
koncentryczna
Wielkość- średnica kolonii w mm
Powierzchnia- gładka, pomarszczona, gruboziarnista, matowa, z połyskiem
Typ wzrostu kolonii- powierzchniowy, podpowierzchniowy, wgłębny
Wyniosłość ponad powierzchnię- płaska, stożkowata, lekko wypukła
Kolor kolonii i podłoża
Przejrzystość kolonii i podłoża- nieprzejrzyste, mętne, przejrzyste
Zapach
Struktura i konsystencja kolonii (za pomocą ezy)- mazista, ciągnąca się,
skórzasta, ziarnista, krucha, sucha, śluzowata
Fluorescencja- tak/nie
Typ hemolizy- tak (jaka)/nie
Metody niehodowlane
Szybkie testy diagnostyczne pozwalające sugerować lub ustalić
czynnik etiologiczny w bardzo krótkim czasie (30 min- kilku godzin,
np. preparat Grama, test lateksowy, PCR- kilka godzin).
Wyróżniamy:
1. Bezpośredni preparat mikroskopowy z badanego materiału.
2. Preparat mikroskopowy barwiony
3. Odczyny immunologiczne
4. Metody biologii molekularnej
5. Typowanie bakteriofagami
6. Testy lateksowe
Preparat mikroskopowy
Barwienie bakterii pozwala na obserwację
drobnoustrojów w mikroskopie świetlnym celem
oceny ich wielkości, kształtu, i niektórych cech
morfologicznych.
Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji
ruchliwości,żywotności,sposobu rozmnażania
drobnoustrojów.Małe rozmiary bakterii
pozwalają jedynie na obserwację ich sposobu
poruszania się w takim preparacie.
Preparat mikroskopowy
Ze względu na to,co podlega
barwieniu,wyróżniamy:

Barwienie negatywne-polegające na barwieniu
tła, a bakterie pozostają niezabarwione np.
czerwienią kongo, tuszem chińskim

Barwienie pozytywne-polegające na barwieniu
bakterii, z których przygotowany jest preparat
np. błękitem metylenowym,fuksyną,zielenią
malachitową
Preparat mikroskopowy
Ze względu na ilość barwników zastosowanych
przy barwieniu,wyróżnia się:

Barwienie pozytywne proste z zastosowaniem
tylko jednego barwnika np. błękitu
metylenowego Loefflera

Barwienie pozytywne złożone z
wykorzystaniem kilku barwników np.barwienie
matodą Gramma lub metodą Neissera
Odczyny immunologiczne
Reakcje te oparte są na zdolności łączenia się
przeciwciał ze specyficznym antygenem w
odpowiednim środowisku reakcji.
Wyróżniamy następujące odczyny:

Odczyn precypitacji

Aglutynacja lateksowa

Aglutynacja szkiełkowa

Metody immunofluorescencyjne

Metody immunoenzymatyszne
Odczyny immunologiczne
Odczyn precypitacji- rozpuszczalne antygeny
polipeptydowe lub wielocukrowe uzyskane z tkanek
lub drobnoustrojów na drodze ekstrakcji kwasami,
enzymatycznie lub w podwyższonej temperaturze. Do
ich identyfikacji stosuje się swoiste znane przeciwciała
w obecności elektrolitów. Powstałe kompleksy
antygen-przeciwciało wypadają z roztworu w postaci
osadu (kłaczków).
Zastosowanie - oznaczanie grup serologicznych
paciorkowców hemolizujących
Odczyny immunologiczne
Aglutynacja lateksowa  mikrocząsteczki
lateksu opłaszcza się znanymi przeciwciałami,
które wiążą się ze specyficznymi antygenami, w
efekcie powstają, widoczne gołym okiem,
aglutynaty. Metody te nie wymagają użycia
czystych szczepów bakteryjnych.
Zastosowanie  identyfikacja dwoinek
zapalenia płuc.
Odczyny immunologiczne
Aglutynacja szkiełkowa- identyfikacja
nieznanych szczepów drobnoustrojów przy
zastosowaniu znanych swoistych surowic
odpornościowych .
Zastosowanie- w diagnostyce bakterii z
rodzaju: Salmonella, Schigella, Escherichia
coli, Pseudomonas, Neiseria.
Odczyny immunologiczne
Metoda immunofluorascencji
bezpośredniej
Na utrwalone próbki nakrapia się wzorcowe
przeciwciała wyznakowane fluorochromem. Po
inkubacji preparat umieszcza się w mikroskopie
fluorescencyjnym. Jeśli w badanym materiale
znajdowały się specyficzne dla wyznakowanych
przeciwciał drobnoustroje, w polu widzenia
mikroskopu uwidacznia się świecący kompleks.
Odczyny immunologiczne
Metody immunoenzymatyczne (test Elisa)
W reakcji tej badane antygeny reagują z
przeciwciałami, które związane są z enzymem.
W celu uwidocznienia kompleksu antygen-
przeciwciało dodaje się odpowiedni substrat i
po inkubacji odczytuje się wynik reakcji barwnej
jakościowo lub ilościowo. Nasilenie barwy
zależy od ilości kompleksu antygen-
przeciwciało.
Metody biologi molekularnej
Metoda ta polega na poszukiwaniu kwasów
nukleinowych w materiale klinicznym lub
hodowli. Podstawową techniką wykorzystywaną
w tych badaniach jest PCR.
PCR  łańcuchowa reakcja polimerazy
Jest to reakcja selektywnego powielania
wybranego fragmentu DNA w warunkach in
vitro. Metoda ta pozwala wykryć znikome ilości
DNA w badanej próbce.
Typowanie bakteriofagami
(wirusy bakteryjne)
Metoda ta służy identyfikacji określonych
gatunków wyhodowanych bakterii oraz pozwala
na określenie ich typów fagowych.
Oznaczanie typów fagowych wykorzystywane
jest w dochodzeniu epidemiologicznym, w celu
ustalenia z
ródła zakażenia np. typowanie
bakteriofagowe szczepów Salmonella typhi.
Określenie lekowrożliwości
Antybiogram metodą dyfuzyjno-krążkową lub
seryjnych rozcieńczeń.
Metody te pozwalają na dobór chemoterapeutyku o największym
zakresie działania i największej skuteczności przeciwko
wyizolowanemu drobnoustrojowi.
Dostępne są komercyjne metody oznaczania lekooporności bakterii
wg. Systemu ATB
- ATB -G dla rodziny Enterobacteriaceae
- ATB-STAPH5 dla gronkowców
- ATB-ANA dla bakterii beztlenowych