Skrypt do ćwiczeń
Biologia Molekularna Roślin
Pracownia Biologii Molekularnej Roślin
UW/IBB PAN
Warszawa, 2002
Spis treści
Komputerowa analiza sekwencji........................& & & & & & & & ..& ..& .6
Izolacja plazmidowego DNA z bakterii. & & & & & & & & & & & ...& & .6
Enzymy restrykcyjne. Mapy restrykcyjne& & & & & & & & & ...& ..& .& ..8
Izolacja DNA z żelu agarozowego& & & & & & & & & & & & & .& .& & .9
Ligacja DNA& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & .& & & 10
Transformacja roślin& & & & & & & & & & & & & & & & & & ..& ..& & 11
Otrzymywanie DNA z roślin& & & & & & & & & & & & & & & .& ..& ....12
Amplifikacja fragmentu DNA metodÄ… PCR& & & & & & & & & & ..& & 13
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna& & & ...& & & .14
Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS& ..& .15
Western& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ..& ..17
Detekcja GUSa& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ..& ..18
2
WPROWADZENIE
Tegoroczne ćwiczenia pomyślane są jako całościowy eksperyment. Mamy nadzieje że taki układ ćwi-
czeń pozwoli wam lepiej poznać praktyczne zastosowania omawianych technik biologii molekularnej.
Ćwiczenia oparte będą na analizie genu AtSWI3B (At2G33610) Jest to jedno z białek którego bada-
niem zajmuje się nasza pracownia. Białko to jest składnikiem chromatyny, a jego funkcja nie jest do
końca poznana. Mutacje w genie kodującym to białko są letalne w Arabidopsis.
Większość proponowanych przez nas w tym roku ćwiczeń da się wpisać w schemat eksperymentu
majÄ…cego na celu analizÄ™ promotora genu AtSWI3B przy zastosowaniu genu reporterowego GUS (patrz
schemat 1). Eksperyment taki pozwala poznać wzór ekspresji badanego genu, to znaczy zobaczyć w
jakich częściach rośliny nasze białko występuje. Informacja taka jest bardzo istotna dla planowania dal-
szych eksperymentów. Wynik takiego eksperymentu często pozwala postawić hipotezę na temat funkcji
badanego białka. Na przykład jeżeli nasze białko pojawia się dopiero w starzejących roślinach to mo-
żemy wnioskować, że odpowiada ono za kontrole starzenia roślin.
Podobne wyniki można także uzyskać stosując inne metody, jak nothern czy ilościowy RT-PCR.
Każda z tych metod ma swoje wady i zalety. Analiza za pomocą genu reporterowego GUS ma następu-
jÄ…ce zalety:
" jest stosunkowo prosta,
" jest bardzo czuła,
" pozwala jednocześnie analizować ekspresję danego genu zarówno na poziomie całej ro-
śliny jak i tkankowym,
" pozwala na łatwą analizę ekspresji w różnych warunkach fiziologicznych.
Główną wadą tej metody jest to że analizujemy najczęściej sam promotor bez enhancera, 3 UTRa i
innych elementów regulatorowych np. położonych w intronach.
Eksperyment nasz można podzielić na kilka etapów przedstawionych na schemacie 1.
Na pierwszych ćwiczeniach spróbujemy zidentyfikować in silico promotor genu AtSWI3B i zapro-
jektować jego przeklonowanie z plazmidu pAtSWI3B do plazmidu pCAM1381Z. W celu uzyskania
plazmidu pAtSWI3B::GUS. W dalszej części ćwiczenia zajmiemy się trochę samym genem AtSWI3B.
Poszukamy znanych homologów z innych organizmów  być może o którymś wiadomo coś więcej.
Spróbujemy także scharakteryzować domeny tego białka. Zrobimy analizę filogenetyczną rodziny
białek typu SWI3 z Arabidopsis thaliana.
Na drugich ćwiczeniach wyizolujemy z bakterii plazmid pAtSWI3B niosący sklonowany promotor
genu AtSWI3B oraz plazmid pCAM1381Z. Za pomocą zaplanowanych na poprzednich ćwiczeniach
3
enzymów restrykcyinych z uzyskanego plazmidu pAtSWI3B wytrawimy promotor AtSWI3B oraz zline-
aryzujemy plazmid pCAM1381Z.
W trakcie trzecich ćwiczeń wyizolujemy z żelu i zligujemy (połączymy) zlinearyzowany plazmid z
promotorem AtSWI3B. Następnie stransformujemy mieszaniną ligacyjną bakterie Esherichia coli.
Na kolejnych czwartych ćwiczeniach będziemy transformować rośliny Arabidopsis thaliana uzyska-
nym uprzednio plazmidem via Agrobacterium tumefaciens.
Uzyskane z transformacji nasiona wysiejemy na pożywkę z odpowiednim antybiotykiem, co pozwoli
wyselekcjonować rośliny transgeniczne. Następnym etapem naszego eksperymentu będzie potwierdze-
nie transgeniczności uzyskanych roślin. W tym celu na piątych ćwiczeniach wyizolujemy DNA geno-
mowe z uzyskanych roślin. Posłuży ono (ćwiczenie szóste) do potwierdzenia transgeniczności metodą
PCR.
Następnym etapem naszych ćwiczeń będzie analiza uzyskanych roślin za pomocą techniki hybrydy-
zacji Southerna (ćwiczenia siódme i ósme). Technika ta pozwala nie tylko na potwierdzenie lub wyklu-
czenie transgeniczności badanej rośliny ale pozwala także ustalić, liczbę kopii transgenu wintegrowa-
nych w genom naszej rośliny transgenicznej.
Na ćwiczeniach dziewiątych i dziesiątych wyizolujemy białka z Arabidopsis i rozdzielimy w żelu
oraz zrobimy western używając przeciwciał skierowanych przeciwko białku AtSWI3B.
Na ćwiczeniach jedenastych przeprowadzimy detekcje GUSa w wytypowanych roślinach transge-
nicznych. Detekcja ta polega na barwieniu histochemicznym z użyciem odpowiednich substratów. Bar-
wienie to przeprowadzimy na całych roślinach. Zapoznamy się również z podstawami analizy fenotypu
Arabidopsis. Jest to bardzo potężne narzędzie poznawania funkcji badanego genu, niestety rzadko doce-
niane.
Dwunaste ćwiczenie będzie przeznaczone na podsumowanie całego eksperymentu.
Prosimy, aby w czasie ćwiczeń każdy prowadził dziennik laboratoryjny i notował w nim wszystkie
wykonywane czynności oraz uzyskane wyniki. Notatki te posłużą do napisania krótkiego opisu prze-
prowadzonego eksperymentu.
4
pAtSWI3B: (w E. coli) pCAM1381Z (w E. coli)
Izolacja plazmidu z bakterii
2
pAtSWI3B: pCAM1381Z
Trawienie restrykcyjne
Izolacja z żelu
AtSWI3B:
:GUS
Ligacja
3
pAtSWI3B::GUS
Transformacja E. coli
pAtSWI3B::GUS (w E. coli)
Transformacja Agrobacterium
pAtSWI3B::GUS (w Agrobacterium)
Transformacja roS
lin
4
nasiona Arabidopsis thaliana
Selekcja transformantów
RoS
lina transgeniczna
5
Izolacja DNA genomowego
DNA genomowe
PCR
6
potwierdzenie
transgenicznoS
ci
Hybrydyzacja Southerna
7,8
sprawdzenie liczby
kopii transgenu
Western
9,10
detekcja białka
Detekcja GUSa
11
analiza ekspresji genu AtSWI3B
w przeznaczonym do tego polu, rozpocząć przeszukiwa-
KOMPUTEROWA ANALIZA
nie,
SEKWENCJI
-sprawdzić, jakie domeny obecne są w zadanej sekwencji,
przyjrzeć się genom o podobnym układzie domen,
Współczesna biologia dostarcza ogromnej ilości informa-
4. analiza filogenetyczna
cji, których przechowywanie i obróbka możliwa jest wy-
-jeszcze raz przeszukać GenBank przy użyciu programu
łącznie przy pomocy komputerów. Najistotniejszym
BlastP wybierajÄ…c tym razem w polu
obecnie narzędziem jest przeszukiwanie publicznych baz
 select from:  Arabidopsis thaliana .
sekwencji DNA i białkowych. Bazy te zawierają wszystkie
-kilka sekwencji znalezionych w punkcie pierwszym zapi-
opublikowane sekwencje w tym te pochodzÄ…ce z projek-
sać w jednym pliku w formacie Fasta
tów sekwencjonowania genomów. Przeszukanie baz se-
-otworzyć plik z sekwencjami w programie ClustalX (do-
kwencji pozwala na stawianie hipotez na temat funkcji
stępny z
nowo sklonowanego genu. Przeszukiwanie bazy sekwencji
http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)
polega na porównaniu zadanej sekwencji ze wszystkimi w
-stworzyć multiple alignment
bazie i wybraniu grupy najpodobniejszych. Istnieje wiele
-obliczyć drzewo filogenetyczne sekwencji
algorytmów porównujących, spośród których najpow-
-obejrzeć drzewo programem NJplot
szechniej stosowane są BLAST (szybki, ale mało czuły)
-dokładnie przeanalizować otrzymane drzewo pamiętając,
oraz FASTA (wolniejszy i bardziej czuły).
że jest to drzewo nie ukorzenione
Wielu informacji może dostarczyć analiza samej sekwencji.
Istnieją narzędzia pozwalające na identyfikację domen
IZOLACJA PLAZMIDOWEGO
białkowych w sekwencji. Potężnym narzędziem jest anali-
DNA BAKTERII
za filogenetyczna.
