BIOLOGIA MOLEKULARNA  2012
Podstawy genetyki
Mutacja homo-/heterozygotyczna -> występuje w obydwu/w jednym allelu z pary
Dlaczego różnimy się między sobą liczbą powtórzeń minisatelit?
Ł� Poślizg polimerazy DNA na nici matrycowej
Metoda PCR  powielanie fragmentu DNA
VNTR  polimorfizm liczb tandemowych powtórzeń
Telomery powtarzają się tandemowo. Telomeraza jest odwrotną transkryptazą. Zawiera fragment RNA, który
jest matrycą. Jest więc również nukleoproteiną. Telomery skracają się na tej samej zasadzie, co są
syntetyzowane fragmenty Okazaki  polimeraza DNA nie może wypełnić luk powstałych na końcach 5
liniowych cząsteczek DNA (nie ma tam też starterów).
Ekspresja genu  kolejne etapy oraz alternatywny splicing.
Redagowanie mRNA  u wirusów  zamiana pojedynczych nukleotydów w transkrypcie.
Przy badaniach mRNA przepisuje się na cDNA i na tym materiale można już pracować (jest trwały w
przeciwieństwie do mRNA  pomyśl o wadach tej metody)
Przez proteolityczną obróbkę dojrzewa insulina, peptydy trawienne.
Regulacja ekspresji genów.
Promotor  leży przed egzonem, przyłączanie się polimerazy RNA.
Wzmacniacze i wyciszacze  fragmenty DNA, do których przyłączają się czynniki transkrypcyjne. Mogą być
przed promotorem blisko lub daleko.
Epigenetyczne wyciszanie ekspresji  zmiana struktury chromatyny  rozluz
nianie lub zagęszczanie
Ł� metyzacja  zmetylowane DNA nie ulega ekspresji, bo brak dostępu dla enzymów transkrypcyjnych
Ł� Acetylacja  luz
ne, metyzacja = antyacetylacja
Mutacja w promotorze może mieć wpływ na ekspresję genów, ale nie na kolejność aminokwasów.
Dystrofina łączy się z błoną, ma wpływ na jej przepuszczalność. Gen dystrofiny jest największy. Dystrofia
mięśniowa Beckera  łagodniejsza, Duchenna ciężka  nie zawsze im większa delecja tym gorszy efekt.
Mutacje dynamiczne (choroba Huntingtona [sekwencja kodująca], zespół łamliwego chromosomu X
[sekwencja niekodująca, FMR1  rozwój synaps]) -> zjawisko antycypacji
Premutacja  nosicielstwo, bez ujawnienia się choroby.
Izochromosomy  wadliwe chromosomy powstałe z połączenia 2 jednakowych ramion (ma to miejsce
zazwyczaj podczas podziału tetrady). Może być letalny.
Translokacje w nowotworach  chromosom Philadelfia
Polimorfizm genetyczny (różne odmiany tego samego genu, bez patologii, ale mogą być czynnikami ryzyka, np.
choroba Alzheimera) a mutacja (wywołuje chorobę)
Polimorfizm (>1%) różni się od mutacji (<1%) częstością występowania w populacji.
Różne sposoby dziedziczenia chorób.
Penetracja mutacji - % osób, które mają mutację i chorują.
Apoptoza i starzenie się
Białko RB1 nieufosforylowane wiąże czynnik transkrypcyjny E2F, który pośredniczy w syntezie DNA.
p53 jest aktywne gdy ufosforylowane (jest czynnikiem transkrypcyjnym dla białek naprawczych DNA)
Mdm2  ligaza kontrolująca stężenie białka p53
Fosfatydyloseryna  marker apoptozy komórek
Inhibitory i prodomeny kaspaz! Kaspazy procesu mitochondrialnego i wewnątrzpochodnego!
Białko Bid (ważne!)
Białka Bcl-2 i ich domeny, umiejscowienie (np. zew. bł. mitochondrialna)
FADD  białko adaptorowe, pośredniczy pomiędzy DR a prokaspazą.
Zmiana ekspresji białek Bcl-2 może korelować ze złym rokowaniem w przypadku nowotworów piersi,
hemopoetycznych.
PTEN  delecja i mutacja
Choroba Alzheimera
APP  trawione przez sekretarzy, powstaje nierozpuszczalny beta-amyloid, presenilina 1 i 2 (rodzinne)
Czynnik ryzyka  apoE
Zaburzenie stężenia Ca2+ - związane z ER
Choroba Parkinsona
Nowotwory  eliminacja p53 (białko supresorowe)  bardzo z
le rokują
Hormeza  to zjawisko, w którym czynniki toksyczne, w małych dawkach działają pozytywnie, wydłużają życie,
np. promieniowanie jonizujące
Atypowy zespół Wernera  mutacja genu laminy A, fenotypowo coś pomiędzy HG a typowym zespołem
Wernera.
