A-PDF Merger DEMO : Purchase from www.A-PDF.com to remove the watermark
A-PDF Merger DEMO : Purchase from www.A-PDF.com to remove the watermark
Metody i techniki
stosowane w
biologii
molekularnej
Katarzyna Bogacz
Ewa Grędowska
Karolina Osińska
Justyna Stolarczuk
Józef Lisowski
PCR
PCR
PCR
PCR
Polimerase Chain
Polimerase Chain
Polimerase Chain
Polimerase Chain
Reaction
Reaction
Reaction
Reaction
Umo\
liwia powielanie określonego fragmentu DNA
Dzięki tej metodzie otrzymujemy szybko du\
e ilości
powielonego DNA
Zasady PCR:
Denaturacja  rozdzielenia nici DNA (94 st. C)
Denaturacja  rozdzielenia nici DNA (94 st. C)
Przyłączenie starterów do komplementarnych
Przyłączenie starterów do komplementarnych
miejsc na matrycy (~50 st. C)
miejsc na matrycy (~50 st. C)
Wydłu\
anie nici potomnych od końca 3 startera
Wydłu\
anie nici potomnych od końca 3 startera
Kolejne cykle powtarzane są wg. tego samego
schematu. Zwykle zachodzi ok. 35 cykli, czyli
ilość otrzymanych cząsteczek wynosi 235
Termocyklery
Zastosowanie:
Sekwencjonowanie DNA
Mapowanie genów
Filogenetyka molekularna
Medycyna sądowa
Diagnostyka patogenów
Diagnostyka chorób genetycznych
Enzymy
restrykcyjne
Enzymy uzyskane z bakterii
Rozpoznają i przecinają sekwencje ok. 4  8
nukleotydów
Zwykle są to nici palindromowe (obydwie czytane od 5
do 3 są takie same)
W laboratoriach wykorzystujemy ok. 300 enzymów
Wykorzystanie enzymów restrykcyjnych jest podstawą
manipulacji cząsteczkami DNA
Przykłady enzymów
Rozpoznawana
Rozpoznawana
Enzym Pochodzenie Cięcie
Enzym Pochodzenie Cięcie
sekwencja
sekwencja
5 GAATTC
5'- - -G AATTC- - -3'
EcoRI Escherichia coli
3'- - -CTTAA G- - -5'
3 CTTAAG
5 GATC
Staphylococcus 5'- - - GATC- - -3'
Sau3A
aureus 3'- - -CTAG - - -5'
3 CTAG
5'- - -A AGCTT- - -3'
5 AAGCTT
Haemophilus
HindIII
influenzae
3 TTCGAA 3'- - -TTCGA A- - -5'
5 TCGA
Thermus 5 - - -T CGA- - -3'
TaqI
aquaticus 3'- - -AGC T- - -5'
3 AGCT
E
E
E
E
l
l
l
l
e
e
e
e
k
k
k
k
t
t
t
t
r
r
r
r
o
o
o
o
f
f
f
f
o
o
o
o
r
r
r
r
e
e
e
e
z
z
z
z
a
a
a
a
-
t
o
t
e
c
h
n
i
k
a
u
m
o
\