Eksperyment na którym oparte są nasze tegoroczne ćwi- Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego
czenia polega na analizie promotora genu AtSWI3B. Nie- DNA, z których każda obejmuje trzy etapy:
stety analiza komputerowa promotorów jest bardzo - hodowlę bakterii (i ewentualnie amplifikację plazmidu),
skomplikowana i mało miarodajna. Dlatego sekwencje - lizę bakterii,
promotora zanalizujemy tylko pod kontem przeklonowa- - oczyszczanie plazmidowego DNA.
nia promotora do konstruktu z sekwencją kodującą genu Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w któ-
GUS. Następnie spróbujemy powiedzieć coś o funkcji rych podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem.
genu AtSWI3B analizując jego domeny i robiąc wstępną Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzy-
analizę filogenetyczną. mywane są z hodowli znajdującej się w póz
nej fazie logaryt-
micznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średnioko-
Wykonanie: pijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifiko-
1.odnalezienie promotora genu AtSWI3B w bazie danych wane. Do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym
GenBank. celu chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji
-arete.ibb.waw.pl wybrać  GenBank DNA sequences chromosomu bakteryjnego.
wpisać  accession number naszego genu (AT2G33610) We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wy-
-wybrać pozycje zawierającą chromosom z naszym genem, korzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA geno-
-zanalizować dokładnie rejon przed miejscem inicjacji mowym a DNA plazmidowym bakterii:
translacji naszego genu i okoliczne sekwencje kodujące. - DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA pla-
2. planowanie ligacji zmidu,
-zrobić mapę restrykcyjną znalezionego promotora - podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA
-zrobić mapę restrykcyjną plazmidu docelowego genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA
pCAMBIA-1381Z (jego sekwencje ściągnąć w opisany plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently
wyżej sposób z GenBanku) w tym celu wkleić znalezione closed circle).
sekwencje (po jednej) w okienko na stronie Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakte-
http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html (nie zmie- rie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych
niać parametrów programu) detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalni-
-zanalizować wyniki przeszukiwań, wybrać enzymy do ków organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna)
użycia przy przeklonowaniu lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może
3. analiza genu AtSWI3B być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową
-połączyć się z serwisem BLASTP  przeszukiwanie bazy bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy alkalicznej
białek sekwencją białkową bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), wkleić sekwencję w całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowe-
przeznaczonym do tego polu, rozpocząć przeszukiwanie go DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zosta-
-dokładnie przeanalizować kilka najpodobniejszych białek, je zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przy-
zwrócić uwagę na wielkość i jakość podobieństwa se- padku otrzymywania plazmidowego DNA metodą ter-
kwencji, ustalić przypuszczalną funkcję genu miczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura,
-na stronie http://smart.embl-heidelberg.de/ wkleić se- w której DNA genomowy i plazmidowy zachowują się po-
kwencję genu AtSWI3B do okienka i rozpocząć analizę dobnie jak w wysokim pH.
-połączyć się z serwisem DART Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), wkleić sekwencję DNA od białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony
buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chlorofor-
6
mem i alkoholem izoamylowym. Białka można również - aparat do elektroforezy.
usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą
K). Usunięcie RNA przeprowadza się enzymatycznie, Wykonanie:
inkubując próbki z RNazą (wolną od DNaz), przez sączenie - poprzedniego dnia, bakterie z wybranych kolonii bakte-
molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości (patrz dalej). ryjnych zaszczepić do 3 ml pożywki płynnej LBamp. Ho-
W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe czÄ…steczki DNA
dować przez noc w 37oC, z wytrząsaniem,
ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC
- rozlać hodowle bakteryjną do probówek Eppendorfa i
plazmidu sÄ… po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH
zwirować bakterie w mikrowirówce przez 1 minutę (2 x 1.5
roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu)
ml),
prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, pod-
- odsączyć pipetą pożywkę do sucha,
czas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca
- zawiesić osad końcówką do pipety w 100 ul roztworu I,
siÄ™ w postaci serowatego osadu.
dodać 5 ul RNazy,
Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem
- inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej,
etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potaso-
- do probówki Eppendorfa dodać 200 ul świeżo przygoto-
wego, sodowego lub amonowego.
wanego roztworu II,
Wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z
- zamieszać BARDZO delikatnie i wstawić do lodu na 5
wyjÄ…tkiem lizy alkalicznej, wymagajÄ… oddzielenia tego DNA
minut,
od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obec-
- dodać 150 ul zimnego (z lodówki) roztworu III, dwu-
ności bromku etydyny. Wykorzystuje się tu fakt, że bromek
krotnie BARDZO SILNIE wstrząsnąć i wstawić do lodu
etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego DNA
na 10 minut,
genomowego niż do DNA plazmidowego, powodując czę-
- zwirować 15 minut,
ściowe rozwinięcie helisy DNA i wydłużenie cząsteczki, co
- zebrać klarowny supernatant (można zwirować go po-
powoduje zmniejszenie jej gęstości pławnej. Różnica w
wtórnie),
gęstości pomiędzy formą CCC a liniową i kolistą OC (ang.
- dodać 900 ul etanolu 96 % i inkubować co najmniej 20
open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest wystarczająca do
minut w temperaturze -20oC,
oddzielenia superzwiniętego DNA podczas wirowania w
- zwirować 15-20 minut w mikrowirówce,
gradiencie gęstości chlorku cezu w obecności bromku ety-
- zlać etanol, osad przemyć 1 ml etanolu 70 %, zwirować,
dyny. Pasmo superzwiniętego DNA układa się poniżej pa-
- wysuszyć na SpeedVacu (do 5 minut),
sma utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowe-
- osad zawiesić w 50 ul buforu TE
go DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu. CzÄ…steczki
- przygotować 0.8 % żel agarozowy w buforze TBE (dodać
RNA mają największą gęstość i zbierają się na dnie probówki
bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml) ,
wirowniczej, zaś białka pozostają w górnej warstwie roztwo-
- nanieść na żel 5 ul preparatu z 1 ul barwnika do elektrofo-
ru.
rezy,
Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można
- prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu nie
również metodą wirowania lizatów komórkowych w gra-
przekraczajÄ…cym 5 V/cm,
diencie alkalicznej sacharozy (w środowisku alkalicznym
- sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV
formy liniowe i OC ulegajÄ… rozdzieleniu na pojedyncze nici i
(ocenić jakość i ilość DNA w preparacie).
sedymentują 3-4 razy wolniej niż niezdenaturowana superz-
winięta forma CCC), stosując wymieniacze jonowe (np.
Bardzo szybka metoda otrzymywania DNA plazmi-
kolumienki Qiagen) lub filtrację na żelach.
dowego bakterii (UWAGA! Metoda nie używana na
ćwiczeniach)
Otrzymywanie DNA plazmidowego na małą
skalÄ™ (minilizaty)
Odczynniki i aparatura:
- pożywka LBamp stała,
Odczynniki i aparatura:
- roztwór I: 9 objętości barwnika do elektroforezy + 11
- pożywka LBamp płynna
objętości wody + 40 objętości mieszaniny 0.2 M NaOH i 1
- pożywka LBamp stała
% SDS (przygotować tuż przed użyciem),
- RNaza (10 mg/ml)
- roztwór II: 3 M octan potasu, 1.8 M kwas mrówkowy,
- roztwór I: 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM glukoza, 10
- agaroza,
mM EDTA
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- roztwór II: 0.2 M NaOH, 1 % SDS (przygotować tuż
- bromek etydyny (10 mg/ml),
przed użyciem)
- barwnik do elektroforezy,
- roztwór III: 7.5 M octan amonu
- probówki Eppendorfa,
- etanol 96 %
- mikrowirówka,
- etanol 70 %
- aparat do elektroforezy.
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)
- agaroza,
Wykonanie:
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- wybrane kolonie przeszczepić na szalkę LBamp. Hodo-
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
wać przez noc w 37oC,
- barwnik do elektroforezy,
- odpipetować do probówek Eppendorfa po 16 ul roztwo-
- probówki szklane (10 ml),
ru I,
- probówki Eppendorfa,
- zebrać końcówką do pipety połowę kolonii i zawiesić w
- mikrowirówka,
przygotowanym roztworzeI,
- SpeedVac,
7
- dodać 3 ul roztworu II, BamHI produkuje końce GATCC (rozpoznaje sekwencję
- zwirować 5 minut w mikrowirówce, GGATCC), zaś enzym BglII, wytwarzający takie same "lep-
- supernatant nanieść bezpośrednio na 1% żel agarozowy kie końce", rozpoznaje sekwencję AGATCT. Umożliwia to
(bufor TBE, bromek etydyny w żelu: stężenie końcowe 0.5 klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawio-
ug/ml), nym BglII, ale sklonowany odcinek DNA nie będzie mógł
- prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu być wycinany enzymem BglII ani BamHI.
nie przekraczajÄ…cym 5 V/cm,
- sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV. Do pojedynczej reakcji trawienia używa się zwykle 0.2 - 1 ug
DNA w roztworze o objętości 20 ul lub mniejszej. Bufory
Uwaga! Bromku etydyny należy dodawać w ręka- do trawień przygotowuje się w postaci 10-krotnie stężonych
wiczkach ! roztworów różniących się między sobą zawartością soli.
Uwaga! Należy przestrzegać zasad pracy z transilu- Jeżeli DNA ma być strawiony dwoma enzymami wymagają-
minatorem ! cymi różnych buforów, najpierw przeprowadza się trawienie
w buforze o niższej soli, a następnie podwyższa się stężenie
soli w mieszaninie przez dodanie odpowiedniej objętości
ENZYMY RESTRYKCYJNE. MAPY
stężonego NaCl.
RESTRYKCYJNE
Inkubację preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi
prowadzi siÄ™ w temperaturze 37oC w czasie 1 godziny lub
Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) sÄ… enzymami
dłużej. Przerwanie reakcji (zwykle niekonieczne) można
izolowanymi z bakterii, zdolnymi do rozpoznawania specy-
przeprowadzić przez termiczną inaktywację enzymu (15
ficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej czÄ…-
minut, 65oC) lub dodając EDTA pH 8.0 do końcowego
steczki DNA. Enzymy restrykcyjne typu II wymagajÄ… jako
stężenia 10 mM (chelatacja jonów magnezu).
substratu dwuniciowej czÄ…steczki DNA, zawierajÄ…cej co
y
ródłem informacji o enzymach restrykcyjnych (ich termo-
najmniej jednÄ… sekwencjÄ™ rozpoznawanÄ… przez dany enzym,
stabilności i wymaganiach co do stężenia soli) są katalogi
oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub
firm produkujÄ…cych te enzymy (np. New England Biolabs,
w okolicy sekwencji rozpoznawanej.
Promega).
