Metody stosowane w biologii molekularnej
1. Izolacja DNA: polega na oddzieleniu DNA od innych struktur
komórkowych, a także cząsteczek RNA i białek związanych z DNA.
W zależności od rodzaju materiału, z którego izoluje się materiał
genetyczny, i jego przeznaczenia stosuje się różne metody izolacji.
Materiałem biologicznym może być
" krew obwodowa
" plemniki (nasienie)
" wymazy komórkowe
" mocz
" mleko
" plwocina
" wycinki tkanek
" płyn mózgowo rdzeniowy
" hodowle bakteryjne i tkankowe
metody izolacji DNA dzielimy na dwie główne grupy
" izolacja klasyczna z użyciem fenolu i chloroformu
" stosowanie gotowych zestawów do szybkiej i uproszczonej
izolacji DNA
Każda procedura izolacji DNA powinna się zakończyć ocenją jego
ilości i jakości przy pomocy pomiaru spektrofotometrycznego przy
długości fali 260-280nm. Zawartość wyizolowanego DNA
w roztworze podaje się w źg/ml. Wyliczana jest ona ze wzoru
Z=A260 x 50 x R
Gdzie:
50- stały współczynnik
R- rozcieńczenie
Czystość izolowanego DNA podawana jest w % wyliczanego
ze stosunku absorbancji 260/280nm (1,8 = 100% czystości DNA).
o
Izolowany DNA przechowuje siÄ™ do miesiÄ…ca w temp. 4-8 C lub
zamrożony w -20 oC do usranej śmierci.
2. metoda PCR: polega na powieleniu In vitro fragmentu
genomowego DNA wielkości od kilkudziesięciu do kilkudziesięciu
tysięcy par zasad. Początkowo w procesie wykorzystywano
termolabilną polimerazę od E. Coli, ale wymagało to dodawania
kolejnej jej porcji po każdej denaturacji. Przełomem w tej technice
było wprowadzenie termostabilnej Polimerazy Taq pochodzącej od
bakterii termofilnych. ReakcjÄ™ przeprowadza siÄ™ w sterowanym
elektronicznie bloku grzejnym (termocykler), a produkty ocenia
za pomocą elektroforezy. Reakcja następuje w trzech etapach:
" denaturacja dwuniciowego DNA przeprowadzana przez
ogrzanie do 90-95 oC na 0.5- 2 min.
" przyłączanie starterów; oligonukleotydów hybrydyzujących
z 3 końcem każdej nici w temp 50-60 oC w ciągu 30-60 s.
" polimeryzacja DNA przeprowadzana w 72 oC
pod koniec pierwszego cyklu otrzymujemy dwie kopie DNA
z regionem, który chcieliśmy zwielokrotnić. Nastepnie proces się
powtarza. Liczba kopii DNA rośnie wykładniczo. Zwykle
przeprowadza siÄ™ 20 do 40 cykli. Metoda ta pozwala na uzyskanie
dużej ilości DNA nawet z bardzo małej próbki (1 źg) co ma istotne
znaczenie na przykład w kryminalistyce (starczy jeden włos
z cebulkÄ…). TechnikÄ™ PCR stosuje siÄ™ do wykrywania nosicielstwa
zmutowanego genu w rodzinach obciążonych ryzykiem
np. mukowiscydoza czy fenyloketonuria, badań na embrionie
w zapłodnieniu In vitro, antropologii i diagnostyce chorób
zakaz
nych.
Innym rodzajem metody jest PCR  multipleks , w której stosuje się
kilka starterow dla różnych genów. Natomiast w reakcji odwrotnej
trankryptazy-PCR (RT-PCR) proces poprzedzony jest przepisaniem
informacji z mRNA na komplementarny cDNA w obecności startera,
najczęściej uniwersalnego oligo dT. Produkty PCR są najczęściej
badane pod kÄ…tem mutacji drogÄ… sekwencjonowania lub metodami
pośrednimi (SSCP)
3. SSCP: metoda, wykorzystująca unikalną właściwość kwasów
nukleinowych, polegajÄ…cÄ… na tworzeniu przez pojedyncze nici DNA
konformerów, których kształt zależy od sekwencji DNA. zmiany
struktury DNA takie jak mutacjie punktowe powodujÄ… zmianÄ™
konformacji pojedynczej nici DNA, co wykrywa siÄ™ przy pomocy
elektroforezy.
4. RFLP jest to polimorfizm fragmentów DNA powstających wskutek
działania endonukleaz restrykcyjnych na nić DNA. Może on być
następstwem tranzycji, transwersji, insercji lub delecji,
prowadzÄ…cych do zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy
restrykcyjne. Metoda ta pozwala ma mapowanie genów. Dzięki
analizie polimorfizmu odkryto między innymi lokalizację na
chromosomei X genu odpowiedzialnego za dystrofię mięśni
Duchenne a.
