KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA CI
GA
A PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
l. Wstęp teoretyczny.
W ciągłych hodowlach drobnoustrojów po wstępnym namnożeniu mikroorganizmów
rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli świeżą pożywką z jednoczesnym odbiorem płynu
hodowlanego, przy zachowaniu stałej objętości cieczy w fermentorze.
Ze względu na sposób kontroli i kierowania procesem hodowli ciągłej wyróżniamy dwie główne
metody jej prowadzenia oparte na:
a) zasadzie turbidostatu- ze stałym stężeniem biomasy
b) zasadzie chemostatu- ze stałą szybkością rozcieńczania.
Na rysunku l przedstawiono schemat układu do hodowli ciągłej drobnoustrojów. W reaktorze
tego typu zakłada się idealny stan wymieszania, w wyniku czego skład płynu hodowlanego i
temperatura są w każdym punkcie reaktora identyczne. Na rysunku 2 przedstawiono graficzną
interpretację zależności pomiędzy parametrami pracy fermentora, a więc produktywnością (Dx),
szybkością rozcieńczania (D), stężeniem biomasy (x) i stężeniem substratu (S). Produktywność
jest to masa drobnoustrojów przypadająca na jednostkę objętości i jednostkę czasu [kg/(l* h)].
Stężenie biomasy i substratu jest praktycznie niezmienne w szerokich granicach wartości
szybkości rozcieńczania. Zbliżając się do wartości Dmax układ staje się niestabilny i nawet
niewielkie zmiany wartości szybkości rozcieńczania mogą powodować znaczne zmiany stężenia
biomasy i substratu. Produktywność biomasy osiąga swoje maksimum w zakresie wysokich
wartości D, w granicach których układ nie wykazuje dostatecznej stabilności.
Podstawową różnicą hodowli ciągłej w porównaniu z hodowlą okresową jest brak fazowości
wzrostu. Hodowle ciągłe wykazują wiele zalet w porównaniu z procesami okresowymi:
a) wyeliminowanie zmian warunków hodowli w czasie jej trwania
b) możliwość prowadzenia hodowli w dowolnie długim czasie
c) możliwość regulacji stanu fizjologicznego drobnoustrojów
d) jednorodność składu fizycznego i chemicznego hodowli
e) możliwość automatyzacji
Mimo tych korzyści procesy ciągłe nie są powszechnie wykorzystywane w praktyce
przemysłowej. Związane jest to z następującymi trudnościami:
1
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA CI
GA
A PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
a) możliwością degeneracji szczepów lub opanowania hodowli przez mutanty o gorszych
własnościach technologicznych
b) problemami z utrzymaniem aseptycznych warunków
c) niesprzyjającymi warunkami produkcji niektórych substancji wytwarzanych przez komórki
nie rosnÄ…ce
d) tworzeniem przez drobnoustroje wielokomórkowych agregatów, kłaczków oraz zarastaniem
ścian fermentora i przewodów.
dopływ powietrza odpływ powietrza
pompa pompa
odpływ
dopływ
Rys. 1. Ogólny schemat bioreaktora (chemostat)
Rys. 2. Stężenie substratu (S), biomasa (x) i produktywność (Dx) jako funkcje szybkości rozcieńczenia
2
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA CI
GA
A PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
2. Sprzęt, odczynniki i pożywki.
biofermentor z oprzyrządowaniem, spekol, kuwety plastykowe, autoklaw, probówki do oznaczeń
turbidymetrycznych, probówki miarowe do oznaczeń fenolu, zestaw do sączenia próżniowego,
sączki Co-5, pipety, tryskawka z wodą destylowaną, cylinder miarowy 50 ml, zlewki, wirówka
20 h hodowla Acinetobacter sp. (inokulum),
750 ml + 500 ml + 250 ml pożywki o składzie:
Na2HP04*12H20 4,0 g/l
KH2P04 0,5 g/l
NH4C1 0,5 g/l
MgS04*7H20 0,l g/l
Ekstrakt drożdżowy 0,5 g/l
ustalić pH w granicach 7,3  7,4
woda destylowana
fenol 0,5 M R-34-24/25; S:53-28-45
Zestaw odczynników do oznaczania fenolu
p-nitroanilina 5 mM
R-33-52/53-23/24/25
S:53-28-45-61-36/37
NaNO2 2%
Na2CO3 10%
NaOH 10%
3. Wykonanie.
Zmontować bioreaktor wraz z termometrem, wlać 750 ml pożywki i sterylizować w
autoklawie w temp. 121°C przez 15 minut. Po sterylizacji i ostygniÄ™ciu bioreaktora zamontować
bioreaktor w statywie fermentora. Podłączyć mieszadło, termometr, pH-metr płaszcz grzejny,
pompę dozującą pożywkę oraz kompresor dostarczający powietrza do napowietrzania
wgłębnego. Przygotować odbiór płynu hodowlanego do wyjałowionej kolby poprzez układ
odprowadzajÄ…cy. Za pomocÄ… termostatu ustalić temperaturÄ™ w bioreaktorze na poziomie 30°C.
Rozpocząć hodowlę poprzez zaszczepienie położą 250 ml 20 h hodowli E. coli na tym samym
3
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA CI
GA
A PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
podłożu, wlewając inokulum przez płomień palnika oraz dodając fenol tak, aby w fermentorze
stężenie jego wynosiło 4 mM.