Większość enzymów restrykcyjnych typu II rozpoznaje
Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość,
palindromowe (posiadajÄ…ce oÅ› symetrii) sekwencje cztero-
która trawi kompletnie 1 ug DNA wzorcowego (np. fag )
lub sześcionukleotydowe (tzw. enzymy czwórkowe lub
w czasie 1 godziny w temperaturze optymalnej.
szóstkowe). Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko
siebie i wówczas powstają tzw. "tępe końce", np. enzym
Podstawową cechą produktów trawienia DNA enzymami
HaeIII z Haemophilus aegypticus rozpoznaje i przecina następu-
restrykcyjnymi jest to, że otrzymywane fragmenty DNA
jÄ…cÄ… sekwencjÄ™:
dają się rozdzielić na żelach w taki sposób, że w każdym
5' GGCC 3'
prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o tej samej
3' CCGG 5'
masie. Fakt ten pozwala na precyzyjną obróbkę DNA,
w wyniku czego powstają "tępe końce":
m.in. konstruowanie map restrykcyjnych badanego DNA
5' GG i CC 3'
(mapa restrykcyjna wskazuje miejsca cięte przez enzymy
3' CC i GG 5'
restrykcyjne). Analizując na żelach produkty trawienia
Z kolei enzym EcoRI ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje
danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowa-
sześcionukleotydową sekwencję:
nymi pojedynczo i w kombinacjach, można ustalić wza-
5' GAATTC 3'
jemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami roz-
3' CTTAAG 5'
poznawanymi przez te enzymy. Oprócz tego, DNA pocię-
przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie
ty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z
końce" w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych
wektorem i tworzyć zrekombinowane (zawierające sklo-
końców 5':
nowany DNA) plazmidy.
5' G i AATTC 3'
SporzÄ…dzanie mapy restrykcyjnej plazmidu poprzedzone
3' CTTAA G 5'
jest kalibracją żelu. Przeprowadza się ją w oparciu o zasa-
Niektóre enzymy produkują "lepkie końce" 3'. Wszystkie
dę, że droga migracji liniowej cząsteczki DNA w żelu
natomiast pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a
agarozowym jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu
grupę hydroksylową na końcu 3'.
dziesiętnego jej masy cząsteczkowej. Aby wyznaczyć wiel-
"Lepkie końce" mają duże znaczenie przy klonowaniu ge-
kość nieznanych fragmentów DNA, stosuje się standardy
nów: sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku
wielkości (cząsteczki DNA o znanej wielkości, poddawane
działania tego samego enzymu są komplementarne. W
elektroforezie w tym samym żelu co cząsteczki badane).
obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie
połączyć ze sobą kowalencyjnie.
Trawienie plazmidów pAtSWI3B oraz pCAM1381Z
Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na litero-
enzymami restrykcyjnymi oraz sporzÄ…dzenie mapy
wych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodza-
restrykcyjnej.
ju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera
oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub
Odczynniki i aparatura:
szczepu otrzymujÄ… liczby rzymskie.
- plazmidy pATSWI3B i pCAM1381Z o stężeniu ok. 1
Enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające
mg/ml,
te same sekwencje DNA, nazywajÄ… siÄ™ izoschizomerami.
- standard wielkości DNA,
Zdarza się, że dwa enzymy wytwarzają takie same "lepkie
- enzymy EcoRI i BamHI
końce", mino że rozpoznają różne sekwencje DNA. Enzym
- bufory do trawień,
8
- agaroza, -zestaw do izolacji DNA z żelu
- bromek etydyny (10 mg/ml), -Å‚az
nia wodna lub heat-block
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA), -skalpel
- barwnik do elektroforezy, -mikrowirówka
- probówki Eppendorfa, -agaroza
- mikrowirówka, -bufor TBE (45mM Tris-boran, 1mM EDTA)
-bromek etydyny 10 mg/ml
- Å‚az
nia wodna na 37oC,
-izopropanol
- aparat do elektroforezy.
-etanol 96%
-barwnik do elektroforezy
Wykonanie:
- strawić DNA plazmidowy enzymami EcoRI i BamHI
Wykonanie:
pojedynczo i w kombinacjach,
-przygotować 1% żel agarozowy z 0,5µg/ml bromku
- przygotować 1% żel agarozowy w buforze TBE (dodać
etydyny, nałożyć DNA zmieszane z barwnikiem, prowa-
bromku etydyny do żelu do stężenia 0.5 ug/ml)
dzić elektroforezę aż prążki należycie się rozdzielą,
- do strawionych próbek oraz do markera wielkości DNA
-na transiluminatorze skalpelem wyciąć kawałek żelu za-
dodać 1/10 objętości barwnika do elektroforezy,
wierający odpowiedni prążek,
- nanieść próbki na żel przy pomocy pipety automatycznej
-izolację z żelu przeprowadzić ściśle według zaleceń pro-
(Uwaga! Minimalna ilość DNA, którą widać na żelu w
ducenta zestawu,
postaci prążka, wynosi około 10 ng. Nie należy przekra-
-sprawdzić skuteczność izolacji puszczając część oczysz-
czać 200 ng DNA w prążku),
czonego preparatu na żelu agarozowym.
- prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu
nie przekraczajÄ…cym 5 V/cm,
Izolacja fragmentu DNA z użyciem DEAE-
- sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV,
- wyciąć z żelu prążek DNA i zamrozić go w  20o C,
celulozy
- wykreślić na papierze półlogarytmicznym krzywą kalibra-
cyjną żelu,
Metoda izolowania DNA z użyciem DEAE-celulozy pole-
- oszacować na podstawie krzywej wielkości trawionych
ga na "złapaniu" migrującego w żelu DNA na umieszczo-
fragmentów DNA i narysować mapę restrykcyjną plazmi-
ną w żelu membranę z DEAE-celulozą. Membranę z
du.
DNA odpłukuje się od zanieczyszczeń buforem o niskiej
sile jonowej, a następnie eluuje się DNA (bufor o wysokiej
Uwaga! Bromku etydyny należy dodawać w ręka-
sile jonowej). DNA o długości od 500 bp do 5 kb odzy-
wiczkach !
skiwane jest z dużą wydajnością, a jego czystość jest bar-
Uwaga! Należy przestrzegać zasad pracy z transilu-
dzo wysoka. Z membran nie eluuje siÄ™ jednak jednonicio-
minatorem !
we DNA (ssDNA) oraz fragmenty powyżej 15 kb.
Odczynniki i aparatura:
IZOLACJA DNA Z ŻELU
- DNA do izolacji,
AGAROZOWEGO
- papierki z DEAE-celulozÄ… (preparat handlowy),
- 10 mM EDTA (pH 8.0),
Procedura klonowania genów wymaga umiejętności
- 0.5 M NaOH,
oczyszczania cząsteczek DNA o ściśle określonej wielko-
- agaroza,
ści. W tym celu przeprowadza się elektroforezę w żelu
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
agarozowym, wycina prążek o odpowiedniej mobilności i
- bromek etydyny (10 mg/ml),
następnie oczyszcza DNA od agarozy.
- barwnik do elektroforezy,
Żel agarozowy zawiera substancje mogące negatywnie
- bufor A: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.15 M NaCl, 10
wpływać na reakcje enzymatyczne z udziałem DNA,
mM EDTA (pH 8.0),
dlatego skuteczność oczyszczenia ma kluczowe znaczenie
- bufor B: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0 M NaCl, 10 mM
dla powodzenia przeprowadzanych póz
niej manipulacji.
EDTA (pH 8.0),
Szczególnie wrażliwe na zanieczyszczenia są ligacja i se-
- mieszanina fenol : chloroform : alkohol izoamylowy
kwencjonowanie DNA.
(25:24:1) pH 8.0,
Istnieje wiele sposobów izolacji DNA z żelu agarozowego.
- 3 M octan sodu,
Najskuteczniejsze wydajÄ… siÄ™ zestawy oferowane przez
- etanol 96 %,
dostawców materiałów laboratoryjnych. Działają one
- etanol 70 %,
najczęściej według następującego schematu: rozpuszczenie
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA),
żelu, adsorbcja DNA, przemywanie, elucja DNA. Można
- aparat do elektroforezy,
również izolować DNA z żelu bez wykorzystania kosz-
- skalpel lub żyletka,
townych zestawów przy użyciu DEAE-celulozy lub elek-
- probówki Eppendorfa,
troelucji do woreczków dializacyjnych.
- Å‚az
nia wodna lub heat-block na 65oC,
- mikrowstrzÄ…sarka Vortex,
Izolacja fragmentu DNA z żelu agarozowe-
- mikrowirówka.
go za pomocÄ… komercyjnego zestawu
Wykonanie:
Odczynniki i aparatura:
- pasek z DEAE-celulozą zanurzyć na 5 minut w roztwo-
-aparat do elektroforezy
rze 10 mM EDTA (pH 8.0),
9
- pasek przenieść na 5 minut do roztworu 0.5 M NaOH, Wykonanie:
- przepłukać 6-krotnie sterylną bidestylowaną wodą (tak - przygotować żel agarozowy w buforze TBE (dodać
przygotowana DEAE-celuloza może być przechowywana w lodówce bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml), prowadzić elek-
w sterylnej wodzie przez kilka tygodni), troforezę do czasu, gdy prążek DNA, który ma być izolo-
- przygotować żel agarozowy w buforze TBE (dodać wany, stanie się widoczny,
bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml), prowadzić elek- - używając ostrego skalpela lub żyletki, wyciąć z żelu prą-
troforezę do czasu, gdy prążek DNA, który ma być izolo- żek DNA, które ma być izolowany,
wany, stanie się widoczny, - umieścić fragment agarozy w woreczku dializacyjnym w
- używając ostrego skalpela lub żyletki, naciąć agarozę tuż jak najmniejszej objętości buforu 0.5 x TBE i zamknąć
przed prążkiem DNA, który ma być izolowany; nacięcie woreczek tak, aby nie pozostały w środku pęcherze powie-
powinno być szersze niż prążek o około 2mm z obu stron, trza,
- umieścić w nacięciu papierek z DEAE-celulozą tak, aby - umieścić tak przygotowany woreczek w aparacie do elek-
nie znalazły się razem z nim pęcherze powietrza, troforezy i prowadzić elektroforezę przy napięciu 5 V/cm,
- kontynuować elektroforezę (5 V/cm) do czasu, aż całe - po 1 godzinie odwrócić bieguny i prowadzić elektrofore-
izolowane DNA znajdzie się na papierku, zę przez około 1 minutę (uwolnienie DNA ze ścian wo-
- zatrzymać elektroforezę, wyjąć papierek i przepłukać w 5 reczka),
- 10 ml buforu A, otworzyć woreczek, wyjąć fragment agarozy i starannie
- przenieść papierek do eppendorfówki i dodać buforu B przenieść bufor do probówki Eppendorfa,
tak, aby papierek był całkowicie przykryty, - woreczek przemyć małą ilością buforu 0.5 x TBE i prze-
nieść bufor do probówki Eppendorfa,
- wstawić probówkę na 30 minut do 65oC,
- dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2.5 objętości
- zwirować 5 minut, supernatant przenieść do nowej pro-
bówki, zimnego etanolu 96 %, wstawić do -20oC na 15 - 30 mi-
- do papierka dodać drugą objętość buforu B i inkubować nut,
- zwirować co najmniej 15 minut w mikrowirówce,
kolejne 15 minut w 65oC,
- osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w
- połączyć ze sobą dwie objętości buforu B, dodać równą
buforze TE,
objętość mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy,
- sprawdzić ilość odzyskanego DNA na żelu agarozowym.