Podstawy ontogenezy
Najpierw mutują geny supresorowe, a póz
niej onkogeny.
BRCA  gen supresorowy - naprawa DNA
Nowotwory sporadyczne to NIE są nowotwory rodzinne
Mitogeny  pobudzają proliferację
Amplifikacja  zwielokrotnienie kopii genu, często czynników wzrostu i ich receptorów (w nowotworzeni, rak
piersi)
Badania mikromacierzowe
Wykorzystanie miRNA w diagnozowaniu nowotworów i mutacji w organizmie (próby z diagnozowaniem raka
jelita grubego w fazie utajonej  Dania)
Stwardnienie guzowate (TSC)  głównie niezłośliwe, ale problematyczne leczenie  hamartyna i tuberyna
Ł� leczenie rapamycyną
Biotechnologia w medycynie, terapia genowa
Białko rekombinowane jest produktem ekspresji rekombinowanego DNA.
Białko GFP  zielone białko fluorescencyjne (tworzenie genów  białek fuzyjnych)
Hb  świnia
Interferon - kura
Mechanizm wykorzystania promotorów i czynników wzrostu tkankowo specyficznych.
Ksenotransplantacje  problemy
Ł� antygen Gal  glikolipidy (wymagana redukcja poziomu)
obniżenie ekspresji u dawcy
wywołanie tolerancji u biorcy
Ruppy  pies transgeniczny, świeci na czerwono w świetle UV
Dr Ian Wilmut  twórca Dolly
Dlaczego klon i oryginał nie są identyczne?  epigenetyka
Tytoń transgeniczny jest BARDZO popularny.
Epitopy i białka  rośliny transgeniczne  szczepionka (np. sałata)
Szczepionki nowej generacji:
Ł� wyeliminowane skutki uboczne i prawdopodobieństwo mutacji patogenów
Ł� bezpieczeństwo produkcji
Ł� ekonomia
Tradycyjna atenuacja a atentacja genetyczna
Zrekombinowane niepatogenne bakterie i wirusy jako żywe wektory  szczepionka DNA.
Szczepionki  na miarę
Sprawdz
 onkogenne działanie retrowirusów.
Podstawowe techniki biologii molekularnej i ich zastosowanie
Anemia sierpowata zdiagnozowana za pomocą hybrydyzacji (na błonie nylonowej)  ważny krok w
biotechnologii
Hybrydyzacja punktowa (kroplowa)  np. wykrywanie mukowiscydozy
Zastosowanie FISH:
Ł� wady genetyczne
Ł� diagnostyka preimplantacyjna
Ł� cytogenetyka onkologiczna (wybór terapii w białaczkach)
Ł� mapowanie genów
Mikromacierze pozwalają wykryć wiele tys. genów (wiele sond) -> ocena ekspresji, polimorfizmu,
identyfikowanie delecji, duplikacji  cDNA  np. diagnostyka raka piersi  badanie 70 genów (i ich ekspresji)
odpowiadających za wznowę
PCR (w termocyklerach)
Jony Mg2+ katalizują przyłączanie starterów. Projektując startery możemy przewidzieć długość produktu PCR.
PCR  RLFP  dł. fragmentów restrykcyjnych, np. anemia sierpowata
Nested  PCR (zlokalizowany PCR)  zwiększenie specyficzności i czułości, wykrywanie wirusów, np. EBV
ASP (Allele Specific PCR)  detekcja znanej mutacji lub polimorfizmu, analiza SNP (Single Nucleotide
Polymorphism)
RT  PCR (reverse transcriptase)  analiza ekspresji (ekspresja tyreoglobuliny  rak brodawkowaty tarczycy),
przerzuty (marker tyrozynazy  czerniak), wirusy RNA
Real Time PCR  w czasie rzeczywistym  sondy (fluor ochrom i wyciszacz), ocena ilości wirusów, kopii genów
PCR  SSCP (polimorfizm konformacyjny pojedynczych nici)  wykrywa ok. 80% mutacji, metoda przesiewowa,
wychodzi z mody
PCR  HDA (heterodupleks)  metoda przesiewowa
Western Blotting
14-3-3 -> nieswoisty marker rozpadu neuronów w chorobie Creutzfelda-Jacoba