Biologia molekularna Wykłady UMCS

Biologia molekularna
dla studentów II roku biologii
Aleksandra Boguszewska
Zakład biologii molekularnej p 7A
godz. konsultacji piątek 12.00-14.00
bogusz@hektor.umcs.lublin.pl
Tematy wykładów z biologii molekularnej
- wprowadzenie do biologii molekularnej: definicja, historia: budowa i funkcja DNA, RNA: od
genu do białka: dogmat biologii molekularnej, kod genetyczny, budowa białek
- wybrane metody oczyszczania i analizy białek
- organizacaj genomu: genom bakteryjny, genom eukariotyczny jądrowy, chloroplastowy i
mitochondrialny, eukariotyczne wirusy DNA i wirusy RNA:
- Ekspresja genów: transkrypcja, dojrzewanie RNA, transport przez błonę jądrową, translacja,
fałdowanie i degradacja białek, regulacja ekspresji genów:
- cykl komórkowy i jego regulacja
- apoptoza
- biologia molekularna w medycynie: choroby mitochondrialne i nowotworowe, przeciwciała jako
narzędzie w biologii molekularnej i wspólczesnej medycynie.
Tematy ćwiczeń z Biologii Molekularnej
dla II roku Biologii
- zapoznanie z pracownią biologii molekularnej, przepisy BHP, obliczenia biochemiczne
- charakteystyka chemiczna kwasów nukleinowych
- izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cervisiae
- amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B drożdży Saccharomyces cervisiae
- 5-6 transfer genów do komórek ssaczych transfekcja, obserwacje w mikroskopie konfokalnym
(wykł 10 marca obecność obowiązkowa, 17-18 marca ćw � gr, 24-25 marca ćw. druga � gr.)
- izolacja RNA z komórek drożdży
- elektroforetyczna analiza RNA
- transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych
- cykl życiowy drożdży Saccharomyces cervisiae koniugacja
- cykl życiowy drożdży Saccharomyces cervisiae sporulacja
- 11 a. badanie wplywu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych
- cykl życiowy drożdży S. cervisiae otrzymanie pokolenia haploidalnego drożdży po sporulacji
- wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych
- identyfikacja inhibitora trombiny metodą eletroforezy w warunkach niedenaturujacych
Podręczniki:
- Biologia molekularna, krótkie wykłady, wyd 3 P. Turner i in., PWN, 2011
- Podstawy biologii molekularnej L.A. Wilson, WUW, 2009;
- Genomy, wyd 2 T.A. Brown, PWN, 2009
- Nature; Cell; Trends in Biochemical Sciences (TiBDS); Postępy Biochemii.
Historia biologii molekularnej
384 322 p.n.e. - Arystoteles ogłasza teorię pangenezy (cechy dziedziczne są zawarte i
przenoszone w gemulach z poszczególnych komórek ciała)
1866 r. - G. Mendel (ojciec wspólczesnej genetyki) publikuje swoją pracę na temat dziedziczenia
cech u grochu
1869 r F. Miescher izoluje bogatą w fosfor substancję zwaną nukleiną z jąder krwinek białych
1875 r. - E.Strasburger opisuje twory, zwane pózniej chromosomami
1929 r. - P.A. Levene charakteryzuje i nazywa kwas rybonukleinowy i kwas
deoksyrubonukleinowy
1938 r pojawia się wiele badań nad bialkami i DNA z wykorzystaniem krystalografii
rentgenowskiej, W. Weaver proponuje termin biologia molekularna;
1950 r. - E. Chargaff pokazuje że ilości zasad T i A oraz C i G w DNA są równe;
1952 r A. Hershey i M. Chase wykorzystują badania nad bakteriofagiem T2, by potwierdzić że
DNA jest nośnikiem informacji genetycznej
1952 r Maurice Wilkins i Rosalind Franklin, wykorzystując krystalografię rentgenowską,
wyjaśniają, że w DNA znajdują się struktury powtarzające się
1953 r Francis Crick i James Watson prezentują DNA jako helisę złożoną z dwóch nici
powiązanych wiązaniami wodorowymi
DNA jest materiałem genetycznym; każdy chromosom jest pojednynczą cząsteczką DNA; geny
są fragmentami sekwencji DNA.
Biologia molekularna
Nauka podstawowa zajmująca się badaniem struktury i funkcji makromolekul, przede wszystkim
białek i kwasów nukleinowych. Zazębia się ona z takimi dziedzinami wiedzy jak genetyka,
biochemi, biofizyka czy cytologia.
Wiliam Astbury w Nature (1961) opisał, że biologia molekularna: (& ) jest szczególnie
zainteresowana formami biologicznych cząsteczek, ich trójwymiarową strukturą, genezą i ich
funkcjonowaniem .
DNA jest polimerem zbudowanym z powtarzających się jednostek zwanych nukleotydami (dNTP:)
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Długość komórkowych cząst. DNA może sięgać kilkaset milionów nukleotydów, długość
dwuniciowej cząst. DNA wyraża się liczbą par zasad (pz) kilo par zasad (kpz) lub milion pz
(mpz). W laboratoriach często wykorzystuje się krótkie łańcuchy jednoniciowego DNA, zazwyczaj
krótsze niż 50 nt, określane mianem oligonukleotydów
dNTP
deoxyribonucleotide triphosphate - deoksyrybonukleotydotrifosforan
do deoksyrobozy dołączona zasada azotowa (base) A, T, G, C - w pierwszym węglu, w piątym
trifosforan, w trzecim OH.
Formy przedstawienia podwójnej helisy DNA
A w środku os, na zewnatrz szkielet fosfocukrowy, do środka zasady połączone wiązaniami
wodorowymi
B widoczne jest ulożenie warstwowe zasad w podwójnej helisie DNA, na zewnątrz szkielet
fosfocukrowy
C forma wstęgowa szkielet fosfocurkowy w postaci podwojnej wstęgi, pomiędzy nimi łączą się
wiązaniami wodorowymi komplementarne zasady A i T, C i G, tworzą się duży rowek i mały
rowek.
Formy dwuniciowej helisy DNA
A- DNA B-DNA Z-DNA
Kierunek skrętu Prawoskrętna Prawoskrętna Lewoskrętna
Duży rowek Głęboki i wąski Średnio glęboki, szeroki Płytki, w zasadzie
nieobecny
Mały rowek Płytki i szeroki Średnio glęboki, wąski Bardzo głęboki, wąski
Liczba par zasad na
pełny obrot helisy 11 10,5 12
Dwuniciowa cząsteczka DNA może podlegać odwracalnemu rozpleceniu do pojedycznych nici
Natywny DNA (podwójna helisa) podgrzanie, OH-, formamid Zdenaturowany DNA
(Statystyczny kłębek)
Temperatura topnienia (Tm) DNA to taka temp., przy której 50% podwójnej helisy DNA jest
rozpleciona do pojedynczych nici
DNA w sztuce bio art.
Malowanie chromosomu, podwójnej helisy, srebry łańcuszek na cześć zmarłej na białaczkę
Rosalind Franklin.
Budowa RNA
Cząsteczka RNA jest liniowym polimerem zbudowanym z nukleotydów połączonych ze sobą
wiązaniami fosfodiestrowymi
DNA cząsteczka dwuniciowa, występujące zasady
C cytozyna
G guanina
A adenina
T tymina
Deoksyryboza wodór w pozycji 2'
RNA cząsteczka jednoniciowa, występujące zasady
C cytozyna
G- guanina
A- adenina
U - uracyl
Ryboza OH w pozycji 2'
Struktury drugorzędowe RNA
Drugorzędowa struktura RNA charakteryzuje się obecnością podwójnej helisy typu A oraz
jednoniciowych pętli, które można podzielić na:
struktury spinki do włosów (ang. hairpins)
wybrzuszenia (ang. bulges)
pętle wewnętrzna (ang. internal loop)
połączenia (ang. junctions)
Rodzaje par zasad zidentyfikowane w dwuniciowych helisach RNA
Kanoniczne pary zasad typu Watson-Crick: AU; GC
Niekanoniczne pary zasad (ponad 20 różnych typów), najczęściej spotykane to:
GU (ang. wobble GU); GA (ang. sheared, po polsku tzw. nożycowa)
Oddziałujące trójki zasad w RNA
Trójki zasad mają zwykle praę oddziałującą w sposób klasyczny, zgodnie z zasadami par typu
Watson-Crick a trzecia zasada oddziałuje wieloma różnymi, niekonwencjonalnymi sposobami,
Niekanoniczne pary oraz trójki zasad są ważnymi elementami procesow zwijania się RNA i
oddzialywań RNA-białko i RNA-ligand.
Motywy struktury trzeciorzędowej RNA
cząsteczka tRNA wygląda tak, jakby Natura chciala zmusić cząsteczki RNA do wykonywania
zadań przeznaczonych dla bialek - F. Crick (1966)
Zidentyfikowano liczne, bardzo zachowawcze i złożone motywy strukturalne RNA,
m.in. pseudowęzły, zwroty K
Rodzaje i funkcje RNA w komórce
Cały RNA:
-kodujący (4%)
RNA kodujący pre-mRNA (hnRNA, heterogenny nuklearny RNA) kom eukariotyczne -
>mRNA
- niekodujący (96%)
pre-rRNA rRNA
pre-tRNA tRNA
w komórkach eukariotycznych występują także
snRNA, - small nuclear RNA, potrzeby do dojrzewania mRNA
snoRNA mały jąderkowy RNA, potrzebny do dojrzewania rRNA
scRNA mały cytoplazmatyczny RNA, np. siRNA, mikroRNA
w komórkach bakteryjnych występuje także:
tmRNA RNA trochę jak tRNA, a trochę jak mRNA
Większość RNA występuje w kompleksach RNA-białko zwanych cząstkami
rybonukleoproteinowymi (RNP)
Komórka bakteryjna zawiera 0,05 0,1 pg RNA co stanowi ok. 6% jej masy
Komórka ssaków jako większa zawiera 20-30 pg RNA.
Funkcje RNA w komórce
- RNA może służyć jako rusztowanie na którym osadzają się białka, np. cząstka sygnałowa
SRP;
- oddziaływania RNA-białko mogą wpływać na aktywność katalityvzną białek, np. telomeraza.
- krótkie cząsteczki RNA mogą bezpośrednio kontrolować ekspresję genów, np.
ryboprzełączniki, RNA związane z interferencją RNA (RNAi);
- RNA może być materiałem dziedzicznym, np. wirusy RNA
- RNA może być katalizatorem reakcji chemicznych, tzw, rybozymy.