zamieszać na vortexie, zwirować 5 minut,
- przenieść fazę wodną (górną) do nowej probówki,
- dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2.5 objętości LIGACJA DNA
zimnego etanolu 96 %, wstawić do -20oC na 15 do 30
A
Ä…czenie (ligacja) czÄ…steczek DNA jest jednÄ… z podstawo-
minut,
wych technik biologii molekularnej. Ligacja DNA jest
- zwirować co najmniej 15 minut w mikrowirówce,
reakcją enzymatyczną. Reakcja ta jest bardzo wrażliwa na
- osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w
błędy, na tym właśnie etapie klonowania genów ujawniają
buforze TE,
się wszelkie popełnione wcześniej pomyłki.
- sprawdzić ilość odzyskanego DNA na żelu agarozowym.
Warunki w jakich przeprowadza się reakcję ligacji zależą
przede wszystkim od tego czy łączy się lepkie czy tępe
Elektroelucja do woreczków dializacyjnych
końce DNA. W zależności od potrzeb można zmieniać
temperaturę i czas trwania reakcji oraz stężenie łączonego
Elektroelucja do woreczków dializacyjnych jest najmniej
DNA.
wygodną ze stosowanych technik, ale okazała się najefek-
Jeśli produktem ligacji jest plazmid, mieszaniną ligacyjną
tywniejsza w izolowaniu dużych fragmentów DNA (powy-
bezpośrednio transformuje się bakterie. Wynikiem są
żej 5 kb), mało wydajnie izolowanych innymi metodami.
wtedy kolonie bakterii nosących zamknięty plazmid.
Transformuje się bakterie Escherichia coli. Zawsze należy
Odczynniki i aparatura:
sprawdzić poprawność ligacji trawieniem restrykcyjnym
- woreczki dializacyjne przygotowany w następujący spo-
lub sekwencjonowaniem.
sób: gotować woreczki 10 minut w dużej objętości Na-
HCO3 i 1 mM EDTA (pH 8.0), przepłukać wodą bidesty-
Odczynniki i aparatura:
lowaną, gotować 10 minut w 1 mM EDTA (pH 8.0),
-Å‚az
nia wodna lub termostat,
schłodzić (tak przygotowane woreczki mogą być przechowywane w
-elektroporator,
lodówce w sterylnej wodzie przez kilka tygodni),
-kuwety do elektroporacji,
- agaroza,
-ligaza DNA,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
-bakterie elektrokompetentne,
- bromek etydyny (10 mg/ml),
-pożywka LB płynna,
- barwnik do elektroforezy,
-szalki z pożywką LB z odpowiednim antybiotykiem,
- 3 M octan sodu,
-0,5M EDTA pH 8
- etanol 96 %,
-woda sterylna,
- etanol 70 %,
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA),
Wykonanie:
- aparat do elektroforezy,
-przygotować reakcję mieszając wodę, bufor ligazy (do-
- skalpel lub żyletka,
starczany zawsze z ligazą), DNA i ligazę; przygotować
- probówki Eppendorfa,
również kontrolę bez ligazy,
- mikrowirówka.
-prowadzić reakcjÄ™ przez 60 minut w 23°C,
10
-inkubować mieszaninę 10 minut w 65oC i dializować na -wirówka,
krążku przez 20 minut -probówki wirówkowe,
-poÅ‚owÄ™ mieszaniny ligacyjnej zmieszać ze 100µl wody i -roztwór do infiltracji (0,5x sole MS; 1x witaminy B5; 5%
dodać do 40µl bakterii elektokompetentnych, sacharoza; 0,05% MES; 44mg/l BAP; 0,02% Silwet L-77;
-transformować bakterie w elektroporatorze (2500V, pH 5,7)
5mA), bezpoÅ›rednio potem dodać 700µl pożywki LB bez -eksykator i pompa próżniowa,
antybiotyków i inkubować w 37°C przez 45 lub 90 minut -folia spożywcza
w zależności od oporności jaką niesie plazmid, -szalki z pożywką MS z kanamycyną (100 mg/l) i wanko-
-wysiać bakterie na szalki z pożywką LB z odpowiednim mycyną (500 mg/l)
antybiotykiem i hodować przez noc w 37°C.
Uwaga! Należy przestrzegać zasad pracy z organi-
zmami transgenicznymi.
TRANSFORMACJA ROÅšLIN
Wykonanie
Wprowadzenie obcego DNA do genomu organizmów jest
-hodować Arabidopsis thaliana w fotoperiodzie 8/16h
niezwykle istotne zarówno w celach poznawczych, jak i
dzień/noc z regularnym nawożeniem aż wykształcą się
użytkowych. Rośliny niezwykle trudno poddają się proce-
duże rozetki,
durze transformacji z powodu obecności ścian komórko-
-przenieść do fotoperiodu 16h/8h dzień/noc i hodować
wych oraz aktywnych mechanizmów obronnych.
aż pojawią się kwiatostany,
Istnieją bezpośrednie techniki transformacji polegające na
-uciąć kwiatostany i hodować aż boczne kwiatostany będą
fizycznym umieszczeniu obcego DNA w komórce roślin-
miały długość 5 do 10 cm,
nej (na przykład strzelba genowa). Obecnie stosowane są
-200 ml hodowli nocnej Agrobacterium tumefaciens zwirować
one tylko w sytuacjach szczególnych.
w 5000 rpm przez 10 min., zawiesić w 200 ml roztworu
Najpowszechniej stosowana jest technika transformacji
do infiltracji,
roślin przy pomocy bakterii Agrobacterium tumefaciens. Bak-
-zanurzyć kwiatostany w zawiesinie bakterii,
terie te występują naturalnie w glebie i pasożytują na rośli-
-umieścić w eksykatorze i poddać działaniu próżni przez 2
nach. Wykorzystując naturalnie posiadaną zdolność trans-
minuty,
formacji roślin, wprowadza do genomu żywiciela geny
-przez noc trzymać rośliny w ciemności przykryte folią,
odpowiedzialne za syntezę substancji, które stanowią
-hodować w fotoperiodzie 16h/8h aż łuszczynki zaczną
póz
niej pożywienie bakterii.
się otwierać,
Aby wykorzystać Agrobacterium do transformacji roślin
-wstrzymać podlewanie i zbierać nasiona,
wybranÄ… przez nas sekwencjÄ… DNA, wystarczy obszar
-nasiona wysuszyć trzymając w suchym pomieszczeniu
naturalnie wprowadzany do roślin podstawić naszą se-
przez tydzieÅ„ i nastÄ™pnie trzymać przez tydzieÅ„ w 4°C ,
kwencją. Istnieją specjalne plazmidy, do których wligowu-
-wysiać na pożywkę MS kan van.
je się żądaną sekwencję. Konstrukt taki wprowadza się
następnie do odpowiedniego szczepu Agrobacterium i bez
Wersja uproszczona
żadnych dalszych manipulacji można transformować
-hodować Arabidopsis thaliana z regularnym nawożeniem
rośliny.
do momentu zakwitnięcia,
Istotnym elementem procedury transformacji jest odróż-
-200 ml hodowli nocnej Agrobacterium tumefaciens zwirować
nienie komórek transformowanych od nie transformowa-
w 5000 rpm przez 10 min., zawiesić w 200 ml 5% sacha-
nych i następnie odtworzenie całej rośliny. Komórki
rozy i dodać 60 µl Silwet L-77,
transformowane odróżnia się przez selekcję na antybioty-
-zanurzyć kwiatostany w zawiesinie bakterii na około 10
ku. Dlatego transformując zawsze trzeba wprowadzać gen
sekund,
oporności na antybiotyk. Odtworzenie całej rośliny odby-
-przez noc trzymać rośliny w ciemności przykryte folią,
wa siÄ™ przez regeneracjÄ™ z kallusa lub embriogenezÄ™ soma-
-hodować aż łuszczynki zaczną się otwierać,
tyczną. Procedura regeneracji nie dość że jest długotrwała
-wstrzymać podlewanie i zbierać nasiona,
i trudna, to często powoduję powstawanie nie zamierzo-
-nasiona wysuszyć trzymając w suchym pomieszczeniu
nych zaburzeń genetycznych. Dla tego obecnie najpow-
przez tydzieÅ„ i nastÄ™pnie trzymać przez tydzieÅ„ w 4°C ,
szechniej stosuje siÄ™ technikÄ™ transformacji in planta w
-wysiać na pożywkę MS kan van.
której transformacji ulega gametofit. Procedura polega na
zanurzeniu kwiatów w zawiesinie bakterii. Wśród uzyska-
Transformacja siewek tytoniu
nych z tych kwiatów nasion pewna część jest transgenicz-
na, selekcji dokonuje się kiełkując nasiona na pożywce z
Odczynniki i aparatura:
antybiotykiem.