Parametry procesu hodowlanego: przepływ powietrza początkowy 1,0 l/min zwiększać
stopniowo do 1,5 l/min, obroty mieszadła ustalić na 250 obr/ min.
Po zaszczepieniu pożywki pobrać 30 ml podłoża do oznaczenia zmętnienia metodą
turbidymetryczną. Oznaczenie to powtarzać co l godzinę w trakcie prowadzenia procesu,
sporządzając wykres zmętnienia w funkcji czasu. Po rozpoczęciu fazy logarytmicznego wzrostu
(wyznaczyć na podstawie przyrostu zmętnienia) pobrać 20 ml podłoża do oznaczenia suchej
masy metodÄ… filtracji na sÄ…czkach membranowych. Po godzinie od poprzedniego oznaczenia
ponownie oznaczyć stężenie biomasy. Na postawie przyrostu biomasy obliczyć maksymalną
właściwą szybkość wzrostu szybkość rozcieńczania D (przyjąć wartość D na poziomie 50%
max
) oraz natężenie przepływu pożywki F. Po osiągnięciu wczesnej fazy stacjonarnej rozpocząć
max
dawkowanie pożywki z obliczonym uprzednio natężeniem przepływu F. Oznaczyć stężenie
fenolu w odpływie i w pożywce oraz suchą masę w odpływie. Na tej podstawie obliczyć
końcową wydajność uzyskanej biomasy bakterii.
4. Obliczenia i opracowanie wyników.
Wzrost nieograniczony drobnoustrojów przebiega zgodnie z kinetyką procesów auto-
katalitycznych (reakcja I rzędu), w których szybkość jest wprost proporcjonalna do stężenia
autokatalizatora. W hodowli autokatalizatorem są komórki drobnoustrojów (o łącznej masie x1),
można więc napisać:
x/ t = * X1, stąd po przekształceniu = (l/X1) * x/ t, a także:
x/ t =(X2-X1) / (t2 - t1)
gdzie:
"x/"t - szybkość wzrostu, kg /h
µ - wÅ‚aÅ›ciwa szybkość wzrostu, 1 /h
x1  ilość biomasy w bioreaktorze w czasie t1, kg
x2  ilość biomasy w bioreaktorze w czasie t2, kg
t1 - czas pierwszego pomiaru biomasy, h
t2 - czas drugiego pomiaru biomasy, h
4
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA CI
GA
A PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
W chemostacie wielkością stałą jest szybkość rozcieńczania D, czyli stosunek wartości
objętościowego natężenia przepływu pożywki do objętości pożywki w fermentorze.
D = F / V, stąd po przekształceniu F = D * V
gdzie:
F - objętościowe natężenie przepływu pożywki, dm3/h
V - objętość pożywki w fermentorze, dm3
D - szybkość rozcieńczania, l/h
Ponieważ założono D na poziomie 50% więc:
F=0,5 * * V
max
Wartość natężenia przepływu pożywki wyliczoną z powyższego wzoru należy ustawić na
pompie dozującej pożywkę do fermentora. W trakcie procesu ciągłego w fermentorze wartością
stałą jest także współczynnik wydajności biomasy Y, który wiąże szybkość wzrostu z szybkością
zużycia substratu. Opisuje on więc, jaką biomasę można otrzymać po dostarczeniu do fermentora
jednostkowej masy substratu. W praktyce współczynnik ten jest mniejszy od l, ponieważ substrat
zużywany jest nie tylko do produkcji biomasy, ale także spalany w celu dostarczenia energii.
Oblicza siÄ™ go ze wzoru;
Y = - x / S = - (x2  x1) / (S2  S1)
gdzie:
Y - wydajność biomasy
"x -ilość biomasy powstałej w procesie, kg
"S - ilość substratu zużytego w procesie, kg
x1 - ilość biomasy w pożywce, kg
x2 - ilość biomasy w odpływie, kg
S1 - ilość substratu w pożywce, kg
S2 - ilość substratu w odpływie, kg
5
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA CI
GA
A PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
Oznaczanie stężenia fenolu metodą kolorymetryczną
Patrz: Ćwiczenie HODOWLA PERIODYCZNA DROBNOUSTROJÓW
Oznaczanie stężenia biomasy metodą filtracji
Przesączyć 20 ml zawiesiny drobnoustrojów przez uprzednio wysuszony do stałej masy
(s.m.) i zważony filtr membranowy Co-5. Stosować urządzenie do filtracji próżniowej. Filtr z
osadem suszyć w temp. 105°C do staÅ‚ej masy przez okoÅ‚o 1 godziny i ponownie zważyć.
Stężenie biomasy w mg s.m./l obliczyć ze wzoru:
X= (a-b) * 1000 / V
gdzie:
a - masa filtra z osadem, mg
b - masa filtra, mg
V - objętość próbki użytej do oznaczenia, ml
X - stężenie biomasy, mg s.m./l
Oznaczanie zmętnienia metodą turbidymetryczną
Pobrać 30 ml hodowli do kuwety. Turbidymetr wykalibrować według instrukcji i
następnie dokonać pomiaru. Sporządzić wykres zależności zmętnienia w funkcji czasu.
Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przy = 600 nm
Patrz: Ćwiczenie HODOWLA PERIODYCZNA DROBNOUSTROJÓW
6
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/