KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA PERIODYCZNA PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
l. Wstęp teoretyczny.
Wzrost drobnoustrojów to przyrost ich objętości, masy, a także podział komórek. Jest on
uwarunkowany syntezą materiału komórkowego (białka, kwasy nukleinowe, nukleotydy),
tworzeniem nowych organelli komórkowych a także dobudowywaniem nowych struktur do już
istniejących (ściana komórkowa, błona cytoplazmatyczna). Tempo wzrostu drobnoustrojów jest
uzależnione od składu podłoża hodowlanego oraz od odczynników fizykochemicznych, takich
jak temperatura, pH, potencjał redox. Maksymalny wzrost można osiągnąć tylko wówczas, gdy
składniki podłoża znajdują się w wystarczających ilościach, gdy nie zachodzi limitowanie
wzrostu przez któryś ze składników oraz gdy zapewnione są optymalne warunki pH, temperatury
itp. Mówimy wtedy o warunkach wzrostu ,,nieorganicznego . W hodowli periodycznej
(okresowej) warunki takie mają miejsce tylko w początkowym okresie wzrostu. W następnych
okresach następuje zmniejszenie stężenia składników odżywczych oraz nagromadzenie
produktów metabolizmu tj. kwasów organicznych czy alkoholi, co wpływa na wzrost
drobnoustrojów.
W warunkach hodowli okresowej, gdzie tylko w poczÄ…tkowym okresie ma miejsce wzrost
nieograniczony, wyróżnić możemy charakterystyczne fazy wzrostu: fazę przygotowawczą (lag-
faza), fazę logarytmicznego wzrostu (log-faza), fazę stacjonarną (równowagi) i fazę zamierania
hodowli.
W warunkach wzrostu nieograniczonego, a więc w pierwszej fazie hodowli okresowej,
drobnoustroje dzielą się z jednakową szybkością. Liczba ich wzrasta z postępem
geometrycznym: 20, 21, 22, 23.. 2n. Jeśli w jednostce objętości hodowli na początku znajdowało
się N0 komórek, to po n podziałach będzie ich:
N = N0 × 2n
gdzie:
N0 = ilość początkowa komórek (CFU) w godzinie t = 0 (t0)
N = ilość komórek (CFU) po czasie t1, h
Logarytmując to równanie otrzymamy:
Log N = log N0 + n log 2
Wyliczając z tego równania liczbę podziałów n, otrzymujemy:
1
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA PERIODYCZNA PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
log N  log N0
n =
log 2
Wprowadzając pojęcie częstości podziałów v, czyli liczbę podziałów komórek w ciągu czasu t,
możemy zapisać, że:
n log N  log N0
v =
t log 2 (t  t0)
gdzie:
t0 - czas w godzinie t = 0, h
t1  czas kolejnego pomiaru, h
Czas niezbędny dla podziału komórki nazywamy wiekiem osobniczym g.
t 1
g = =
n v
2. Sprzęt, odczynniki i pożywki:
Pożywka Kojim a:
Na2HPO4 x 12H20 4,0 g/l
KH2PO4 0,5 g/l
NH4C1 0,5 g/l
MgSO4 x 7H20 0,l g/l
Ekstrakt drożdżowy 0,5 g/l
ustalić pH w granicach 7,3  7,4
woda destylowana
fenol 0,5 M R-34-24/25; S:53-28-45
Zestaw odczynników do oznaczania fenolu
p-nitroanilina R-33-52/53-23/24/25; S:53-28-45-61-36/37 5 mM
NaNO2 2%
Na2CO3 10%
NaOH 10%
2
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA PERIODYCZNA PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
Roztwór mikroelementów TMS (0,1 ml TMS/100 ml pożywki) o składzie: FeSO4 x 7H2O 3,82 g;
CoSO4 x 7H2O 295 mg; MnSO4 x H2O 82 mg; ZnSO4 x 7H2O 141mg; H3BO3 6 mg; Na2MoO4 x
2H2O 40 mg; NiSO4 x 7H2O 82 mg; CuSO4 x 5H2O 2,9 mg; Al2(SO4)3 x 18H2O 148 mg;
Na2WO4 x 2H2O 6 mg rozpuszczonych w 10 ml 32% HCl i uzupełnionych wodą destylowaną do
objętości 1000 ml.
Kolby hodowlane o objętości 500 ml (7 sztuk), probówki z solą fizjologiczną, probówki miarowe
do oznaczania fenolu, probówki typu Eppendorf, tipsy o objÄ™toÅ›ci 200 µl i 1000 µl, pÅ‚ytki z
agarem odżywczym (30 sztuk), szklana głaszczka, kuwety plastikowe, Spekol, wirówka