-komora fitotronowa,
W czasie ćwiczeń transformować będziemy Arabidopsis
-hodowla nocna Agrobacterium
thaliana otrzymanym przez nas plazmidem
-wirówka,
pAtSWI3B::GUS.
-probówki wirówkowe,
-10mM MgSO
4
Transformacja Arabidopsis thaliana metodÄ…
-sterylne 2-3 tygodniowe siewki tytoniu,
in planta
-eksykator i pompa próżniowa,
-sterylna bibuła i pęseta,
Odczynniki i aparatura:
-pożywka MS,
-komora fitotronowa,
-pożywka MS z claforanem (500 mg/l), kanamycyną (100
-hodowla nocna Agrobacterium
mg/l) i hormonami (1 mg/l BAP; 0,1 mg/l NAA),
11
-pożywka MS claf kan. - izopropanol,
- roztwór II ( 76% etanol, 10mM octan amonu );
Wykonanie - TE pH 7.5 ( 10mM Tris, 1mM EDTA ).
-30 ml nocnej hodowli Agrobacterium wirować 5000 rpm
przez 10 min., Wykonanie:
-zawiesić w 20 ml 10mM MgSO , płukanie powtórzyć - 1 gram tkanki roślinnej zamrozić w ciekłym azocie i
4
dwa razy, utrzeć w moz
dzierzu,
-siewki tytoniu zalać zawiesiną bakteryjną, - dodać 5 ml roztworu 2xCTAB,
-zaaplikować próżnię przez 5 minut,
- próbki inkubować w 60oC przez 30 minut, w trakcie
-rośliny odsączyć od bakterii na sterylnej bibule i rozłożyć
inkubacji kilkakrotnie mieszać,
na szalce z pożywką MS na 3 dni (kokultywacja w 260C,
- dodać równą objętość mieszaniny chloroform:alkohol
fotoperiod 16h/8h dzień/noc),
izoamylowy (24:1), mieszać łagodnie przez 15 minut,
-roślinki przenieść na pożywkę MS z dodatkiem hormo-
- mieszaninę przenieść do probówek typu Corex i wirować
nów i antybiotyków
przy 10000 obrotów/min przez 15 minut w rotorze SS34
-hodowlę prowadzić w warunkach podanych wyżej, eks-
(wirówka Sorvall),
plantaty przenosić na nowe podłoże co 7 dni,
- przenieść fazę wodną do nowych probówek, dodać 0.7
- regenerujące pędy o długości około 1 cm odcinać od
objętości zimnego izopropanolu,
kalusa i przenosić na podłoże MS z antybiotykami,
(-20oC), mieszać bardzo delikatnie aż pojawi się wytrąco-
- po ukorzenieniu rośliny można przenieść do ziemi.
ny DNA,
- przenieść DNA do probówki Eppendorfa, dodać 500 µl
IZOLACJA GENOMOWEGO DNA
roztworu II, pozostawić na 15 min. w lodzie,
- probówki zwirować w mikrowirówce, usunąć roztwór,
Z ROÅšLIN
osad lekko wysuszyć,
- osad zawiesić w TE pH 7.5.
Pierwszym etapem izolacji genomowego DNA z komórki
- prowadzić elektroforezę przy napięciu 5V/cm, w bufo-
roślinnej jest pozbycie się ściany komórkowej. Utarcie w
rze TBE, stężenie bromku etydyny powinno wynosić nie
moz
dzierzu, wcześniej zamrożonego w ciekłym azocie
materiaÅ‚u roÅ›linnego, pozwala na mechaniczne uszkodze- wiÄ™cej niż 0.5 µg/ml żelu.
nia ściany komórkowej. Następny etap to rozpuszczenie
błon komókowych. Detergenty takie jak SDS (sodium
Metoda szybkiej izolacji DNA na mała skalę
dodecyl sulafate) lub CTAB (cetyl trimethylammonium
bromide) zawarte w buforach do ekstrakcji DNA umożli-
Materiały:
wiają rozpuszczenie błon. EDTA chelatująca jony magne-
-bibuła, probówki Eppendorfa, tłoczki do ucierania tkan-
zu  naturalne kofaktory większości nukleaz, chroni uwol-
ki, końcówki do pipet,
niony DNA przed działaniem endogennych enzymów o
-bufor do ekstrakcji (200 mM Tris HCl pH 7.5, 250 mM
aktywności nukleolitycznej. Zwykle otrzymany preparat
NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS), izopropanol, etanol
DNA zawiera duże ilości RNA. Aby pozbyć się zanie-
70%, roztwór TE pH 7,5 (10mM Tris, 1mM EDTA)
czyszczajÄ…cego RNA preparat poddajemy trawieniu RNa-
zą A wolną od DNaz. Jeśli uzyskany preparat zanieczysz-
Wykonanie:
czony jest białkami, można potraktować go proteinazą K i
- 100mg tkanki roślinnej ( wycinamy krążek z liścia za
przeprowadzić ekstrakcję fenolem.
pomocą wieczka probówki Eppendorfa, najlepiej na
Otrzymany wysokocząsteczkowy całkowity DNA należy
bibule).
chronić przed zbyt częstym zamrażaniem i rozmrażaniem,
Następnie utrzeć za pomocą tłoczka na jednolitą masę
ponieważ DNA ulega fragmentacji i preparat traci na
ok. 15 sekund.
jakości. W trakcie preparatyki najlepiej stosować odczyn-
- Dodać 400µl buforu do ekstrakcji i mieszać na vorteksie
niki i materiały świeżo przygotowane, tak aby podczas
przez 5 sekund.
preparatyki nie wprowadzić obcego DNA, który może
(taka mieszanina może stać 1h)
przeszkadzać w dalszej analizie otrzymanego DNA (np.
- Wirować 13000 obr/min przez 1min. (w mikrowirówce)
analiza metodą PCR może dać błędne wyniki).
- NastÄ™pnie przenieść 300µl supernatantu do nowej pro-
bówki i zmieszać z 300µl izopropanolu pozostawiajÄ…c
Całkowity roślinny DNA otrzymamy dwoma metodami:
na 2 min w temp. pokojowej.
(mieszać delikatnie)
I. z użyciem CTAB
- Wirować 13000 obr/min przez 5min.
II. za pomocÄ… zestawu firmy Sigma
- Osad płukać 70% etanolem i zwirować jak poprzednio.
- Osad wysuszyć próżniowo.
Izolacja DNA metodÄ… z CTAB
- Zawiesić osad w 100µl TE pH 7,5
Tak otrzymane DNA można przechowywać przez 1 rok
Odczynniki i aparatura:
w 40C.
- moz
dzierz i tłuczek porcelanowy, probówki wirówkowe,
probówki typu Corex, probówki Eppendorfa, końcówki
do pipet,
- 2xCTAB ( 100mM Tris pH 8.0, 1.4M NaCl, 20mM
EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 0.2% ²-merkaptoetanol);
- mieszanina chloroform:alkohol izoamylowy (24:1);
12
1) starterów reakcji amplifikacji (primerów). Projektując
startery reakcji PCR, należy je dobrać tak, aby:
- starter zawierał około 50% par GC,
- starter był wysoko specyficzny dla danej sekwencji,
AMPLIFIKACJA FRAGMENTU
- odległość między starterami w amplifikowanym DNA
DNA METOD
PCR
wynosiła 0.1 do 3 kb (o ile używana jest Taq polimeraza),
- startery nie tworzyły struktur typu hairpin lub konkatame-
Technika PCR (ang. polymerase chain reaction), opracowana w
rów,
latach 80-ych, zrewolucjonizowała genetykę molekularną,
- długość primerów wynosiła około 20-30 zasad,a tempe-
umożliwiając otrzymywanie dużej liczby kopii unikalnych
ratura ich topnienia 50-60oC,
fragmentów DNA bez konieczności stosowania żmudnych
- startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części frag-
i długotrwałych procedur klonowania.
mentów komplementarnych do siebie samych oraz do
Metoda PCR oparta jest na replikacji DNA in vitro: polime-
drugiego startera,
raza DNA, wykorzystujÄ…c jednoniciowe DNA (ang. single-
2) parametrów reakcji amplifikacji (stężenia dNTP, polime-
stranded DNA, ssDNA) jako matrycÄ™ do syntezy nici kom-
razy, starterów, magnezu). Do reakcji PCR używa się po-
plementarnej, wymaga również krótkich fragmentów dwu-
limerazy z Thermus aquaticus (Taq polimeraza) lub inne
niciowych, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kie-
termostabilne polimerazy DNA (np. Pfu, Pwo, Vent). MajÄ…
runku 5' - 3'. W praktyce laboratoryjnej jednoniciowe
one tę przewagę nad innymi polimerazami DNA, że są
DNA uzyskuje siÄ™ ogrzewajÄ…c DNA dwuniciowe (ang.
stabilne nawet w 94oC (optimum temperaturowe wynosi
double-stranded DNA, dsDNA) do temperatury bliskiej
72oC), a więc mogą być dodane jednorazowo na samym
100oC, zaś jako startery służą dodawane oligonukleotydy
poczÄ…tku reakcji PCR, nie ulegajÄ…c dezaktywacji w trakcie
(tzw. primery) wiążące się specyficznie (hybrydyzujące) z
określonym miejscem na jednoniciowej matrycy. Oligonu- kolejnych cykli podgrzewania,
3) warunków samej reakcji PCR (temperatury, czasu trwa-
kleotydy (primery) hybrydyzujÄ… z miejscami na obydwu
nia cykli itp). Optymalne temperatury annealingu dla starte-
niciach. Dobiera się je tak, aby oskrzydlały odcinek DNA,
rów można dobrać wykorzystując m.in. program OLIGO.
który ma być zreplikowany.
Czasy i temperatury w dużym stopniu zależą od wielkości
Replikacja rozpoczyna się od primerów na każdej nici i
zachodzi na obu niciach w dwóch przeciwstawnych kie- produktów otrzymywanych w procesie amplifikacji oraz
runkach. Na nowosyntetyzowanych niciach powstają za- sekwencji i długości starterów.