Katalityczne RNA rybozymy
Samowycinające się introny introny grupy I i II
Rybonukleaza P enzym który wytwarza końce 5' bakteryjnych tRNA składa się z podjednostek
RNA i podjednostek białkowych, przy czym aktywnośc katalityczną ma RNA
RNA rybosomowy aktywność transferazy pepdtydylowej potrzebna do wytworzenia wiązania
peptydowego w czasie syntezy białka jest związana z dużym
rRNA
Spliceosom kompleks rybonukleoproteinowy biorący udział w splicingu pre-mRNA
Genomy wirusowe podczas replikacji genomów RNA niektórych wirusów następuje
autokatalityczne przecięcie łańcuchow nowo zsyntetyzowanych genomów. Przykładem są wiroidy
roślinne (rybozymu typu: hammerhead, hairpin), wirusoidy i zwierzęcy wirus zapalenia wątroby
delta (HDV)
1958 Sformułowanie centralnego dogmatu biologii molekularnej przez Francisa Cricka
Central Dogma of Molecular Biology by Francis Crick
The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by-residue transfer of
sequential information.
Informacja genetyczna, która zawarta jest w DNA w większości przypadków przenoszona jest z
DNA na DNA w procesie replikacji, następnie z DNA na RNA w procesie transkrypcji i z RNA na
białko w procesie translacji (biosyntezy białka)
General Special Unknown
DNA-DNA RNA-DNA Protein-DNA
DNA-RNA RNA-RNA Protein-RNA
RNA-Protein DNA-Protein Protein-Protein
Podstawowy przepływ informacji w komórce
DNA (transkrypcja) RNA (translacja) Białko
DNA i RNA stanowią genotyp - język nukleotydów
Białko stanowi o fenotypie - język aminokwasów
Rybosom pełni funkcję tłumacza genotypu na fenotyp
Informacja genetyczna zawarta jest w DNA w poszczególnych genach.
Gen fragment funkcjonalny cząsteczki DNA kodujący białko bądz funkcjonalną cząsteczkę
RNA.
Geny nawinięte na chromosom.
Kod genetyczny
Mamy podwójną helisę DNA która ma ulec transkrypcji, musi ona ulec rozpleceniu, na jednej z
nici syntetyzuje się RNA, jeżeli ma potem powstać z tego bialko to mRNA, trzy kolejne
nukleotydy w mRNA stanowią kodon są one tłumaczone na jeden aminokwas, synteza lańcucha
aminokwasowego powstaje białko, fałduje się.
Kod genetyczny jest trójkowy
61 kodonów koduje 20 podstawowych aminokwasów (ogólnie w komórce występuje 100
aminokwasów powstających na drodze modyfikacji podstawowych0 kod jest zdegenerowany
kilka kodonów kilka kodonow może kodowac ten sam aminokwas
Tylko metionina jest kodowana przez jeden kodon AUG kodon start.
Inne aminokwasy 2-6 kodonów.
Sekwencja stop 3 kodony.
Kodon jest także jednoznaczny dany kodon koduje tylko jeden aminokwas.
Długo mówiono, że jest uniwersalny, ale teraz nie do końca prawie te same trójki kodują te
same aminokwasy, ale występują drobne różnicy trochę inaczej u niższych zwierząt.
21 i 22 aminokwas w białkach
UGA Stop selenocysteina (prokariota i eukariota, z wyjątkim drożdży i roślin)
UAG Stop pirolizyna (archeony i bakterie)
Białka
Polimery składające się z 'cegiełek' aminokwasów, połączonych wiązaniami peptydowymi.
Początek białka ma (N-koniec) wolną grupę aminową, koniec białka (C-koniec) wolną grupę
karboksylową, z boku łańcuchy boczne.
Opis cząteczki Wygląd cząteczki Liczba aminokwasów
Peptydy krótki łańcuch aminokwasowy do 100
Poziomy organizacji cząteczki białka
Struktura pierwszorzędowa sekwencja, czyli kolejność ułożenia aminokwasów
Drugorzędowa alfa helisa, beta kartka
Struktura trzeciorzędowa wzajemne przestrzenne ułożenie fragmentów struktury drugorzędowej
Struktura czwartorzędowa wzajemne przestrzenne ułożenie łańcuchów polipeptydowych.
Tylko białka zawierające więcej niż jedną podjednostkę mają strukturę czwartorzędową!!!
(a) Collagen
włókienko splecione z kilku łańcuchów polipeptydowych
Denaturacja renaturacja białka
W wyniku denaturacji zniszczeniu ulega struktura 2, 3, 4-rzędowa, zostaje pierwszo.
Native form (denaturation) białko zdenaturowane (refolding) native form
Sposoby prezentacji struktury atomowej białka
- str. szkieletowa sam szkielet białka, bez wiązań bocznych
- str. wstążkowa za pomocą wstążek i strzałek ukazane są alfa helisy i beta kartki strzałki
pokazują nam kierunek białka
- str. chemiczna pokazane wiązania
- str. powierchniowa kuleczkowa struktura
n-koniec niebieski, c- czerwony
Wybrane metody oczyszczania i analizy białek
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that
order - Sydney Brenner
Analiza białek pozwala odpowiedzieć na wiele ważnych biologicznie pytać dotyczących badanego
białka:
- jaka jest całkowita ilość badanego białka w komórce, a jaki jest poziom syntezy w
poszczegolnych typach komórek;
- jaka jest subkomórkowa lokalizacja badanego białka (np. jądrowa, błonowa, mitochondrialna
itd.);
- czy białko ulega translokacji w odpowiedzi na pewne warunki;
- czy białko ulega modyfikacjom postranslacyjnym i jak wplywają one na funkcje białka;
- czy poziom danego białka w komórce jest rgulowany przez szok cieplny, hormony, czynniki
wzrostowe;
- jaka jest funkcja badanego białka w komórce;
- z jakimi innymi bialkami oddziałuje badane białko;
- czy poziom białka w komórce zmienia się u chorych osobników.
Wybór analizowanego białka
Wybór zródła badanego białka
- naturalne
- nadekspresja
Ułatwia oczyszczanie
Umożliwia otrzymanie dużych ilości białka
- Analizy biochemiczne (badanie aktywności enzymatycznej, stabilności, interakcji białko-białko,
białko-DNA)
- Analizy strukturalne (krystalizacja, NMR)
- Otrzymanie przeciwciał
Hodowle komórkowe
- komórki drożdżowe
hodowle drożdżowe są tańsze, łatwiejsze do przeprowadzenia. Można otrzymywać kolonie
drożdżowe na plytkach agarowych lub w pożywkach plynych na odpowiednich wytrzasarkach w
odpowiedniej temperaturze
- komórki ssacze tzw. linie komórkowe
Szalki w podłożu płynnym w odpowiednich inkubatorach zapewniających temperaturę i dwutlenek
węgla;bądz duże naczynia hodowlane
Wyższe wymogi sterylności, aby nam się nie zakaziło.
Metody dezintegracji komórek/lizy komórek
- mechaniczne
* homogenizacja
* młyn kulkowy
- nie-mechaniczne
* fizyczne (sonikacja, mrożenie/odmrażanie)
* chemiczne (detergenty, rozpuszczalniki)
* enzymatyczne (lizozym, litykaza)
Dezintegracja komórek
- mozdzierz ceramiczny
- homogenizator szklano-teflonowy (rurka, do niej roztwor komórkowy, tłok chodzi w górę i w
dół, rozbja komorki, pomagają w tym czynniki chemiczne zawarte w roztworze)
- homogenizator ultradzwiękowy zawiesina komórek, wkładamy pręt ultradzwiękowy, niszczy się
integrację komórek
Frakcjonowanie komórek poprzez wirowanie różnicowe
Homogenat wirujemy (1500g 10 min.)
- osad I (całe komórki, pozostałości komórek, jądra)
- supernatant I wirujemy (30000 g 20 min)
* osad II (mitochondria, lizosomy, peroksysomy)
* supernatant II wirujemy (100000g 2 godz)
# osad III (mikrosomy)
# supernatant III (białka cytoplazmatyczne)
Przed wirowaniem cząsteczki zawieszone w roztworze wirowanie za pomocą szybko
obracającego się rotora kątowego po wirowaniu na górze supernatant, osad osiada na dole.
Wirowanie w gradiencie gęstości
Do probówki wirówkowej nalewany roztwór sacharozy bliżej dna gęsciejszą sacharozę 20%,
bliżej wierzchu 5% sacharozy, rzadzsza, gradient gęstości na górze nanosimy próbkę wirujemy
w rotorze w którym probówki są ustawione poziomo, w wyniku działania siły odśrodkowej
rozdziela się mieszanina w gradiencie sacharozy z inicjalnego nanosu powstają oddzielone
frakcje
małe cząsteczki na wierzchu, średnie cząsteczki w środku, duże cząsteczki na dnie
Wysalanie białek
Mamy płaszcz wodny przykrywający białko
Wraz ze zwiększeniem koncentracji soli do pewnego momentu rozpuszczalnosc białek rośnie
(nasycanie roztworu solą) tworzy się płaszcz hydratacyjny i rozpuszcza się lepiej
Tak się dzieje tylko do pewnego momentu, po dodaniu kolejnej porcji soli rozpuszczalnosc
gwałtownie spada i białko wytrąca (wysala się) z roztworu.
Dializa białek przechodzenie przez błony półprzepuszczalne cząsteczek rozpuszczalnika i
innych małych cząsteczek, którymi zanieczyszczany jest roztwór białka.
Początek dializy
Stężony roztwór (białka + zanieczyszczenia) umieszczamy w półprzepuszczalnym woreczku
dializacyjnym i umieszczamy w zlewce z rozpuszczalnikiem, zostawiamy na kilka godzin.
Po ustaleniu równowagi
Z woreczka dializacyjnego przeszła połowa zanieczyszczeń, po wymiani rozpuszczalnika proces
powtarza się
Oczyszczanie białek metodą chromatografii cieczowej
Mieszanina białek (np. frakcja cytoplazmatyczna) nanosimy ja na odpowiedni złoże
chromatograficzne, które znajduje się w odpowiedniej kolumnie, na dole kolumy otwór, na górze
próbka u gorze podłączamy rozpuszczalnik, na dole probówkę, nasz roztwór wędruje przez
złoże, rozdziela się, po kolei do próbówek zbieramy różne frakcje zawierające rozdzielone białka.
Wykres chromatograficzny
na osi x poszczególne probówki do których zbieramy białka, na y absorbancja
nic potem ścieka białko jeden nic potem ścieka białko dwa pik wskazuje na białko pik
wskazuje nam na rodzaj białka.
To z automatycznych, zmaszynowanych chromatografów.