5. Fingerprint: polega na badaniu polimorfizmu sekwencji
mikrosatelitarnych (STRP) i minisatelitarnych (VNTR). Zmienność
sekwencji VNTR polega na różnej liczbie powtórzeń motywu w
danym locus. Analiza kilku loci danego osobnika daje
charakterystyczny dla niego wzór fragmentów DNA (profil), tzw.
Genetyczny odcisk palca. Obraz ten jest unikatowy niczym linie
papilarne. Im bliżej dwie osoby są spokrewnione tym bardziej
podobny jest ich profil DNA. Badania profili DNA obejmujÄ…
najczęściej analizę markerów minisatelitarnych, nie tylko pod kątem
liczby kopii, ale także nieznaczne różnice sekwencji nukleotydów.
Sekwencje są wykrywane najczęściej metodą Southerna po
uprzednim namnożeniu materiału metodą PCR. Metodę tą szeroko
stosuje się w kryminalistyce, a także w badanu pokrewieństwa i
ustalaniu ojcostwa.
6. Metoda Southerna: opisana po raz pierwszy w 1975r. . pozwala
identyfikować fragmenty restrykcyjne przy użyciu elektroforezy
żelowej i sond molekularnych. Mieszaninę fragmentów
restrykcyjnych rozdziela się na żelu agarozowym, denaturuje celem
podzielenia na fragmenty jednoniciowe i przenosi na filtr
nitrocelulozowy. Jednoniciowy DNA poddaje siÄ™ hybrydyzacji ze
specyficznÄ… sondÄ… DNA lub RNA, znakowanÄ… radioizotopem (32P).
metodą autoradiograficzną można wykryć fragmenty DNA
komplementarne do znakowanej sondy. Podobnie identyfikować
można cząsteczki RNA lub białka poprzez badanie wiązanai
znakowanych przeciwciał przeciw poszukiwanym grupom
antygenów.
7. Sekwencjonowanie DNA: metoda polegajÄ…ca na ustaleniu rodzaju i
kolejności nukleotydów w DNA, która przeprowadza się przy użyciu
specjalnych aparatów. stosuje się następujące metody
sekwencjonowania: Maxama, Gilberta i enzymatycznÄ… Sangera.
Metody Maxima i Gilberta polegajÄ… na przeprowadzeniu 4 reakcji
chemicznych w odrębnych mieszaninach, w wynikó których
cząsteczka DNA przecinana jest w miejscu występowania jednej z 4
zasad, zależnie od użytego odczynnika. produkty tych reakcji,
różniące się długością, są następnie rozdzielane przez elektroforezę
na żelu. Obecnie częściej stosuje się metodę Sangera. Polega ona na
enzymatycznym wydłużaniu nowych łańcuchów na matrycy
badanego DNA. PoczÄ…wszy od wyznakowanego radioizotopowo
startera. Reakcję przeprowadza się w czterech odrębnych
mieszaninach zawierających niezbędne substraty. Reakcję
zatrzymuje siÄ™ po pewnym czasie przez dodanie pochodnej
odpowiedniego dideoksyrybonukleotydu w małym stężeniu.
Dideoksy-NTP terminuje wydłużanie łańcucha w miejscu włączenia,
gdyż brak grupy OH przy 3 węglu uniemożliwie utworzenie
kolejnego wiązania. Powstaje mieszanina fragmentów DNA różnej
długości, które można analizować drogą elektroforezy i
autoradiograficznie. Elektroforeza porządkuje elementy według
wielkości. Rezultatem metod jest seria prążków w żelu, z których
można bezpośrednio odczytać sekwencje DNA.
8. Metoda ASO: wykorzystuje się w niej dwa różne oligonukleotydu,
jeden komplementarny do sekwencji prawidłowego genu, drugi
komplementarny do zmutowanego. W odpowiednich warunkach
sondy ASO hybrydyzujÄ… tylko z komplementarnÄ… sekwencjÄ… DNA.
Wykorzystuje się ją do badań przesiewowych anemii sierpowatej. W
badaniach wykorzystuje się krwinki białe; poddaje się je ogrzaniu aż
do denaturacji DNA, nastÄ™pnie namnaża region ²-globiny przy
pomocy PCR. Namnożony DNA nanosi się na filtry połączone z
odpowiednimi oligonukleotydami. Po uwidocznieniu prązków
genotyp odczytać można bezpośrednio z filtrów, gdyż tam, gdzie
nastÄ…pi hybrydyzacja oligonukleotydu pojawi siÄ™ zaciemnienie filtra.