Reakcję prowadzi się w objętości 10-50 ul pod warstwą
tem nowe miejsca wiązania primerów. Po zakończeniu
oleju parafinowego lub wosku, zapobiegajÄ…cÄ… parowaniu.
replikacji nici sÄ… rozdzielane (denaturacja), aby ponownie
umożliwić wiązanie znajdujących się w nadmiarze prime- Probówki z PCR umieszcza się w specjalnym aparacie
(ang. thermal cycler), w którym programuje się czas trwania i
rów (tzw. annealing), syntezę DNA i kolejne rozdzielenie
liczbę cykli oraz temperaturę poszczególnych etapów
nici. Cykl taki powtarza siÄ™ wielokrotnie, a po n cyklach
reakcji. Zwykle stosuje siÄ™ 25-35 cykli.
otrzymuje siÄ™ teoretycznie 2n dwuniciowych czÄ…steczek
DNA będących kopiami sekwencji zawartej pomiędzy
W ramach ćwiczeń będziemy amplifikować fragment
primerami.
DNA obejmujący część promotora genu AtSWI3B i genu
Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem cykli
GUS. Jako matrycy użyjemy DNA genomowe z ćwiczenia
złożonych z następujących etapów: 1) denaturacji DNA
V. Jeśli powstanie produkt o odpowiedniej wielkości, bę-
(2-5' 90-95oC), 2) hybrydyzacji (annealingu) primerów (1-2'
dzie to pierwszy dowód na transgeniczność uzyskanych
40-60oC), 3) elongacji (syntezy DNA)(1-3' 70-75oC). W
przez nas roślin.
każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA
jest podwajana. Efektem replikacji DNA technikÄ… PCR jest
Sekwencje starterów:
więc amplifikacja specyficznego obszaru DNA.
Amplifikacja DNA metodÄ… PCR znajduje szereg zastoso-
BAFprom_U: 5 CTC CTC ACC TTT TAT CTC TCC C
wań w diagnostyce i terapii, m.in. do mapowania mutacji,
3
monitorowania leczenia nowotworów, wykrywania infekcji
Gus+baf_L: 5 TGC CAG TTC AGT TCG TTG TTC 3
bakteryjnych i wirusowych, ustalania płci w badaniach
prenatalnych i in.
Warunki reakcji PCR:
PCR daje się stosunkowo łatwo zastosować jako technika
1× 5 min. 95°C
laboratoryjna. Materiałem wyjściowym do amplifikacji jest
30 × 30sec. 95°C; 30sec 53°C; 2min.10sec. 72°C
DNA zawierający interesującą nas sekwencję. Ponieważ
1×6 min. w 72°C
sekwencja ta określona jest przez primery użyte do reakcji,
nie jest konieczne izolowanie samej sekwencji. Ilość DNA
Odczynniki i aparatura:
stosowanego do PCR jest bardzo mała (teoretycznie wy-
- bufor do Taq polimerazy (10x stężony),
starczy jedna czÄ…steczka DNA). Do mieszaniny reakcyjnej,
- primery (stężenie 50 µM ),
oprócz DNA, dodaje się nadmiar primerów (dwa rodzaje
- genomowe DNA A.thaliana
primerów określających miejsce startu replikacji na każdej
- mieszanina dNTP (10× stężone),
nici), polimerazÄ™ DNA, odpowiedni bufor zawierajÄ…cy
magnez oraz mieszaninÄ™ 4 prekursorów DNA, - Taq polimeraza (0.5 U/µl),
tj.dezoksyrybonukleotydów (dNTP). Powodzenie reakcji - standard wielkości DNA,
PCR wymaga właściwego doboru następujących parame- - agaroza,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
trów:
- bromek etydyny (10 mg/ml),
13
- barwnik do elektroforezy,
Transfer DNA z żelu agarozowego na filtr
- sterylne probówki Eppendorfa 0.5 ml,
nylonowy (Southern blot)
- aparat do elektroforezy,
- aparat do PCR.
Materiały :
- filtr nylonowy, bibuła Whatman 3MM, szklana płytka,
Wykonanie:
kuweta, folia spożywcza, pieluszki higieniczne jednorazo-
- odpipetować do probówek eppendorfa: 1×dNTP ; bufor
wego użytku, parafilm.
do Taq (1x), starter I (0.5 µM), starter II (0.5 µM), DNA
- roztwory :
genomowe, dopeÅ‚nić wodÄ… do 45 µl, (podano stężenia 1.denaturujÄ…cy 1.5M NaCl, 0.5M NaOH
końcowe), 2.neutralizujący 1M Tris (pH 8.0), 1.5M NaCl
- odpipetować do: 3.20xSSC 3M NaCl, 0,3M cytrynian sodu,
probówki kontrolnej I: wszystko oprócz starterów, pH 7.0
probówki kontrolnej II: wszystko oprócz matrycy
DNA, Wykonanie :
- dodać 2,5 U polimerazy Taq - rozdzielić fragmenty DNA na żelu agarozowym, zabar-
- ustawić odpowiedni program wić bromkiem etydyny, przez odcięcie jednego z rogów
- produkt amplifikacji zanalizować na żelu agarozowym zorientować żel, ułożyć wzdłuż ścieżek linijkę i sfotogra-
wobec standardu wielkości. fować żel,
- żel umieścić w kuwecie z roztworem denaturującym, a
kuwetę ustawić na kołysce laboratoryjnej,
HYBRYDYZACJA KWASÓW
- po 1 godzinie przepłukać żel wodą destylowaną i umie-
NUKLEINOWYCH METOD

ścić w roztworze neutralizujacym na 40 minut,
- żel przepłukać wodą destylowaną i ponownie umieścić w
SOUTHERNA
roztworze do neutralizacji na 40 minut, - następnie prze-
płukać wodą destylowaną i umieścić w roztworze 20xSSC
Metoda Southerna polega na hybrydyzacji wyznakowanej
na około 15 minut.
sondy do fragmentów DNA rozdzielonych w żelu agaro-
W trakcie neutralizacji żelu należy wyciąć filtr nylonowy i 3
zowym, a następnie przeniesionych na filtr nylonowy lub
kawałki bibuły Whatman 3MM o wymiarach żelu,
nitrocelulozowy.
- filtr nylonowy wypłukać w wodzie, a następnie w roztwo-
W celu potwierdzenia obecności transgenu i zbadania
rze 20xSSC (bibułę wystarczy zamoczyć w roztworze
ilości jego kopii należy strawić DNA genomowy odpo-
20xSSC).
wiednio dobierając enzymy restrykcyjne. Do doświadcze-
- na kuwecie umieścić szklaną płytkę, na której ułożyć
nia wykorzystamy strawiony genomowy DNA z ćwiczenia
warstwę bibuły Whatman 3MM, tak aby brzegi bibuły
V, oraz jako kontrolę produkt PCRu z ćwiczenia VI. W
dotykały do dna kuwety, bibułę zmoczyć roztworem
DNA genomowym znajduje się dużo miejsc rozpoznawa-
20xSSC, tak aby między bibułą a płytką nie było pęcherzy
nych przez enzym, z tego powodu należy prowadzić reak-
powietrza, ten sam roztwór wlać do kuwety,
cje przez długi czas (przez noc) i przy użyciu dużej ilości
- na bibule położyć żel; pod żelem nie mogą znajdować się
enzymu.
pęcherze powietrza; wzdłuż żelu ułożyć paski parafilmu,
Po rozdziale na żelu, DNA zostaje zdenaturowany pod
tak aby zachodziły na żel około 2mm,
wpływem NaOH, a następnie poddaje się go działaniu
- na żel położyć wcześniej przygotowany filtr nylonowy i 3
roztworu neutralizującego o pH 7.4 (wysokie pH uniemoż-
warstwy mokrej bibuły Whatman 3MM: nie pozostawiać
liwia wiązanie się DNA z filtrem). Następnie przenosi się
pęcherzy powietrza !
fragmenty DNA z żelu na filtr, umożliwia to siła ssąca
- na bibule umieścić 2 warstwy pieluszek higienicznych i
bibuły. Przeniesienie DNA z żelu na filtr nazywamy trans-
przycisnąć je 1 kg ciężarkiem; transfer prowadzić przez
ferem. Transfer fragmentów DNA powyżej 5 tysięcy par
noc,
zasad zachodzi z małą wydajnością. Aby pofragmentować
- usunąć górne warstwy przykrywające żel, na filtrze zazna-
DNA w żelu należy poddać je depurynacji (poddać działa-
czyć długopisem kieszonki i odcięty róg żelu,
niu kwasu). DNA zostaje zwiÄ…zane z filtrem przez zapie-
- wilgotny filtr położyć na transiluminatorze i zapiekać
kanie w 80oC lub przez naświetlanie światłem UV.
przez 2 minuty,
Sondy można znakować przy użyciu różnych metod (np.
- filtr pozostawić do wyschnięcia.
PCR) i czynników znakujących. Jedną z bardziej popular-
nych i czułych metod jest znakowanie przy użyciu radioak-
tywnych nukleotydów. Na naszych ćwiczeniach użyjemy
Znakowanie sondy za pomocÄ… DIG DNA
jednak metody nie radioak-
tywnej z wykorzystaniem
digoksygeniny. Detekcja opie-
ra siÄ™ na wykorzystaniu prze-
ciwciał skierowanych przeciw
digoksygeninie. Przeciwciała
sÄ… skoniugowane z enzymem
(alkaliczną fosfatazą), który w
wyniku reakcji daje barwny
produkt.
14
20µl substratów kolorymetrycznych (NBT i BCIP) do 10
Labelling Kit Roche
ml buforu substratowego. UWAGA  substraty sÄ… tok-
syczne. Czekać na pojawienie się prążków.
Wykonanie
Przygotować roztwór DNA, który ma zostać wyznakowa- ELEKTROFOREZA BIAA
EK W
ny:
ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM
3ul DNA do znakowania (0,5  3 ug)
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką
12 ul wody
powszechnie stosowaną w analizie białek.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym  typ SDS
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 minut)
PAGE służy do rozdziału białek ze względu na ich wiel-
wstawić do lodu na 2 minuty a następnie dodać pozostałe
kość, wykluczając inne właściwości fizykochemiczne poli-
składniki mieszaniny reakcyjnej:
peptydów.
2ul mieszaniny heksanukleotydów
Jeśli zrozumiesz nazwę SDS PAGE, zrozumiesz za-
2ul mieszaniny nukleotydów zawierającej DIG-11-dUTP
sadę działania tej metody rozdziału białek.