Różne rodzaje chromatografii cieczowej
Rozdział białek ze względu na:
- rozmiar filtracja żelowa (sito molekularne)
- ładunek chromatografia jonowymienna
- hydrofobowość chromatografia oddziaływań hydrofobowych
- powinowactwo chromatografia powinowactwa
Filtracja żelowa
W kolumnie mamy kolumnę wypełnioną złożem chromatograficznym kuleczkami agarozowymi,
które mają określoną wielkość porów
Na takie złoże chromatograficzne nakladamy mieszaninę dużych i małych białek
Podłączamy rozpuszczalnik, u dole kranik, białka przechodza przez kolumnę i się rozdzielają
Najpierw białka duże, małe potem, najmniejsze najpózniej.
Białka duże nie są zatrzymywane przez pory bo się w nich nie mieszczą, przenikajś więc między
kuleczkami złoża i idzie im szybciej,
białka małe przenikają przez pory w złożu (wchodza do kuleczki i muszą potem znalezć z niej
wyjście) więc schodzi im dłużej.
Chromatografia powinowactwa
W chromatografii powinowactwa wykorzystujemy powinowactwo białka do złoża
chromatograficznego
Mamy złoże chromatograficzne, oraz mieszanine białek o różnej strukturze.
Tylko jedno białko ma powinowactwo do złoża (łączy się ze złożem)
Nanosimy mieszaninę białek jedne białka łączą się ze złożem, reszta nie przepłukujemy
rozpuszczalnikiem (płukanie) z kolumny wypadają wszystkie białka, które nie łączyły się ze
złożem, jeden rodzaj białek został.
Wykres chromatograficzny
- najpierw absorbancja zero po tym jak nałożyliśmy tylko mieszaninę,
płuczemy absorbancja rośnie płuczemy aż znowu nie spadnie (aż nie wypłuczemy całego
białka i będzie leciał sam rozpuszczalnik)
- stosujemy wtedy drugi rozpuszczalnik który sprawia że wydzielone białko odczepia się od złoże
i wyletuje też pik numer dwa ostrzejszy znowu płuczemy aż nie spadnie (krócej)
Możemy potem wysolić wypłukane białko z rozpsuzczalnika, którego użylismy do wymycia białka
ze złoża.
Ilościowe oznaczenie białka wbadanych frakcjach komórkowych
Metody spektrofotometryczne Metoda Whitakera i Granuma
C białka (mg/ml) = (A235 A280)/2,51
Metody kolorymetryczne Metoda Bradford
Zabarwienie kompleksu proporcjonalne do stężenia białka
Białko + kumasi kompleks barwy niebieskiej mierzy się spekrofotometrycznie przy 595 nm.
Trzeba zrobić krzywą wzorcową tworzymy kompleksy białko-barwnik o znanym stężeniu
wiemy wtedy że dane stężenie białka odpowiada danej absorbancji, następnie odczytujemy z niej
stężenia w próbie badanej
(równanie prostej można też obliczyć)
Elektroforeza żelowa białek
- Metoda ta umożliwia monitorowanie składu mieszaniny białek, sprawdzanie czystości białek,
oznaczanie masy cząsteczkowej, analizy struktury podjednostkowej, określenie punktu
izoelektrycznego białka
- W analizie białek stosowane są żele poliakrylamidowe (dobra rozdzielczość, duża wytrzymałość
mechaniczna)
- Elektroforeza w żelu poliakryamidowym umożliwia rozdział cząsteczek białkowych różniących
się wielkością i ładunkiem elektrycznym;
- Rozdział może być jednokierunkowy (1D) lub dwukierunkowy (2D)
Analiza białka elektroforezy jednokierunkowej w warunkach denaturujących (SDS/PAGE)
Elektroforeza pionowa
próbki dodajemy za pomocą pipety automatycznej do studzienek
- wierzch - (katoda), dno + (anoda), białka idą z do +
Do roztworu białka dodawany jest
DTT
SDS
barwnik
SDS skladnik detergentów i środków myjących; ma on ujemny ładunek, przykrywa białka i
maskuje ich ładunek, dzięki czemu wszystkie są ujemne i wędruja do anody.
DTT substancja o zapachu zgniłych jaj, zawiera grupy -SH, niszczy mostki siarczkowe
pomiędzy podjednostkami białka dzięki czemu każda podjednostka wędruje w żelu oddzielnie
Barwnik najczęściej niebieski
Żel ma różne wielkości porów, z zależności od tego jakie bialka chce się zatrzymać.
- mniejsze białka zatrzymują się niżej
- większe wyżej
- największe najwyżej
Rozdzielamy białka pod względem ich masy.
Ile jednostek ma białko, tyle prążków widzimy po wybarwieniu.
Barwienie białek w żelu poliakrylamidowym.
Barwienie barwnikiem Coomassie Blue
zwykle powyżej 25 ng/prążek
barwienie fioletowe prązki to poszczególne polipeptydy
Porównujemy z prązkami wzorcowymi, o znanej masie, porównujemy i okreslamy jaką masę ma
nasze białko.
Barwienie srebrem (teoretycznie bardziej czuła, ale to zależy od białka)
ok 0,5ng/prążek
Prążki są wtedy żółtobrązowe
Barwienie cynkiem
Nie wybarwiamy prążków białkowych, tylko wybarwia nam się tło żel robi się mleczny i tylko te
miejsca gdzie są prążki są przezroczyste
czulość od 4000 0,25 ng/prążek
Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym
dwa protokoły szybki i podstawowy
metoda bardzo czuła i uniwersalna, ale drogie barwniki, konieczna aparatura dodatkowa.
Barwienie glikoprotein
Blue Stain (Coomassie) barwimy wszystko
Glycoprotein stain barwimy tylko glikoproteiny
Barwienie fosfobiałek
Blue Stain (coomassie)- barwimy wszystko
Phosphoprotein stain barwimy tylko białko posiadające grupę fosforanową (fosfobiałka); metoda
czulsza niż coomassie i specyficzniejsza
Coomassie nie barwi wszystkiego.
Analiza białek metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF)
punkt izoelektryczny (pI) pH w którym cząsteczka ma zerowy ładunek sumaryczny, oznaczany
przy pomocy programu komputerowego dla białek o znanej sekwencji, lub empirycznie.
Jeżeli żel podłączymy z jednej strony do katody (-) i anody (+) to wytworzy nam się gradient pH
odpowiednio od pH 10,0 do pH 3,0 białka w mieszaninie wędruja tak dlugo, aż osiągną pH
które odpowiada ich punktowi izoelektrycznemu mają wtedy zerowy ładunek sumaryczny i
przestają się poruszać w polu elektrycznym
Rozdzielają i ustawiają się więc zgodnie z rosnącym pI od anody do katody, a nie względem masy.
Ogniskowanie izoelektryczne
Zestawienie rozdzielczości SDS/PAGE mamy jeden prążek, wykonujemy dla niego elektroforezę
IEF otrzymujemy osiem prążków w rozpiętości pH od 5,0 do 3,5 są to białka rybosomalne o
prawie takiej samej masie cząsteczkowym lecz innym pI.
Analiza białek metodą elektroforezy dwukierunkowej (2D)
Pierwszy kierunek IEF
długie cienkie paseczki ustawiające się w gradiencie pH
Drugi kierunek SDS/PAGE rozdzielone już białka pod względem punktu izoelektrycznego
kieruje się do elektroforezy SDS/PAGE gdzie ustawiaja się dodatkowo względem masy.
Następnie barwimy barwnikiem Coomassie Blue lub srebrem
- zamiast prążków widzimy kropeczki
jeden wymiar żelu to gradient pH a drugi wymiar żelu to gradient masy.
Sekwencjonowanie białek ustalenie kolejności aminokwasów w łańcuchu peptydowym
W 1953r F. Sanger jako pierwszy zsekwencjonował białko (łańcuchy insuliny)
Sekwencję białka możemy poznać
- poprzez sekwencjonowanie łańcucha peptydowego;
- poprzez sekwencjonowanie DNA odpowiedniego genu (lub cDNA), a nstępnie ustalenie
sekwencji białka na podstawie kodu genetycznego.
Metody sekwencjonowanie/identyfikacji białek:
- chemiczne (degradacja Edmana)
- spektrometria mas
Etapy analizy sekwencji białka
Roztwór białka/mieszaniny białek
- 2D; SDS/PAGE; IEF trawienie proteolityczne w żelu rozdział chromatograficzny
peptydów lub spektrometria mas (MALDI TOF MS) lub spektrometria mas (LC-MS/MS)
degradacja Edmana lub spektrometria mas (MALDI TOF MS)
- trawienie proteolityczne spektrometria mas (LC-MS/MS)
W celu ustalenia sekwencji dlugiego polipeptydu należy go rozciąć na krótsze peptydy składające
się z 20-50 reszt, które po rozdzieleniu poddaje się sekwencjonowaniu. Specyficzne pocięcie
polipeptydu można osiągnąć metodami chemicznymi np. bromocyjanu (BrCN), który rozrywa
wiązanie peptydowe utworzone przez grupę karboksylową metioniny
Cyanogen bromide cleavage
lub enzymatycznymi
np. przy udziale trypsyny która rozcina łańcuch polipeptydowy po karboksylowej stronie reszt
aminokwasów zasadowych (Lys, Arg), lub chymotrypsyny, rozdzinającej łncuch polipeptydowy po
karboksylowej stronie reszta aminokwasów aromatycznych (Phe, Tyr, Trp).
Peptydy otrzymane w wyniku specyficznej hydrolizy rozdziela się chromatograficznie i oznacza
sekwencję każdego z oczyszczonych peptydow techniką degradacji Edmana.
Degradacja Edmana
Znakowanie peptydu którego sekwencję chcemy ustalić związkiem fenyloizotiocyjanianem
W środowisku zasadowym przyłącza się do pierwszego aminokwasu z N-końca polipeptydu
mamy fenylotiokarbamylową pochodną peptydu w środowisku kwaśnym fenylotiocyjanian +
aminokwas z N-końca odłączają się powstaje fenylotiohydantaionowa (PTH) pochodna N-
końcowego aminokwasu, i polipeptyd (N-1)- cykl powtarzamy
Kolejność ułożenia peptydów w polipeptydzie możemy wyjaśnić na podstawie tak zwanych
nakładających się peptydów
peptydy trypsynowe peptyd chymotrypsynowy
Ala-Gly-Trp-Gly-Lys Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp
Asn-Val-Lys
peptydy trypsynowe nakładają się na peptyd chymotrypsynowy:
peptydy trypsynowe
Asn-Val-Lys Ala-Gly-Trp-Gly-Lys
peptyd chymotrypsynowy
Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp-Gly-Lys
Spektrometria mas techniki polegające na jonizacji badanej substancji, a następnie analizie
utworzonych produktów ze względu na ich masę i ładunek.