f
l
r
i
a
w
g
i
m
a
j
e
ą
n
c
t
a
ó
r
w
o
z
D
d
N
z
A
i
e
l
o
e
n
r
i
ó
e
\

n
e
j
w
i
e
l
k
o
ś
c
i
p
r
z
y
u
\

y
c
e
i
l
u
e
k
p
t
o
r
l
y
a
c
z
n
e
g
o
.
Podczas elektroforezy stosowane są dwa
rodzaje \
eli:
agarozowe
poliakrylamidowe (stosuje się, gdy rozdzielane
fragmenty ró\
nią się długością kilku lub nawet jednego
nukleotydu)
W czasie elektroforezy cząsteczki DNA przemieszczają
się w \
elu pod wpływem przyło\
onego napięcia
elektrycznego. Dodatnio naładowane cząsteczki
wędrują w kierunku elektrody ujemnej. śel jest siecią
porów, przez które przeciskają się badane cząsteczki.
Im cząsteczka krótsza, tym szybciej przemieszcza się,
a w efekcie przebywa najdłu\
szy odcinek. Cząsteczki
tej samej długości zajmują to samo miejsce w \
elu,
tworząc prą\
ek, który mo\
emy uwidocznić pod
wpływem promieni UV stosując związek fluoryzujący,
wnikający pomiędzy pary zasad DNA.
Jest to technika analizy cząsteczek Dna. Umo\
liwia ona
identyfikację określonej sekwencji DNA spośród tysięcy innych
cząsteczek DNA.
Etap pierwszy - pocięcie genomowego DNA przy udziale enzymów
restrykcyjnych.
Etap drugi - rozdzielanie uzyskanych fragmentów (w zale\
ności od wielkości)
w \
elu agarozowym.
Etap trzeci  przeprowadzenie denaturacji w \
elu poprzez zanurzenie go w
roztworze alkalicznym, w celu uzyskania jednoniciowych fragmentów (zdolnych
do póz
niejszej hybrydyzacji)
Etap czwarty  przeniesienie fragmentów DNA na wią\
ący je filtr
nitrocelulozowy lub nylonowy, a następnie umieszczenie go w biorze
zawierającym wyznakowaną radioaktywnie sondę. Hybrydyzuje ona z
komplementarną sekwencją.
Etap piąty  usunięcie nadmiaru sondy, po czym metodą autoradiograficzną
wykrywa się związane z sondą cząsteczki NA.
W podobny sposób mo\
na badać cząsteczki RNA. Metoda ta nazywana
jest Northern blot.
RFLP (ang. Restriction Fragments
RFLP
Length Polymorphism- polimorfizm
polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych.)
długości fragmentów restrykcyjnych
W metodzie tej wykorzystujemy enzymy
restrykcyjne.
Je\
eli w obrębie rozpoznawanej przez enzym
sekwencji wystąpi mutacja punktowa miejsce
to nie będzie rozpoznawane przez enzym i nie
nastąpi przecięcie.
RFLP jest wykorzystywany w technice, w której
organizmy mogą być ró\
nicowane poprzez analizę
wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA.
Jest to metoda, która pozwala na wykazanie
powiązań rodzinnych poprzez porównywanie
charakterystycznych wzorów polimorficznych, które
są otrzymywane, gdy określone regiony łańcucha
DNA są powielane i pocięte przez określone enzymy
restrykcyjne.
Porównanie fragmentów restrykcyjnych matki,
dziecka i domniemanego ojca pozwala tak\
e na
potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa.
Przy pomocy tej metody mo\
na odró\
nić allel
prawidłowy od zmutowanego, np. w anemii
sierpowatej.
Anemia sierpowata spowodowana jest
mutacją punktową polegającą na zmianie
adeniny w tyminę. Zmiana ta zachodzi w
obrębie sekwencji rozpoznawanej przez
enzym restrykcyjny o nazwie MST II. W
prawidłowej, normalnej sekwencji występują
trzy miejsca cięcia, mutacja natomiast
powoduje utratę jednego miejsca cięcia.
ASO (ang. Allele Specific Oligonucleotide
ASO
Hybrydization.)
Metoda ta pozwala na wykrycie nawet niewielkich
ró\
nic w badanych sekwencjach. Umo\
liwia
wykrycie pojedynczej mutacji.
Sekwencja DNA, w której zamierzamy badać
określoną mutację, amplifikowana jest przy
pomocy metody PCR. Następnie wykonuje się
hybrydyzację badanego odcinka DNA z krótkimi,
najczęściej sztucznie zsyntetyzowanymi sondami
DNA, które są komplementarne do sekwencji
prawidłowej i zmutowanej. Zmiana nawet
pojedynczego nukleotydu powoduje brak
hybrydyzacji.
Dzięki tej metodzie mo\
na określić genotyp
pacjenta.
U heterozygoty hybrydyzacja nastąpi z obiema
sondami.