1ul enzymu Klenowa
SDS
Mieszaninie inkubować w temperaturze 37oC przez 60
Wiadomo, że na prędkość poruszania się obiektu w śro-
minut. Następnie zatrzymać reakcję dodając 2ul 0,2M
dowisku wpływa zarówno jego wielkość jak i kształt. Jeśli
EDTA (pH 8,0). Teraz należy usunąć pozostałe w reakcji
chcemy rozdzielić mieszaninę białek, które różnią się
w wyznakowane nukleotydy. W tym celu dodać do reakcji
między sobą kształtem i wielkością, przede wszystkim
1/10 objętości 4M LiCl i 3 objętości zimnego (-20oC)
chcemy uzyskać warunki, w których poszczególne czą-
etanolu 96%. Wymieszać i umieścić na 30 minut w tempe-
steczki białkowe zostaną pozbawione swojej drugo-, trze-
raturze  20oC. Zwirować w mikrowirówce przez 15 minut.
cio- i czwartorzędowej struktury (chcemy, aby wszystkie
Usunąć supernatant a osad przepłukać 70% etanolem,
polipeptydy miały ten sam liniowy kształt). Aby nadać
wysuszyć i zawiesić w 50ul buforu TE.
wszystkim białkom ten sam liniowy kształt używamy
SDS-u (siarczan dodecylu sodu, ang. Sodium Dodecyl
Hybrydyzacja
Sulfate). SDS jest detergentem, który rozpuszcza hydro-
fobowe cząsteczki i jednocześnie posiada ujemny ładunek.
Jeśli sonda jest w 100% homologiczna do poszukiwanego
W związku z tym, jeśli przeprowadzimy inkubację komór-
DNA, hybrydyzację należy prowadzić w 65oC.
ki w roztworze SDS-u, błony komórkowe zostaną roz-
puszczone, a zdenaturowane białka zostaną pokryte
- prehybrydyzację prowadzić w 65oC co najmniej przez 2
ujemnymi ładunkami. Po zadziałaniu SDS wszystkie biał-
godziny:
ka będą posiadały jedynie strukturę pierwszorzędową,
roztwór do prehybrydyzacji:
oraz wszystkie cząsteczki będą ujemnie naładowane, co po
0,25M Na2HPO4 (pH 7,2)
przyłożeniu pola elektrycznego spowoduje ich migrację w
1mM EDTA
stronÄ™ dodatniego bieguna.
20% SDS
0,5% odczynnik blokujÄ…cy,
PAGE
- po zakończeniu prehybrydyzacji wymienić roztwór na
Jeśli zdenaturowane białka umieścimy w polu elektrycz-
nowÄ… porcjÄ™ zawierajÄ…cÄ… wyznakowanÄ… sondÄ™.
nym wszystkie przemieszczÄ… siÄ™ w stronÄ™ dodatniego
- hybrydyzację prowadzić przez noc w temperaturze 68oC,
bieguna z tą samą prędkością, niezależnie od swojej wiel-
- po hybrydyzacji płukać filtr 3 razy w temperaturze 68o C
kości.
w roztworze zawierajÄ…cym:
Aby białka mogły poruszać się z prędkością zależną od
20mM Na2HPO4
wielkości cząsteczki rozdziela się je w poliakrylamidzie,
1mM EDTA
który jest polimerem zbudowanym z monomerów akry-
1% SDS
lamidowych. W trakcie polimeryzacji, monomery akryla-
-następnie przepłukać krótko w temperaturze pokojowej
midowe tworzą żel poliakrylamidowy, który staje się śro-
buforem do płukania II:
dowiskiem rozdziału białek po przyłożeniu pola elek-
0,1M kwas maleinowy (pH 8,0)
trycznego, stÄ…d nazwa  ang. PolyAcrylamide Gel Elec-
3M NaCl
trophoresis (PAGE). Poliakrylamid zbudowany jest z sieci
0,3% Tween20
labiryntów o korytarzach różnej średnicy. W tak skonstru-
owanym środowisku małe cząsteczki szybciej osiągną
Wywołanie
dodatni biegun niż większe cząsteczki białka.
Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej stosowany i
Przeciwciała skierowanie przeciwko digoksygeninie sko-
może być użyty jako oddzielna metoda analityczna lub
niugowane z alkaliczną fosfatazą rozcieńczyć w stosunku
stanowić element szeregu dalszych, bardziej skompliko-
1:10 000 w buforze blokującym (bufor do płukania II plus
wanych badań (np. elektroforeza dwuwymiarowa, prepara-
0,5% odczynnik blokujący). Przygotować 10 ml powyż-
tywna, Western blotting).
szego roztworu na jednÄ… membranÄ™. MembranÄ™ inkubo-
Standardowo SDS PAGE jest używana w wersji tzw. disc
wać przez 1 godzinę mieszając a następnie przepłukać trzy
electrophoresis (ang. discontinuous pH), umożliwiającej maksy-
razy buforem do płukania II.Membranę zrównoważyć w
malne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody.
buforze substratowym dla alkalicznej fosfatazy (0,1 M
W praktyce ta  nieciągłość dotyczy zarówno żelu, który
Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl ). Dodać po
2
15
składa się jakby z dwóch warstw, jak również buforu - bufor do próbek (60mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10%
zastosowanego do przygotowania żelu: innego dla górnej i glicerol, 0.025% Bromophenol Blue)
innego dla dolnej warstwy żelu. Próbki nakładane na żel w - roztwór do barwienia (0.2% Coomassie Brillant Blue G-
tym układzie mogą mieć stosunkowo dużą objętość, po- 250, 40% metanol, 10% kwas octowy)
nieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu - roztwór do odbarwiania (10% metanol, 7% kwas octo-
zostają zagęszczone do wąskiego pasma, które w dolnym wy)
żelu rozdziela się na pojedyncze,  ostre prążki.
W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS PAGE na
Wylewanie żelu
zasadzie filtracji, analogicznie do metody chromatogra-
ficznej sÄ…czenia molekularnego.
Idealnie czyste szyby należy złożyć, umieszczając między
Ponieważ frakcjonowanie zachodzi w zależności od dłu-
nimi przekładki (ang. spacers) o odpowiedniej grubości i
gości łańcucha polipeptydowego, można ustalić masę
uszczelnić zestaw. Szyby powinny być ściśnięte spinaczami
danego białka przez porównanie z odpowiednimi standar-
lub umieszczone w specjalnym statywie do wylewania żeli
dami. Jest to metoda pozwalajÄ…ca na oznaczenie masy
(w zależności od zestawu).
białka z dokładnością, do 5-10%, ale niestety nie każdy
polipeptyd można w ten sposób scharakteryzować (jed-
Aby wylać żel poliakrylamidowy, należy zmieszać składni-
nym z wyjątków są białka histonowe).
ki w następujących proporcjach:
- dla 12% żelu rozdzielającego:
Ćwiczenie będzie zawierało następujące elementy:
6ml mieszaniny monomerów
- krótkie wprowadzenie w techniki elektroforezy białek,
3.6ml 1.5M Tris-Cl pH 8.8
- nauka wylewania żelu poliakrylamidowego,
150µl 10% SDS
- prosta ekstrakcja białek z materiału roślinnego,
5.25 ml wody
- prowadzenie elektroforezy w układzie z SDS,
50µl 10% APS
- wybarwianie części żelu po zakończeniu elektroforezy,
10µl TEMEDu (objÄ™tość koÅ„cowa ok.15ml)
- wykonanie westernu z pozostałą częścią żelu.
Zwykle przed dodaniem katalizatorów (APS i TEMED)
zaleca się odpowietrzenie mieszaniny. Roztwór APS nale-
Izolacja białek z materiału roślinnego
ży przygotować na świeżo. Katalizatory dodaje się tuż
przed wylaniem mieszaniny pomiędzy szyby. Od razu po
Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są
dodaniu katalizatorów polimeryzacji roztwór należy wy-
bardzo różnorodne i ich wybór zależy m.in. od właściwo-
mieszać i przy pomocy pipetki nalać między szyby (pamię-
ści danego białka. Poniżej podana została procedura po-
tając o zostawieniu miejsca na żel zatężający). Na wierzch
zwalająca na małoselektywną ekstrakcję szeregu białek z
żelu naÅ‚ożyć cienkÄ… warstwÄ™ (kilkaset µl) n-butanolu wy-
liści roślin (tu: tytoniu).
syconego wodÄ….
- dla żelu zatężającego:
Wykonanie
0.65ml mieszaniny monomerów
- ok. 1g liści tytoniu zamrozić w ciekłym azocie i utrzeć w
1.2ml 0.5M Tris-Cl pH 6.8
moz
dzierzu na proszek
120µl 10% SDS
- proszek przenieść do zlewki na 50ml i zalać 6ml buforu
3ml wody
10mM Tris-Cl pH 8
25µl 10% APS
- zawiesinę przenieść do homogenizatora Pottera-
5µl TEMED (objÄ™tość koÅ„cowa ok. 5ml)
Elvehjema i  homogenizować kilkukrotnie przesuwając
Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego należy osuszyć
tłoczek
jego górną część przy pomocy bibuły, a następnie wylać
- z roztworu należy pobrać próbki o różnej objętości
żel zatężający. Grzebień trzeba umieścić w żelu zatężają-
(podane poniżej) do naniesienia na żel
cym tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powie-
trza. Żel zostawić na noc (ew.- jeśli nie mamy tyle czasu -
Uwaga ! Wszystkie czynności należy wykonywać w temp.
tak długo, jak to jest możliwe)
0 do 4OC. Roztwór do homogenizacji powinien zawierać
Przed elektroforezą żel (pomiędzy szybami) umiesza się w
fluorek fenylometylosulfonowy (PMSF) w stęż. 1mM.
aparacie i zalewa buforem elektrodowym. Po ostożnym
wyjęciu grzebienia z żelu nie można zapomnieć o prze-
Przygotowanie żelu do SDS PAGE
płukaniu studzienek i  wygonieniu pęcherzy powietrza
spomiędzy szyb w dolnej częćci żelu.