Analizowana substancja jonizacja badane substancji w jonizatorze rozdział jonów o różnym
stosunku masy do ładunku (m/z) w analizatorze m/z rejestracja danych w systemie rejestracji
danych (detektorze)
Wynik: widmo masowe.
Metoda odcisku palca mapy peptydowej
(PMF, ang. peptide mass fingertprinting)
Eksperyment: mamy białko trawienie do mapy peptydowej spektrometria mas daje nam listę
mas porównujemy z teoretyczną lista mas poszczególnych mas dla różnych białek w programie
komputerowym
Program komputerowy: baza danych sekwencji danych trawienie teoretyczne do wirutalnej
mapy peptydowej symulacja spektrometrii mas otrzymujemy hipotetyczne listy mas dla
poszczególnych białek.
Różnice w metodach sekwencjonowania
Degradacja Edmana
chemiczne usuwanie aminokwasów z N-końca peptydu (1 aa/ na cykl) i określenie sekwencji
białka od N-końca (analiza chromatograficzna PTH pochodnych aminokwasów)
>~50 pmol polipeptydu
Spektrometria mas
umożliwia niezwykle dokładne pomiary mas polipeptydów co z kolei pozwala na identyfikację
peptydów poprzez wyszukiwanie w bazie danych, białek zawierających peptydy o takiej samej
masie
>~50 fmol [femtomol] polipeptydu (lC MS/MS)
To, czego nie można dowieść metodami biochemicznymi, można teraz po prostu zobaczyć,
czyli...
przyżyciowa analiza procesów biologicznych metodą mikroskopii konfokalnej
Obraz w mikroskopie konfokalnym uzyskiwany jest poprzez skanowanie preparatu wiązką lase ra,
która wzbudza fluorescencję barwnika
Zalety:
- otrzymywanie obrazów o większej rozdzielczości i lepszym kontraście
- uzyskanie trójwymiarowego obrazu
- jednoczesna rejestracja kilku barwników
Białko GFP (Green Fluorescent Protein) z meduzy Aequorea victoria (nagroda Nobla 2008),
białko z meduzy
po wzbudzeniu go światłem o długości 395 nm emituje światło zielone o długości 509 nm
jest to bialko beczułkowe, beczułki tworzą beta-harmonijki, w środku mamy fluorofor czyli to co
fluoryzuje
następnie z teog białka Roger Tsien otrzymal pochodne świecące różnymi barwami
- możemy otrzymać świecąc bakterie, króliki.
Musimy otrzymać konstrukt genetyczny zawierający sekwencję badanego białka (np. Beta-
aktyny) i sekwencję fluorescencyjnego białka
mieszamy to z liposomowym czynnikiem transfekcji (przenoszenia obcych genów do komórki),
inkubujemy przez trzydzieści minut
plazmidy tworzą kompleks z kationowymi liposomami tworzą się lipopleksy
dodajemy to do komórek ssaczych, inkubujemy.
Dodajemy utworzonego DNA do komórki ssaczej ono przenika do jądra, ulega transkrypcji do
mRNA, mRNA wędruje do cytoplazmy ulega translacji powstaje nam białko badane związane z
białkiem fluorescencyjnym powstaje świecący szkielet aktynowy
FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer lub Foerster Resonance Energy Transfer)
- metoda badania interakcji między białkami
- Zasada tej metody opiera się na istnieniu transferu energii między dwiema fluorescencyjnymi
cząsteczkami.
- Jeśli dwa białka są fluoroforami to wzbudzenie fluorescencji pierwszego z nich (donor) prowadzi
do pobudzenia drugiego (akceptor)
Warunki aby doszło do transferu
- nakładające się widmo emisji donora i wzbudzenia akceptora
- odległości między nimi rzędu 1-10 nm
Przypadek 1
Białka A i B są badane. Do A doczepiono białko fluorescencyjne emitujące barwę zieloną, a do
białka B emitujące barwę żółtą
- widma nakłądają się, ale odległości między nimi nie są rzędu 1-10 nm
po wzbudzeniu donora światłem 405/440 nm widzimy emisje tylko donora światłem 475 nm.
Jeżeli odległość jest rzędu 1-10 nm
po wbudzeniu donora światłem jego emisja wzbudza akceptor i akceptor świeci na zółto
Struktura komórek bakteryjnych i eukariotycznych
Komórka bakteryjna
materiał genetyczny nukleoid rozmieszczony w cytoplazmie, brak jądra, w cytoplazmie
rybosomy, na zewnątrz blona komórkowa i ściana komórkowa.
Komóka eukariotyczna ma jądro
Nukleodi (DNA chromosomowy z superzwiązanymi domenami) E.coli ~4700 kpz
superzwinięte domeny DNA nawinięte na histonopodobne białka
Oprócz chromosomu bakteryjnego mamy plazmidy geny dodatkowe np. odporności na
antybiotyki
Główna powtzarzająca się jednostka strukturalna chromatyny to nukleosom
Rdzeń tworzy osiem cząsteczek histonów (4 pary: H2A, H2B, H3, H4), nań nawinięty DNA,
pomiędzy rdzeniami linkerowy (łącznikowy) DNA do niego jeszcze doczepiony histon H9.
U człowieka nić DNA ma ok. 2 m długości i zwinięta jest w 23 parach chromosomów
Całkowita długość 46 chromosomów metafazowych wynosi tylko 200 mikrometrów.
Organizacja genomu eukariotycznego
Nić DNA kondensuje powstaje włókno nukleosomowe kondensuje powstaje włókno 30nm
które kondensuje powstaje chromatyna interfazowa, przy podziale kondensuje skondensowany
fragment chromosomu tworzący chromosom metafazowy.
Ile genów znajduje się w ludzkim genomie?
Pierwsze szacunki mówiły o 6 000 000 1964 r
potem mówiono o 100 000 lata dziewięćdziesiąte
teraz mówi się że ilość genów między 20-30 000
Mamy ilość genów między kurą (ok 16 000 gen) a winogronami (30 000 gen)
Genom człowieka w liczbach
- cały genom człowieka ma ok 3,2 mld par zasad (bp)
- tylko około 1,5% DNA człowieka to geny kodujące białka, reszta to introny (fragmenty genów
niekodujące białek), geny kodujące RNA, sekwencje regulatorowe i DNA, którego funkcji nie
znamy
- Chromosom 1 ma aż 246 milionów par nukleotydów, chromosom 21 ma 47 milionów par zasad
DNA mitochondrialne (mtDNA)
- mtDNA koduje białka biorące udział w wytwarzaniu ATP;
- występuje zwykle w postaci kolistej dwuniciowej cząsteczki;
- długość mtDNA
mtDNA człowieka 15kb (kilobase)
mtDNA drożdży 78 kb
mtDNA niekt.roślin > 3000 kb
- liczba kopii mtDNA na mitochondrium wynosi od kilku u większości organizmów do 30 u
pierwotniaków z rodzaju Euglena
Genom mitochondrialny człowieka
mtDNA człowieka koduje informację o syntezie 13 białek związanych z fosforylacją oksydacyjną,
22 rodzajach tRNA, 2 rodzajach rRNA
Genom mitochondrialny jest kulisty, zwarty, jedyną sekwencją niekodującą jest tzw lupa D,
wykazuje on dużą zmiennośc więc służy do porównywania pokrewieństwa i datowania
filogenetycznego.
DNA chloroplastów (cpDNA)
- cpDNA koduje białka biorące udział w fotosyntezie oraz ekspresji informacji genetycznej
(replikacja, transkrypcja, translacja)
- występuje w postaci kolistej
Przeciętna ilość genów na cpDNA wynosi ok. 124 w tym
4 geny kodujące rRNA
30 genów kodujących tRNA
90 genów kodujących białka
Wirusy DNA ssaków
Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA
Wirus SV40 dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA struktura jego genomu przypomina
minichromosom pod mikroskopem elektronowym.
Adenowirus dwuniciowa, liniowa cząsteczka DNA
Eukariotyczne wirusy RNA
Typ wirusa Genom Sposób replikacji Rodzina wirusw Przedstawiciele
EukariotycznessRNA (nić +) RNA RNA Picornaviridae Rynowirus
wirusy RNA Wirus polio
Wirus pryszczycy
ssRNA (nić -) Coronaviridae Wirus SARS
Rhabdoviridae Wirus wścieklizny
Paramyxoviridae Wirus odry
Wirus świnki
Filoviridae Ebola
Marburg
Retrowirusy
genom stanowi RNA, otoczke stanowi białkowy kapsyd okryty bloną, na tym jeszcze kolce
Retrowirus zawiera enzym zwany odwrotną transkryptazą
po wniknięciu wirusowe RNA w wyniku odwrotnej transkryptazy zostaje przepisane na wirusowe
DNA i wtedy przenika do jądra i ulega integracji z genomem gospodarza.
Wiroidy koliste cząsteczki RNA długościok. 240-400 nt, niezawierające genów, nie zamknięte
w kapsydach, rozprzestrzeniają się z komórki do komórki jako nagi RNA, np. wiroid łuszczycy
kory drzew cytrusowych, hamujący ich wzrost;
Wirusoidy koliste cząsteczki RNA długości ok. 320-400 nt, niezawierające genów,
przemieszczające się z komórki do komórki w kapsydach wirusów pomocniczych genomy
wiroidów i wirusoidów mają autokatalityczną aktywność rozcinania się.
Autokatalityczne cięcie RNA wiroidów i wirusoidów
Genomy są połączone w sposób głowa-ogon, tworzą one pofałdowaną strukturę która może się
sama wyciąć bez dodatkowego enzymu -? cięcie autokatalityczne poszczególne genomy
liniowe cyrkularyzacja
Jak badać subkomórkową lokalizację i funkcje białek ssaczych?
Kamil Deryło
Zakład Biologii Molekularnej
Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej
Lublin
Plan prezentacji
1. Ogólny schemat eksperymentu
2. Izolacja DNA, projektowanie starterów, PCR, klonowanie, ssacze wektory ekspresyjne
3. Transformacja bakterii
4. Izolacja i oczyszczanie plazmidu
5. Podstawy hodowli komórek zwierzęcych.
6. Transfekcja
7. Mikroskopia konfokalna.
Dlaczego badanie lokalizacji białek może być interesujące?