3. Wykonanie.
Celem ćwiczenia jest sprawdzenie wpływu stężenia fenolu na szybkość rozkładu tego substratu
przez szczep Acinetobacter sp. W tym celu należy założyć 5 układów hodowlanych o objętości
250 ml, w dwóch powtórzeniach, zgodnie z Tabelą I:
UWAGA! Objętości podane w dwóch ostatnich kolumnach mogą się różnić, w zależności od gęstości wyjściowej
hodowli
Tabela I
Objętość pożywki
Objętość 0,4 M
Kojim a użyta do
Oznaczenie Stężenie r-ru Objętość Objętość Objętość hodowli
uzupełnienia
kolby fenolu, TMS, ml pożywki szczepu
wzorcowego
objętości hodowli
mM Kojim a, ml Acinetobacter sp.,
fenolu, ml
do 250 ml,
ml
ml
Kolba A1 1 0,625 0,25 200 40 9,25
Kolba A1 1 0,625 0,25 200 40 9,25
Kolba B1 2 1,25 0,25 200 40 8,75
Kolba B2 2 1,25 0,25 200 40 8,75
Kolba C1 3 1,875 0,25 200 40 8,25
40
Kolba C2 3 1,875 0,25 200 8,25
Kolba D1 4 2,5 0,25 200 40 7,75
Kolba D2 4 2,5 0,25 200 40 7,75
Kolba E1 5 3,125 0,25 200 40 7,25
Kolba E2 5 3,125 0,25 200 40 7,25
3
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA PERIODYCZNA PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
W każdej kolbie określić gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy  = 600 nm oraz
wyjściowe stężenie fenolu poprzez pomiar metodą z p-nitroaniliną. Wyniki umieścić w Tabeli II.
Kolby inkubować w temperaturze 30°C w warunkach wytrzÄ…sania (130 rpm).
UWAGA! Zachować sterylne warunki w trakcie pracy!!!
W odstępach jednogodzinnych określać gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy
 = 600 nm i metodą płytkową w kolbie oznaczonej D1 oraz sprawdzać ubytek fenolu poprzez
oznaczanie stężenia fenolu metodą z p-nitroaniliną. Wyniki umieszczać w Tabeli II. Na
podstawie otrzymanych wyników narysować wykresy ubytku fenolu oraz przyrostu liczby
komórek w funkcji czasu w hodowlach szczepu Acinetobacter sp. dla każdego z 5 układów
hodowlanych.
4. Obliczenia i opracowanie wyników:
Oznaczanie fenolu metodÄ… kolorymetrycznÄ… z p-nitroanilinÄ…
1. Pobrać sterylnie 1 ml hodowli i umieścić w probówce typu Eppendorf. Zawartość probówki
wirować przez 5 min przy 12000 rpm w temperaturze 4°C.
2. Do szklanej probówki miarowej wprowadzić 1 ml odwirowanej hodowli (supernatant) albo
jej odpowiednie rozcieńczenie, tj. na przykład rozcieńczenie 10-krotne uzyskuje się poprzez
pobranie 100 µl supernatantu i 900 µl wody destylowanej.
3. Dodać 4 ml wody destylowanej.
4. Wprowadzić 1 ml zdwuazowanej p-nitroaniliny (otrzymanej poprzez odbarwienie żółtego
roztworu p-nitroaniliny z użyciem 2% NaNO2)
5. Dodać 0,5 ml 2% Na2CO3.
6. Wprowadzić 1 ml 10% NaOH w celu utrwalenia barwy.
7. Uzupełnić probówkę do objętości 10 ml poprzez wprowadzenie 2,5 ml wody destylowanej.
8. Jednocześnie przygotować próbę ślepą w identyczny sposób (od punktu 2), zastępując
supernatant wodÄ… destylowanÄ….
9. Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przy  = 550 nm względem próby ślepej.
10. Uzyskane wyniki absorbancji umieścić w Tabeli II i III.
4
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/
KATEDRA BIOCHEMII
HODOWLA PERIODYCZNA PODSTAWY
Wydział Biologii i Ochrony
DROBNOUSTROJÓW BIOTECHNOLOGII
Åšrodowiska
11. Do przeliczeń stężeń fenolu stosować równanie krzywej kalibracyjnej A = b * cfenolu, gdzie A
to absorbancja przy  = 550 nm, cfenolu to stężenie fenolu wyrażone w mM, b = współczynnik
krzywej kalibracyjnej obliczony metodą najmniejszych kwadratów (patrz: Aneks Tabela IV).
Wyniki umieścić w Tabeli II.
Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przy = 600 nm
W tym celu należy pobrać po 1 ml z każdego układu hodowlanego i zmierzyć absorbancję
przy długości fali  = 600 nm z użyciem spektrofotometru HELIOS wobec próby ślepej, która
stanowi pożywka mineralna Kojim a nie zaszczepiona komórkami bakterii. Pomiaru dokonywać
w odstępach godzinnych, a uzyskane wyniki zebrać w Tabeli II.
Wyznaczanie wzrostu bakterii metodą płytkową
Z jednego układu hodowlanego oznaczonego jako kolba D1 pobrać sterylnie 1 ml
zawiesiny bakteryjnej i wprowadzić do probówki z 9 ml soli fizjologicznej i dokładnie
wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Przygotować szereg rozcieńczeń w soli fizjologicznej zgodnie z
Tabelą V. Z odpowiednich rozcieńczeń (Tabela V) wysiać po 50 źl zawiesiny bakterii na płytki z
agarem odżywczym i inkubować 24- 48 godzin w temperaturze 30ºC. Po tym czasie policzyć
wyrosłe kolonie przyjmując, że jedna kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej (CFU 
ang. Colony Forming Unit).
Ilość bakterii w 1 ml badanego materiału obliczyć ze wzoru:
X = a × b × 20
gdzie:
a  ilość kolonii
b  rozcieńczenie
X  ilość bakterii w 1 ml zawiesiny
Wyniki przeliczyć w skali logarytmicznej i umieścić w Tabeli V. W oparciu o uzyskane
wyniki wyliczyć częstość pokoleń ( ) oraz wiek osobniczy (g).
5
PDF stworzony przez wersjÄ™ demonstracyjnÄ… pdfFactory www.pdffactory.pl/