Roztwory potrzebne do przeprowadzenia elektroforezy:
- mieszanina monomerów (30% akrylamid, 0.8% bisakry-
Przygotowanie próbek do naniesienia na żel
lamid) przefiltrowana przez filtr 0.45 um; roztwór należy
przechowywać w lodówce w ciemnej butelce
Wykonanie
Uwaga ! Roztwór akrylamidu jest silną neurotoksyną!
- do ponumerowanych probówek Eppendorfa dodać
- 1.5M Tris-Cl pH 8.8
ekstrakt z liści tytoniu, wodę i bufor do próbek w/g
- 0.5M Tris-Cl pH 6.8
schematu:
- 10% SDS
- TEMED
- 10% nadsiarczan amonu (APS)
- bufor do elektroforezy (25mM Tris, 192mM glicyna, ekstrakt [µl] woda [µl] bufor [µl] obj.caÅ‚k. [µl]
0.1% SDS pH 8.3); przygotowano bufor 5×stężony 1. 2 8 10 20
2. 5 5 10 20
16
3. 10 - 10 20 (np.: kazeinę) wszystkich pozostałych jeszcze na
4. 20 - 20 40 membranie miejsc wiązania białka.
- do każdej próbki dodać po 1ul 2-merkaptoetanolu inkubacja membrany z tak zwanym przeciwciałem
- próbki należy zamieszać i zwirować (5 sekund) pierwszorzędowym
w mikrowirówce Membranę inkubuje się z przeciwciałem pierw-
- inkubować preparaty przez 4 minuty w 95OC szorzędowym, które rozpoznaje na membranie
- nanieść próbki na żel i rozpocząć elektroforezę szukane białko i przyłącza się do niego.
W razie potrzeby w analogiczny sposób można przygoto- inkubacja membrany z tak zwanym przeciwciałem
wać próbki ze standardem wielkosci białek.
drugorzędowym
MembranÄ™ inkubuje siÄ™ z roztworem zawierajÄ…-
cym przeciwciała drugorzędowe które skierowa-
Elektroforeza
ne są przeciwko fragmentom stałym (Fc) prze-
ciwciał pierwszorzędowych. Dodatkowo prze-
Warunki natężenia i napięcia, przy których prowadzona
ciwciała te są sprzężone z enzymem np. z alka-
jest elektroforeza, są zależne od grubości i długości żelu
liczną fosfatazą, co umożliwia łatwą lokalizację
oraz naszych oczekiwań co do jakości i czasu rozdziału
powstałego kompleksu epitop-przeciwciało
białek.
pierwszorzędowe-przeciwciało drugorzędowe.
Zwykle zalecane jest stałe natężenie prądu w granicach 12-
wywołanie Westernu
30 mA / 1mm grubości żelu.
MembranÄ™ inkubuje siÄ™ z substratami dla enzymu
sprzężonego z użytym przeciwciałem.
Barwienie prążków na żelu
Odczynniki:
Spośród wielu metod barwienia białek po SDS PAGE
-Bufor Anodowy I (0.3 M Tris, pH 10.4, 10% (v/v) meta-
wybrano najpowszechniej stosowaną (choć nie najczulszą)
nol),
metodÄ™ barwienia Coomassie Brillant Blue.
-Bufor Anodowy II (25 mM Tris, pH 10.4, 10% (v/v)
metanol),
Wykonanie
-Bufor Katodowy (25 mM Tris, 40 mM glicyna, 10% (v/v)
- po zakończeniu elektroforezy należy rozmontować apa-
metanol, pH 9.4)
rat i delikatnie rozdzielić szyby
-bufor TBS (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl)
- odciąć część żelu i umieścić w roztworze barwnika i
-Bufor substratowy (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl,
zostawić na kołysce laboratoryjnej na 0.5 do 1 godziny
50mM MgCl )
2
- po tym czasie zlać barwnik do butelki (może być używa-
-BCIP 50mg/ml w 100% DMF
ny wielokrotnie) i żel inkubować w roztworze odbarwiają-
-NBT 100mg/ml w 70% DMF
cym aż do uzyskania prawie przezroczystego tła i wyraz
-
nych prążków białek
Wykonanie:
- żel po odbarwieniu może być długo przechowywany w
roztworze 7% kwasu octowego
UWAGA: Wszystkie czynności związane z układa-
niem i wywołaniem Westernu wykonujemy w ręka-
Należy pamiętać o tym, że jakość rozdziału w SDS PAGE
wiczkach.
zależy od poprawnego i solidnego wykonania szeregu
prostych czynności. Dlatego też mimo, iż technika nie jest
Delikatnie otworzyć szybki w których rozwijano żel, zmie-
skomplikowana, może zajmować sporo czasu, kilkakrotnie
rzyć rozmiar części żelu rozdzielającego przeznaczonej do
więcej niż elektroforeza agarozowa służąca do rozdziału
transferu.
preparatów DNA.
Żel rozdzielający namoczyć minimum 15 minut w buforze
katodowym
WESTERN
Wyciąć sześć kawałków bibuły Wathman 3MM i jeden
kawałek membrany Immobilon-P o wymiarach żelu.
"Western Blot" to technika wykorzystująca przeciwciała
Namoczyć:
do analizy białek rozdzielonych uprzednio w żelu polia-
-trzy kawałki bibuły Wathmana w buforze katodowym
krylamidowym. Technika Western blot jest najczęściej
-dwa kawałki bibuły Wathmana w buforze anodowym I
używana w połączeniu z metodą SDS-PAGE i opiera się
-jeden kawałek bibuły Wathmana w buforze anodowym II
na specyficznej reakcji antygenu z przeciwciałem. W me-
Wyciętą membranę Immobilon-P moczyć w metanolu
todzie tej można wyróżnić kilka etapów:
przez 15 sekund,
transfer rozdzielonych w żelu białek na specjalną
następnie przekładamy do pojemnika z wodą de-
membranÄ™
stylowanÄ… i moczymy 2 minuty,
Istnieje kilka stosowanych metod transferu białek
membranę przełożyć do buforu anodowego II i
z żelu na membranę. Jedną z nich jest transfer
inkubować minimum 5 minut
pół-suchy (semi-dry). W metodzie tej wykorzy-
Ułożyć kanapkę jak na rysunku.
stuje się przepływ prądu w poprzek żelu i mem-
Wyliczyć natężenie według wzoru 4mA na cm2 żelu
brany, co powoduje przejście białek z żelu i
Transfer prowadzić 15 minut przy natężeniu 4mA na cm2
zwiÄ…zanie na powierzchni membrany.
żelu.
blokowanie membrany
Rozebrać kanapkę żel wyrzuć a membranę Immobilon-P
Etap blokowania membrany polega na zabloko-
moczyć 10 sekund w metanolu.
waniu/wysyceniu przez dodane przez nas białko
17
Membranę suszyć na czystym kawałku bibuły Whatman podczas dodatkowej inkubacji w 70% Et-OH w 370C
około 15 minut. przed dwa dni lub w 500C przez 1h.
Wysuszoną membranę inkubować z rozcieńczonym Metoda barwienia GUS`a wykorzystuje bardzo dużą od-
1:1000 w buforze (5%mleko odtłuszczone w TBS) prze- porność GUS`a na działanie czynników degradujących
ciwciałem pierwszorzędowym. Inkubację prowadzić 30 (endogenne proteazy) i denaturujących białko. Istnieją
minut w temperaturze pokojowej na bujawce. modyfikacje tej metody pozwalajÄ…ce na barwienie GUS`a
Membranę przepłukać 2 razy TBS'em i inkubować z roz- na skrawkach uzyskanych z utrwalonego materiału.
cieńczonym 1:10 000 w buforze (5%mleko odtłuszczone
w TBS) przeciwciałem drugorzędowym. Inkubację pro- Wykonanie
wadzić 30 minut w temperaturze pokojowej na bujawce. Na poprzednich ćwiczeniach uzyskaliście rośliny ekspry-
Membranę delikatnie przepłukać 3 razy TBS'em i zalać mujące ten enzym w tkankach wykazujących ekspresję
uprzedno przygotowanym i ogrzanym do temp. około genu AtSWI3B.
370C buforem substratowym z dodatkiem 45µl BCIP i
" Obcięte kawałki roślin długości nie więcej niż
45µl NBT.
1cm zanurzamy w roztworze barwiÄ…cym i ca-
Po pojawieniu się prążków reakcję zatrzymać płucząc
łość wkładamy do eksykatora.
membranÄ™ w wodzie.
" Załączamy próżnię na 2-3 minuty, pięć razy.
" Infiltrowane rośliny inkubujemy w 370C przez
DETEKCJA GUSa
1,5h.
" Rośliny przekładamy do 70% ET-OH i inkubu-
Barwienie histochemiczne GUS to technika powszechnie
jemy w 500C przez 1h.
stosowana nie tylko w badaniach roślin. Metoda ta opiera
Należy dokładnie obejrzeć rośliny pod binokularem,
siÄ™ na detekcji kolorowego (ciemnoniebieski) produktu
zwracając uwagę czy we wszystkich roślinach wzór bar-
dziaÅ‚ania enzymu ß-glucuronidazy (GUS). Reakcja bar-
wienia jest identyczny.
wienia jest bardzo prosta i polega na zanurzeniu roślin
eksprymujÄ…cych gen GUS w roztworze barwiÄ…cym i po-
traktowaniu zanurzonych roślin próżnią co przyspiesza
wnikanie roztworu barwiącego do wnętrza tkanek. Roz-
twór barwiący zawiera bezbarwny substrat X-gluc. Infil-
trowane rośliny pozostawia się w roztworze barwiącym w
370C na 1,5h do 12h. Następnie często usuwa chlorofil
Transfer tradycyjny
Metoda szybkiego transferu na Immobilon-P
katoda
katoda
-
trzy kawałki bibuły namoczo-
trzy kawałki bibuły namoczone w buforze
ne w buforze do transferu
katodowym
żel
żel
membrana
membrana
bibuła namoczona w buforze anodowym II
trzy kawałki bibuły namoczo-
dwa kawałki bibuły namoczone w buforze
ne w buforze do transferu
anodowym I
anoda
+
anoda
18
Prepare binding column
Add 500µl Column Preparation Solution to column
and centrifuge 1 min. Discard flow trough.