1. Subkomórkowa lokalizacja funkcja (błona komórkowa, jądro komórkowe)
2. Zmiana lokalizacji w czasie fizjologia komórki (transport białek, podział komórki, apoptoza)
3. Zmiana lokalizacji zmieniona czynnikiem zewnątrznym wpływ antybiotyków
Interakcje między białkami są kluczowe dla każdego procesu zachodzącego w komórce.
Jak możemy badać te interakcje in vivo?
Jak zobaczyć białka w mikroskopie?
- białko hybrydowe/białko fuzyjne
do DNA kodującego białko dołączamy plazmid kodujący białko fluorescencyjne (restryktaza,
potem ligaza) powstaje cząsteczka hybrydowa DNA kodujące badane + DNA kodujące
fluorescencyjne wprowadzamy do bakterii, namnażamy, rozbijamy bakterie, ekstrahujamy gen,
wprowadzamy do komórki zwierzęcej, gen ulega ekspresji, widzimy pod mikroskopem świecące
białko.
Projekt pracy magisterskiej:
Charakterystyka ludzkiego białka X (subkomórkowa lokalizacja, funkcja, dynamika, interakcje z
inymi bialkami)
Zaplanowanie eksperymentu
1. Jaki jest cel eksprymentu?
2. Z jakimi biomolekułami będziemy pracować?
3. Charakterystyka zródła materiału biologicznego
4. Jakie techniki będą używane?
5. Charakterystyka komórek z którymi będziemy pracować.
Przygotowanie DNA kodującego białko X
1. Garbage in garbage out przygotowanie próbki DNA
2. Izolacja DNA genowego/ plazmidowego (wydajność, czystość, jakość)
3. Liza alkaliczna/kolumienki (zestaw Plasmid Mini)
Genomowe DNA
a) Liza komórki zniszczenie ściany komórkowej, błony komórkowej ekstrakt komórek
b) centryfugacja w celu usunięcia resztek komórki wirowanie ekstraktu kom na górze mamy
DNA, RNA, białka resztki w osadzie
możemy też mieszać z fenolem i robi się to samo.
Wybór odpowiedniego wektora
- Wektor bakteryjny plazmid
Plazmidy to pozachromosomowe cząsteczki DNA w komórce bakteryjnej nadające jej dodatkowe
funkcje
sekwencja ORI
sekwencja kodująca jakiś gen (np. odporności)
sekwencja polilinkera (sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne tnące DNA w
ściśle określonym miejscu)
Wybór odpowiedniego wektora
- Bakteryjny wektor ekspresyjny
Wektor zawiera sekwencję promotorową rozpoznawaną przez polimerazę DNA
Izolacja plazmidów
Mamy w ekstrakcie liniowe DNA i superskręcone plazmidy alkalizacja pH do 12.5 z 12.0
wiązanai wodorowe się niszczą pH 7.0 z DNA robi się skręcona masa bo wiązania
wodorowe nie odtworzyły się idealnie, plazmidom nic nie jest wirowanie na górze
superskręcone plazmidy, na dole DNA
Elektroforeza plazdmidu.
Amplifikacja DNA kodującego białko X reakcja PCR
- woda
- genomowe/plazmidowe DNA
- dNTP
-MgCl2
- polimeraza Taq
- bufor dla polimerazy Taq
Denaturacja
A PCR recation starts with a denaturing step. Samples are heated to 94-96 C for one to several
minutes.
Przyłączenie primerów forward and reverse
polimeraza
Cięcie produktu reakcji PCR i wektora enzymami restrykcyjnymi
- DNA
- bufor dla enzymów
-BamHI
Hodowle komórkowe
Hodowla komórek umożliwia utrzymywanie poza organizmem, czyli in vitro, żywych komórek
fragmentów tkanek lub narządów. W powszechnym rozumieniu jest do hodowla zdyspergowanych
komórek, rosnących w systemie jednowarstwowym (monolayer) lub w zawiesinie. Termin ten
obejmuje hodowle wycinków tkankowych, hodowle narządowe, hodowle komórkowe pierwotne i
hodowle linii oraz szczepów komórkowych, jak również
kokultury organotypowe i hodowle przestrzenne. Pod pojęciem hodowle komórek należy
rozumieć hodowle zdyspergowanych komórek w hodowlach pierwotnych i w hodowlach
komórek linii komórkowych, rosnące w systemie jednowarstwowym (hodowle adherentne)
lub w zawiesinie (hodowle zawiesinowe). Hodowla pierwotna jest zakładana z materiału
pobranego bezpośrednio z organizmu. Wyprowadza się ją z eksplantów tkanki/narządu lub z
zawiesiny powstałej po ich enzymatycznym rozproszeniu. Linia komórkowa jest populacją
komórek powstającą z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. Pasażowaniem nazywa się
przeniesienie komórek ze starego naczynia hodowlanego do nowych naczyń, zawierających
świeżą pożywkę. Pasażowaniu poddaje się komórki przed osiągnięciem konfluencji czyli
stanu, kiedy komórki w hodowli pokrywają ścisłą warstwą całą powierzchnię dna naczynia
hodowlanego. Podczas pasażowania komórki rozcieńcza się w odpowiednim stosunku i
przenosi do nowych naczyń, namnażając w ten sposób populację komórek i zapewniając
jednocześnie ciągłość jednolitego materiału do badań.
Warunki hodowli
- Hodowle komórkowe prowadzi się w odpowiednich naczyniach hodowlanych
Transfekcja
Trans + infection = transfection
Lipofekcja
Zapewnienie komórkom optymalnych warunków do wzrostu i rozwoju.
Współczesne mikroskopy konfokalne do przyżyciowego obrazowania komórek.
Statyw ma odpowiednią temperaturę, dostarczanie CO2.
Laboratorium obrazowania zywych komórek
- mikroskop konfokalny
Podstawy fluorescencji
Promienie świetlne padają na substancję zdolną do fluorescencji substancja przechodzi do
stanu wzbudzonego przechodząc do podstawowego emituje światło o mniejszej energii
(większa długość fali)
Główne drogi światła w mikroskopii konfokalnej
yródło światła (laser) szczelina (do detektora dociera światło tylko z jednej płaszczyzny
zapewnia ostrość obrazu) światło pada na listro dichroiczne (przepuszcza światło o jednej
długości fali emitowane przez próbkę inne, jak światło lasera, odbija) przez obiektyw na
preparat preparat emituje światło, przechodzi ono oprzez lustro dichroiczne i do obiektywu
Odkrycie GFP z Aeqorea Victoria wyizolowal ekforynę emitującą swiatło niebieskie pod
wpływem jonów wapnia oraz zielone białko fluorescencyjne emitujące swiatło zielone po
pochłonięciu niebieskiego
Ekspresja GFP w E.coli i C. elegans połączenie DNA gospodarza z DNA kkodującym GFP
powstaje białko hybrydowe (fuzyjne)
Problemy z wild type GFP
Widmo absorpcji podobne do widma emisji
Widmo absorpcji cytotoksyczne (światło o wys. energii)
Skłonność do dimeryzacji
Rozwój i modyfikacje GFP
- przez mutacje punktowe zamiany poszczeKólnych aminokwasów dały nam białka
fluorescencyjne o całej palecie barw
Modyfikacje GFP
Optymalizacja ekspresji w różnych typach komórek
Optymalizacja właściwości spektralnych absorpcja bardziej długofalowa, pojedynczy pik
Obserwacje mikroskopowe
Do badanego białka dołączony GFP
- możemy je zobaczyć w jądrze, w cytoplazmie mało
- albo tylko w cytoplazmie, w jądrze nie
- albo tylko w jąderkach
- albo tylko w cytoplazmie i jąderkach etc.
Możemy zaobserwować jak zmienia się lokalizacja białek po dodaniu antybiotyku gdzieś zanika
fluoresecencja, gdzieś się zwiększa, etc.
Składanie obrazu w 3D z wielu płaszczyzn (mikroskop konfokalny zbiera światło tylko z jednej
płaszczyzny naraz)
Badanie ruchu organelli przez wybarwianie białek specyficznych dla danych organelli
- mitochondriów, aktyny, chromosomów
Obserwujemy w czasie robimy zdjęcia w odstępach czasowych.
Jak zbadać dynamikę i zachowanie się badanego białka w komórce?
FRAP Fluorescence Recovery After Fotobleaching po potraktowaniu silnym światłem po
jakimś czasie białko traci zdolność do fluorescencji (fotowybielanie),
gdzieś kierujemy silny laser, tam chromofor przestaje emitować światło, robi się ciemno jeżeli
cząsteczki białka są ruchliwe to fotowybielone dyfunduja do innych obszarów, a niefotowybielone
dyfundują w miejsce gdzie były fotowybielone, świecenie wraca, do tego jest krzywa.
Jeżeli są niemobilne (związane przez coś), nie ma dyfuzji, ruchu.
Czego możemy się dowiedzieć?
- Jak szybko poruszają się białka
- przez jakiś czas białka pozostają związane?
- jaki jest % białek związanych
- jak wpływają substancje
Fotoaktywacja/fotokonwersja.
Konwersja molekuły w jednym rejonie, obserwować dyfuzję do innych rejonów obserwowanie,
jak szybko przemieszczaą się białka
Badanie interakcji między biiałkami dlaczego kolokalizacja nie wystarcza
rozdzielczosc jest za mała = 200 nm
białka mają 1; 2 nm.
Foerster Resonsnce Energy Transfer
Zrobimy dwa białka fluoresecncyjne, donor i akceptor,
wzbudzamy donor przekazujeon energie akceptorowi i wraca do podstawowego akceptor
świeci, po czym wraca do podstawowego
Donor nie świeci, zachodzi to przy oldegłości < 10nm.
Widmo emisji donora musi się pokrywać z widmem absorpcji akceptora
Standard do FRETa zestaw add gena Cerulean Venus
FRET Zasada fotowybielania akceptora
Mamy donor i akceptor, energia d idzie do a, wybielamy akceptor i donor odżywa, zaczyna
świecić.
Ekspresja informacji genetycznej
U prokariota
Fragment DNA (gen - ciągły) zawieszony w cytoplazmie ulega transkrypcji i powstaje mRNA,
mRNA ulega translacji i powstaje białko.
U eukariota
W cytoplazmie mamy wydzielone błonami jądro, w jądrze siedzi DNA jednostka
transkrypcyjna składa się z intronów (elementy niekodujące usuwane w trakcie dojrzewania
RNA) i eksonów (elementy kodujące gen nieciągły) ulega transkrypcji i powstaje pierwotny
transkrypt RNA następuje modyfikacja potranskrypcyjna dodawanie czapeczki na końcu 5',
splicing (wycinanie intronów) RNA, poliadenylacja na końcu 3' powstaje mRNA z czapeczką na
końcu 5' i z poliadenylowanym końcem 3' następuje eksport tej cząsteczki z jądra a następnie
translacja w wyniku której powstaje białko.
Rodzaje chromatyny:
- euchromatyna luzna, aktywna transkrypcyjnie - jasna na elektrogramie, bardziej w środku
jądra
- heterochromatyna skondensowana, brak transkrypcji ciemna na elektrogramie, skupiona
bliżej błony jądrowej
Mechanizmy regulujące dostęp do genów:
- metylacja DNA
- modyfikacja post-translacyjna histonów
- kompleksy remodelujące
- warianty histonów (zmiana histonów)
- niekodujące RNA, ncRNA
chromosom chromatyna składa się z nukleosomów cytozyny w DNA pod wpływem
enzymów metylotransferaz mogą ulec metylacji
histony mogą zaś zostać metylowane, fosforylowane, acetylowane.
Transkrypcja możliwa
- chromatyna aktywna
- brak metylacji cytozyn
- acetylacja histonów
Transkrypcja zahamowana
- chromatyna skondensowana
- metylacja cytozyn
- deacetylacja histonów
Obie formy mogą w siebie przechodzić w zależności od potrzeb organizmu (ścisła regulacja)
Remodelowanie chromatyny modyfikacja lub zmiana położenia nukleosomów w procesie
zależnym do energii z ATP.
Mamy 3 ściśnięte nukleosomy (histony: H2A, H2B, H3, H4) nawinięte na nie ściśle DNA +
remodeler chromatyny (kompleks białkowy) + ATP zapętlanie, ślizganie, uwalnianie pozycja
otwarta przesunięta, pozycja otwarta stara, stara zamknięta pozycja
Może też nastąpić wymiana histonów.
Transkrypcja
- synteza RNA na matrycy DNA, katalizowana jest przez polimeraznę RNA zależną od DNA.
- synteza RNA zachodzi zawsze w kierunku od końca 5' cząsteczki RNA do jej końca 3'
- tylko jedna nić DNA jest transkrybowana,
- DNA wyznacza kolejność w jakiej reszty nukleotydowe zajmują swoje miejsce w powstającym
polirybonukleotydzie, dzięki komplementarności zasad.
Nić kodująca, sensowna 5' 3', non-template strand.
Nić antysensowna, niekodująca 3' 5'
Te dwie nici są ze zobą połączone wiązanami wodorowymi potrójnymi między cytozyna a
guaniną, potrójnymi między adeniną a tyminą. transkrypcja, rozplątujemy nici DNA,
polimeraza doczepia się do nici antysensownej i na tej matrycy syntetyzuje z komplementarnych
do niej nukleotydów nić RNA powstaje RNA o kolejności nukeotydów takiej samej jak w nici
sensownej tyle że tymina zastąpiona uracylem.
Tworzenie wiązania fosfodiestrowego w trakcie transkrypcji znalezć mechanizm reakcji
Od 3' do 5' matrycy tworzy się nić od 5' do 3' RNA
Jednostka transkrypcyjna sekwencja DNA rozciągająca się od promotora do terminatora, może
zawierać jeden lub kilka genów
DNA 5' 3' nić sensowna
3' 5' nić antysensowna
upstream sekwencja powyżej promotora dowsntream region poniżej promotora
promotor pierwszy nukleotyd po promotorze+1 region transkrybowany (ulega transkrypcji i
powstaje RNA) terminator
RNA powstałe po transkrypcji taka sama sekwencja jak nić sensowna.
Etapy transkrypcji
- rozpoznanie promotora związanie polimerazy RNA do obu nici DNA w rejonie promotora
(kompleks zamknięty) i rozplecenie DNA w rejonie promotora (kompleks otwarty)
- inicjacja synteza pierwszych 2- 9 nukleotydów
- elongacja opuszczenie przez polimerazę RNA promotora i wydłużani łańcucha RNA
- terminacja zakończenie syntezy RNA
Polimeraza przemieszcza się w tzw. bąblu transkrypcyjnym
Tam gdzie przeszła DNA się zwija na powrót, tam gdzie siedzi polimeraza nić matrycowa i
kodująca rozplataja się, syntetyzuje się RNA na nici matrycowej, powstaje hybrydowa helisa
RNA-DNA powstającego RNA z nicią matrycową.
Budowa bakteryjnej polimerazy RNA zależnej od DNA
Podjednostki polimerazy bakteryjnej
alfa składanie enzymu (40kDa)
beta centrum katalityczne (155 kDa)
beta prim wiązanie DNA (160 kDa)
omega utrzymywanie aktywności enzymu (10 kDa)
sigma rozpoznawanie promotora (32-90 kDa)
Holoenzym: dwie podjednostki alfa, jedna beta, jedna beta prim, jedna omega, jedna sigma.
Czynniki sigma
sigma70 podstawowy czynnik E.coli zaangażowany w rozpoznawanie promotorów genów
ulegających konstytutywnej transkrypcji
sigma32 rozpoznaje promotory genów kodujących białka szoku termicznego
sigma54 syntetyzowany przez Klebsiella pneumoniae w czasie głodu azotowego, stymuluję
ekspresję genów asymilacji azotu
sigmaF i sigmaE syntetyzowane przez Bacillus subtilis, stymulując ekspresję genów
niezbędnych do utworzenia spor
Promotor rozpoznawany przez czynnik sigma70 E.col
TTCACA & ..........16-18 pz...........TATAAT...........5-8pz.......CG/AT
sekwencja -35 sekwencja -10 + 1
sekwencje zgodne promotorów E.coli (najbardziej zachowawcze sekwencje zaznaczono tłustym
drukiem)
Terminacja transkrypcji u E.coli
Terminacja z udziałęm terminatora samodzielnego
DNA 3' 5' nić matrycowa
5' 3'
mamy sekwencję odwróconego palindromu (czytaną tak samo od 5 do 3, jak i od 3 do 5),
umożliwiającą oddysocjowanie polimerazy od kompleksu transkrypcyjnego a potem AAAA
transkrypcja odwróconego palindromu daje RNA o strukturze spinki do włosów
jednoniciowe, potem dwuniciowe, między tym wiązania wodorowe dalej, przy końcu 3' same
uracyle
Dalej nie pójdzie, spinka do włosów się tworzy i nie zrobi się hybrydowa helisa (?), wiązania też
są słabe do dalej idą same pary A-U - kompleks się rozpada, polimeraza się odlącza
Terminacja zależna od Rho
(kiedy mamy słabszy palindrom, ale nie mamy samej sekwencji A-U potem
do RNA dołącza się Rho
kompleks elongacyjny zatrzymuje się na pętli spinki do włosów Rho rozbija wiązania
wodorowe między zasadami RNA i DNA.
Dojrzewanie pre-rRNA u E.coli
Pre-rRNA: (tu działa endonukleaza III)-sekwencja 16SrRNA-(III)-tRNA-(III)-sekwencja
23SrRNA(III)(P)sekwencja 5SrRNA (F)
Dojrzewanie pre-tRNA u E.coli
5'- mamy sekwencję dodatkową odcinaną przez RNazę P sekwencja dojrzała tRNA
sekwencja CCA odcinana przez Rnazę Z sekwencja odcinana przez RNAzę D
Inhibitory transkrypcji u bakterii
- ryfampicyna działa na podjednostkę beta polimerazy RNA i blokuje tworzenie pierwszego
wiązania fosfodiestrowego
- aktynomycyna D interkalator, wiąże się do DNA w regionach bogatych w pary G-C,
uniemożliwiając wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA.
Polimerazy eukariotyczne w odróżnieniu od bakteryjnej polimerazy RNA nie wiążą się same z
DNA.
Każda polimeraza eukariotyczna współdziała z określoną grupą czynników transkrypcyjnych
Tf1 (transcription factor 1) wspołdziala z polimerazą I
Tf II współdziała z polimerazą II
Promotor polimerazy I
Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA I
UBF TBP TATA binding protein + trzy cząsteczki TAFs TBP associated factors
polimeraza RNA I
Polimerazy RNA zależne od DNA (Eukariota)
Polimeraza Transkrybowane geny
Polimeraza RNA I (RNAP I) geny kodujące 25S/28S, 5,8 S i 18S rRNA
Polimeraza RNA II (RNAP II) geny kodujące białka: geny kodujące większość malych
jądrowych RNA snRNA, miRNA
Polimeraza RNA III (RNAP III) geny kodujące tRNA, 5S rRNA, U6-snRNA, małe jąderkowe
RNA (snoRNA), miRNA
Polimeraza RNA mitochondrialna i chloroplastowa.
Polimeraza RNA I niewrażliwa na alfa-amanitynę
polimeraza RNA II bardzo wrażliwa na alfa-amanitynę, kilka-kilanaście nM
polimeraza RNA III wrażliwa na duże stężenia 1�M.
Dojrzewanie pre-rRNA
- cięcia endo i egzonukleolityczne
- dodawanie grup metylowych
- przeksztalcanie urydyny w pseudourydynę
- splicing
Metylacja pre-rRNA
C/D snoRNA (ang. small nucleolar RNA)
snoRNA składa się z boxu C, sekwencji komplementarnej do rRNA, boxu D
przyłączają się komplementarne zasady rRNA
powstaje kompleks snoRNA -rRNA
następuje metylacja
kompleks snoRNA-zmetylowane w miejscu komplementarnym rRNA
zmetylowane rRNA odłącza się
Pseudourydylacja pre-rRNA
ACA snoRNA
snoRNA tworzy tu pętle
Introny
gen bakteryjny na dwuniciowym DNA składa się z promotorwa i rejonu kodującgo są ciągłe
5'->3'
3'->5'
gen eukariotyczny na dwuniciowym DNA jest nieciągły zawiera promotor i rejony kodujące
(eksony) naprzemiennie z rejonami niekodującymi (intronami)
5'->3'
3' 5'
Typ intronu Miejsce występowania
Introny GU-AG Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA
Introny AU-AC Jądrowy eukariotyczny pre-mRNA
Grupa I Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny
Grupa II Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny
Splicing pre-rRNA
Zachodzi autokatalitycznie nie uczestniczy żaden inny enzym białkowy
Bierze udział guanozyna z GTP, GDP, GMP
pre-rRNA 5'-ekson-intron-ekson-3'
guanozyna przyłacza się do kńca 5' intronu i atakuje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy eksonem
poprzedzającem a intronem, w wyniku tego ataku wiązanie zostaje przecięte wolny ekson z
grupą OH, intron z dołączoną guanozyną i drugi dołączony ekson
grupa OH eksonu 1 atakuje fiązanie fosfodiestrowe między intronem a eksonem 2, przecięcie
tego wiązania, eksony łączą się, intron z guanozyną zostaje wywalony. Intron ostatecznie ulega
degradacji.
Ważna jest natywna struktura drugorzędowa i trzeciorzędowa intronu jest ona bardzo ważna,
jeżeli się ją rozplecie za pomocą czynników denaturujących, splicing nie zajdzie.
Splicing pre-rRNA zachodzi w trzech transferach.
Nagroda Nobla z chemii w 1989
za odkrycie katalitycznych wlaściwości RNA
Thomas R. Cech, Sidney Altman.
Promotor podstawowy dla polimerazy RNA II
Do promotora podstawowego przyłączają się podstawowe (ogólne) czynniki transkrypcyjne (GTFs
ang. general transcription factors) i polimeraza RNA II tworząc kompleks preinicjacyjny.
BRE Miejsce rozpoznania TFIIB (-37 do -32) Sekwencja TATA (-31 do-26) Sekwencja Inr
inicjatora (-25 do +2) MTE Miejce Motywu 10 Rdzenne Miejsce Promotora w dół od
sekwencji inicjatora DPE
Elementy regulatorowe
Moduły promotora podstawowego, elementy regulacyjne i enchancery u Eukariota
enhancer elementy regulacyjne BRE-Sekwencja TATA-INR
-1000...-500 -500... -70 +1
Elementry regulacyjne:
Moduły konstytucyjne Aktywatory konstytutywne
(jeżeli znajdują się przed genem ulegającym przed genem ekspresji konstytutywnie [zawsze])
Moduły odpowiedzi
Moduły komórkowo specyficzne aktywatory regulacyjne
Moduły wiążące regulatory rozwoju
Jeden enhancer wzmocnienie wielu genów naraz, elementy regulacyjne tylko w odniesieniu do
jednego genu
Sekwencja wzmacniająca może aktywować gen działając:
- z dużej odległości
enhancer działa na promotor mimo ze jest od niego oddalony i powoduje wzmocnienie ekspresji
jednostki transkrypcyjnej
- niezależnie od orientacji
- poniżej, powyżej genu który aktywuje.
Sekwencje wzmacniające Sekwencje wyciszające
(enhancery) (silencery)
aktywatory represory
koaktywatory korepresory
S. wzmacniająca lub element regulacyjny aktywator koaktywator
S. wyciszająca lub element regulacyjny represor korepresor
Do enchancera przyłącza się białko aktywatora wygięcie nici DNA, dołącza się cząsteczka
mediatora (koaktywatora) nić się ugina, kompeks ten oddziaływuje z polimerazą II lub
komplekesem promotora TATA-GTFy- pol II
Białka aktywatorowe:
- wspomagają składanie komp;eksu gólnych czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA
- zmieniają strukturę chromatyny
Mediator most molekularny
- Powszechny u eukariontów występuje zarówno w drożdżach, jak i u ssaków
- Kompleks 25-30 białek (u ssaków co najmniej siedem różnych kompleksów Mediatora);
- wymagany do transkrypcji większości genów transkrybowanych przez polimerazę II
- bierze udział zarówno w regulacji pozytywnej jak i negatywnej, chociaż powszechnie nazywany
koaktywatorem, to jest również korepresorem jak i podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym.
Mdiator, oddziaływuje z RNAPII, TFIIF
Modułowa struktura promotora genu ludzkiej insuliny
GC-A5-OCT-E2-A3-CRE-A2
Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą uczestniczyć zarówno w aktywacji jaki i represji
tranksrypcji
T hormon tarczycy (ang. thyroid hormone)
TR receptor hormonu tarczycy (ang. thyroid hormone receptor)
TRE - element odpowiedzi na hormon tarczycy (ang. thyroid hormone response element)
jeżeli TR bez dołączonego T wiąże się z TRE hamuje transkrypcję
jeżeli TR z dołączonym T wiąże się z TRE (zmiana konfiguracji, mogą się dołączyć cząsteczki
koaktywatorów) aktywuje transkrypcję
Czynniki transkrypcyjne zbudowane są z kilku domen
Główne domeny czynników transkrypcyjnych to:
- domena wiążąca DNA
- domena transkatywacyjna
Dodatkowe domeny
- dimeryzacyjna
- regulatorowa (wiązania hormony, fosforylacji)
- sygnał importu/eksportu jądrowego
Klasyfikacja białek wiążących (specyficznie) DNA
- we względu na domeny wiążące DNA
HTH (ang. helix-turn-helix, helisa-skręt-helisa)
palec cynkowy (ZF, an.g ZN finger)
domena zasadowa
domena TBP
- ze względu na domeny dimeryzacji
HLH (ang. helix-loop-helix, helisa-pętla-helisa)
zamek leucynowy (LZ, ang. leucine zipper)
- wielu nie daje się sklasyfikować
Domena typu helisa-skręt-helisa (HTH)
- pierwsza zidentyfikowana struktura wiążąca DNA
- dwie alfa helisy połączone ostrym srkętem, pierwsza helisa kontaktuje się ze szkieletem
fosforanowym, druga dokładnie pasuje do rowka większego DNA w miejscu występowania
specyficznej sekwencji,
- wysoce konserwatywny motyw wiążący DNA występujący w wielu prokariotycznych i
eukariotycznych białkach wiążących DNA (represor laktozowy, regulatory
Domena typu palec cynkowy
- palec cynkowy najpowszechniejsza domena wiązania DNA u Eukariota
- składa się z beta-kartki, za którą następuje ostry skręt i alfa-helisa, atom cynku utrzymują 2
Cys i 2 His (Cys2His2) lub 4-6 Cys (Cys 4-6)
W niektórych białkach występują wielokrotne powtórzenia tej domeny.
(TFIIIA dziewięc klasycznych palców cynkowych [Cys2His2]
receptory homonów steroidowych [Cys4-6])
Białko TBP (ang. TATA-binding protein)
- Wiąże sekwencje TATA w promotorach, jest też niezbędne do inicjacji transkrypcji z
promotorów pozbawionych TATA;
- wchodzi w skład TFIID, ale także ogólnych czynników dla pol I i pol III RNA;
- pojedynczy peptyd z częścią środkową w formie zgiętej beta-kartki, obejmującej DNA niczym
siodło, z dwiema helisami po bokach 'siodła' i na końcach;
- lekko rozkręca helisę DNA i silnie ją zagina
Domena typu zamek leucynowy
- zamek leucynowy złozony z alfa-helis dwu oddzielnych monomerów, które dimeryzują dzięki
leucynom regularnie rozmieszczonym na obu helisach, zawierają też reszty argininy, które
przytrzymują szkielet fosforanowy po obu stronach rowka większego
- rozpoznają i wiążą palindromowe sekwencje DNA w rowki większym
- zamykają się na DNA jak para nożyczek prostopadłych do podwójnej helisy
- np. AP1, drożdżowy czynnik transkrypcyjny GCN4, C/EBP (ang. CCAAT enhancer-binding
protein)
Regulacja aktywacji czynników transkrypcyjnych
a) brak czynnika: w tkance jeden gen jest niekatywny, bo nie ma czynnika, w tkance drugiej
czynnik obecny, migruje do jądra, wiąże się z DNA i aktywuje gen, gen ulega ekspresji
b)czynnik nieaktywny syntetyzowany jest cały czas w formie nieaktywnej, pod wpływem
pewnych bodzcow jest aktywowany, migruje do jądra, wiąże się z DNA, gen staje się aktywny,
gen ulega ekspresji
Regulacja aktywności czynników transkrypcyjnych
aktywacja czynnika w wyniku:
związania liganda niektywny czynnik, nieaktywny gen wiąże się ligand, czynnik z ligandem
zmienia komfornację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny.
oddysocjowania od inhibitora czynnik nieaktywny związany z inhibitorem, po oddyscocjowaniu
zmienia konformację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny
modyfikacji chemicznej czynnik nieaktywny,
cięcia prekursora
Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA II
promotor podstawowy z sekwencją TATA jednostka transkrypcyjna start transkrypcji
dołącza się TFIID
TFIID = TBP + TAFs
TBP łączy się z TATA,
TAFsy, białka towarzyszące TBP, dodatkowe białka o masach cząsteczkowych: 250, 150 wiążą
się do sekwencji inicjatorowej, 60, 40 wiążą się do sekwencji DPE, 110, 80, 24, 30
Kompleks ten łączy się do sekwencji promotorowej, co umożliwia przyłączenie kolejnyczh
cyznników, TFIIA i TFIIB, po ich dołączeniu mogą się dołączyć: TFIIF z dołączoną polimerazą
RNA II i inne czynniki, także TFIIE i TFIIH
polimeraza RNA II zawiera ogon CTD największa podjesnotksa polimerazy II mający reszty
seryn mogące ulec fosforylacji,
do ogona CTD dołączają się reszty fosforanowe z UTP, ATP, CTP, GTP przejście ze stadium
inicjacji do elongacji, ma on właściwości helikazy rozplatania DNA zaczyna powstawac RNA,
transkrypcja
Elongacja transkrypcji przez polimerazę II
- podstawowe zasady elongacji transkryptów takie same dla bakterii i eukariiontów, istotna
różnica dotyczy długości transkryptów
- u bakterii transkrypty długości do kilku kpz czas transkrypcji do kilku minut
- u ekariontów transkrypty do 2400 kpz (liczne introny) czas transkrypcji do 20 godzin co
wymaga dużej stabilności kompleksu transkrypcyjnego
- w jądrze komórkowym przerywaniu i zatrzymywaniu polimeryzacji przeciwdzialają czynniki
elongacyjne (np. P-TEFb, Elongina A, ELL, TFIIS).
Dojrzewanie pre-mRNA (hnRNA ang. heterogenous nuclear RNA)
- Tworzenie czapeczki na końcu 5' transkryptu (ang. capping)
- Splicing (składanie pre-mRNA)
- Poliadenylacja końca 3' transkryptu
- Redagowanie (ang. editing)
Budowa czapeczki
Gppp + pppN (transferaza guanylilowa) GpppN metylotransferaza guaninowa
7MeGpppN czapeczka typu 0 guanozyna z grupą metylową przy pozycji siódmej guaniny,
połączona jest ona wiązaniem 5'-5' trójfosforanowym z kwasem nukleinowym, mRNA
Rola:
- zabezpiecza przed działaniem egzonukleaz
- ułatwia asocjacje miejsca 5' splicingowego z U1 snRNA
- stanowi sygnał transportu do cytoplazmy
- stymuluje inicjację translacji.
Introny w genach człowieka
Gen Długość (kb) Liczba intronów Część genu, którą stanowią introny
Insulina 1,4 2 67
Albumina surowicy 18 13 89
Kolagen typu VII 31 117 71
Dystrofina 2400 48 >99
Budowa intronów GU-AG
Intron
Końcowka 3' eksonu (A/C A G)- intron: 5'GU PuAGU (...) miejsce rozgałęzienia CUPuAPy
(...)trakt polipirymidynowy Py rich (& ) akceptorowe miejsce składania: NC AG3' koniec 5'
eksonu: (G)
Ogólny schemat splicingu pre-mRNA
Pre-mRNA 5'-ekson-intron GU A AG- ekson-3'
etap I: adenozyna atakuje GU
tworzy się struktura lassa wiązanie pomiędzy guanozyną a adenozyną,
wolna grupa OH eksonu poprzedzającego atakuje miejsce splicingowe 3'
dochodzi do połączenia eksonów, lasso zostaje uwalnianie likwidania rozgałęzienia,
degradacja.
Synteza ludzkiego snoRNA U16
Gen dla białka rybosomalnego L1
DNA Egzon Intron 3' Egzon
Część intronu przy końcu 3' to sekwencja U16 snoRNA
Transkrypcja
Powstaje pre-mRNA Egzon Intron 3' Egzon
Splicing
Powstaje mRNA i lasso intronu
przetwarzanie intronu
powstaje snoRNA U16 i jakieś nieprzydatne skrawki
Błędy w splicingu
Pominięcie egzonu
Egzon 1 Intron Egzon 2 Intron Egzon 3
Egzon 2 został wycięty razem z intronami: zostaje Egzon 1 połączony z Egzonem 3
Egzon 1 Egzon 3
Wybór kryptycznego miejsca splicingu miejsce w egzonie przypomina koniec intronu, może
zostać błędnie rozpoznane
Egzon 1- Intron Egzon 2(w środku kryptyczne miejsce splicingu)
Lasso tworzy się w miejscu kryptycznego miejsca splicingu i część egzonu od intronu do niego
zostaje wycięta wraz z intronem. Powstaje RNA: Zawierajace Egzon 1 połączony z drugą cześcią
Egzonu 2
Egzon 1-część Egzonu 2
Rola snRNP w splicingu pre-RNA
snRNP = snRNA (small nuclear RNA) + białka (proteins) kompleksy
Kompleks angażujący:
5'-Egzon-Intron z przyłączonym U1-snRNP na końcu 5', dalej w miejscu rozgałęzienia (tam
gdzie adenozyna) przyłącza się białko, SF1, U2AF dalej gdzie szlak polipirymidynowy, koniec 5'
Egzon-3
Następnie U2-snRNP przyłącza się tam gdzie SF1, do miejsca rozgałęzienia dochodzi do
oddziaływań między U1-snRNP i U2-snRNP dołączenie się kolejnych kompleksów: U4/U6-
snRNP i U5-snRNP kompleksy te przyciągają się, dochodzi do zbliżenia końca 5' i 3' i
miejsca rozgałęzienia powstaje spliceosom
Rola białek SR w splicingu w pre-mRNA
5'-intron z dołączonymi białkami eksonow wzmacniacz splicingu (ESE)
Do ESE przyłączają się biała SR umożliwia to rozpoznanie SF1 i U2AF-om końca 3' intronu:
traktu polipirymidynowego, miejsca rozgałęzienia.
Introny AU-AC
- Znalezione jak dotąd w ok. 20 genach u człowieka, roślin i Drosophila
- Ich wycinanie przebiega identycznie z intronami GU-AG
- Odmienny zestaw (?)
Alternatywny splicing
DNA Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5
pre-mRNA Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5
Alternatywny splicing: mogą powstać cząsterczki mRNA o kolejności eksonów:
12345 po translacji powstaje białko A
1245 po translacji powstaje białko B
1235 po translacji powstaje białko C
Różne warianty białka to izoformy
Możliwości alternatywnego splicingu RNA:
- wycięcie lub pozostawienie intronu jeden intron zostaje i staje się eksonem
- wycięcie lub pozostawienie eksonu jest wyjebywany z przylegającym intronem
- wzajemne zastępowanie eksonów wycina się eksony z intronami i zamienia eksony miejscami
- alternatywne miejsce splicingu wycinane jest np. pół intronu działa jak kryptyczne miejsce
splicingu, tyle że nie jest to proces patologiczny.
- trans-splicing łączone są ze sobą eksony pochodze pierwotnie z 2 różnych cząsteczek RNA.
Poliadenylacja końca 3' mRNA eukariotycznego
Pre-mRNA: 5'-(...) - AAUAAA CA GU 3'
Składanie kompleksu poliadenylującego:
Do miejsca AAUAAA dołącza się CPSF, do CA-polimeraza poli(A), na nią siadają białka: PABP,
CstF siada na dinukleotyd GU, koniec 3' jest zbędny i zostaje odcięty wszystko za
nukleotydem CA
Poliadenylacja:
poliadenylowane mRNA: 5'- (& ) - AUAAAA CAAAAAAAAAAAA, polimeraza poli(A) dołącza
kolejne adenozyny, na niej siedzi białko PAPB
Tworzenie końca 3' mRNA histonów
Sygnały cięcia:
trzon o długości 6 pz 4-nukleotydowa pętla ok. 12 nukleotydów CAAGAAAGA 3'
Cięcie z udziałem U7-snRNA
U7-snRNA ma sekwencję CUUUCU, która dołącza się do GAAAGA - (? dalej jest coś czego nie
rozczytałam przy przepisywaniu, sorry ?) - reszty adenylowe nie są dodawane
Redagowanie mRNA
procesy powodujące zmianę informacji kodowanej w cząsteczce mRNA
Funkcje redagowania
- tworzenie nowych kodonów start lub stop
- usuwanie kodonów stop
- tworzenie ramek odczytu
- zmiany w kodowanych aminokwasach
1. Mechanizm konwersji zasad
deaminacja:
cytozyna + H O urydyna + NH
2 3
adenozyna + H O inozyna + NH
2 3
bądz aminacja
;
Redagowanie transkryptu apolipoproteiny B
kodon #1...gen apolipotroteiny B...kodon #4564
Edycja zachodzi w kodonie #2153 CAA
Transkrypcja zachodzi tak samo w wątrobie i jelicie, następnie:
a) w wątrobie mRNA nie ulega edycji po translacji powstaje apolipoproteina B-100; 4562
aminokwasy
funkcja: transport cholesterolu w krwi
b) w jelicie niezedytowane mRNA ulega edycji RNA na skutek tego kodon #2153 CAA (=Gln)
ulega wymianie na UAA (=STOP) pod wpływem translacji powstaje apolipoproteina B-48,
2152 aminokwasy, funkcja: absorpcja lipidów z jelita.
Mechanizm redagowania poprzez insercję/delecję nukleotydów
Pan-editing readagowanie na wielką skalę (mitochondria pierwotniaków)
Dodawanie lub usuwanie U bierze w tym udział guideRNA, gRNA, które wiąże się z pre-mRNA,
naznacza on miejsce w pre-mRNA gdzie ma dojść do zmiany, tam działa endonukleaza, następnie
działa
- egzonukleaza wycina U
- UTP + TUT-aza (transferaza) dodaje U
Następnie następuje sklejenie porozczinanych kawałków.
Od DNA do mRNA struktura eukariotycznego mRNA
DNA: promotor->ekson1-intron1-ekson2-intron2-ekson3 (sekwencja ulegająca transkrypcji
gen podzielony intronami: od eksonu1 do eksonu2)
Transkrypcja
pierwotny transkrypt:
ekson1( zawiera kodon aug start dla translacji)-intron1-ekson2-intron2-ekson3(zawiera kodon
uga, uag lub uaa stop translacji)
Dojrzewanie mRNA
Dojrzały mRNA: Czapeczka(m7G)-5'UTR(region 5' nie ulegający translacji)-część eksonu1od
kodonu start (aug)-ekson2-część eksonu3 od kodonu stop (uga, uag, uaa)-3'UTR(region 3' nie
ulegający translacji)-AAA-AAA(ogon poli[A])
Struktura bakteryjnego mRNA:
5'UTR-Białko1-Białko2-Białko3-UTR3'
Przed genem kodującym każde białko oddzielne miejsc startu translacji.
Promotor polimerazy III
- geny dla 5S rRNA wewnątrz sekwencji kodującej Box A, Box C
- geny dla tRNA wewnątrz sekwencji kodującej Box A, Box D
- gen dla U6-snRNA PSE i TATA, pod sekwencją kodującą
Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA III
Gen dla tRNA
A-Box, B-Box dołączają się czynniki TFIIIC dolącza się TFIIIB: kompleks z 3ech białek:
TBP, BRF, Bcośtam dołącza się on przed A-Boxem, dołącza się polimeraza III
Dojrzewanie pre-tRNA
Modyfikacja chemiczna nukleotydów
Urydyna rybotymidyna (T)
Splicing pre-tRNA
Splicing tRNA oddzielnych aktywności nukleazy i ligazy. Wiązania ekson-intron są wycinane
przez nukleazę, tworząc 2', 5'-cykliczny fosforan i koniec 5'-OH.
Terminacja transkrypcji genów eukariotycznych
- terminacja transkrypcji genów grupy I
(?znowu nie mogę doczytać?) dołączenie się PTRF powoduje oddysocjowanie polimerazy i
transkryptu od matrycy DNA
- terminacja transkrypcji genów grupy II związana z poliadenylacją końca 3' transkryptu
- terminacja trankrypcji genów grupy III transkrypt odcinany przez polimerazę
Inhibitory transkrypcji w komórkach eukariotycznych:
a-amanityna wiąże się do RNAPII w pobliżu centrum katalitycznego, jest nieodwracalnym
inhibitorem, gdyż uruchamia degradację największej podjednostki RNAPII do której się wiąże
(inhibitor bardzo selektywny ale powoli działający)
aktynomycyna-D interkalator, wiąże się się do DNA w regionach bogatych w geny G-C
uniemożliwiają wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA (inhibitor szybko
działający, malo selektywny)
DRP-(5,6-dichloro-1-beta-Ribo-furanosyl-Benzimidazole) hamuje elongację transkrypcji
katalizowaną przez RNAPII, ponadto upośledza dojrzewanie rRNA (inhibitor szybko działający
lecz mało selektywny)
Flavopiridol jw.
Tryptolid izolowany z rośliny Trypterygium wilfordii (?polskiej nazwy nie doczytam?)
stosowanego w tradycyjnej medycynie chińskiej hamuje inicjację transkrypcji prowadzoną przez
RNAPI i RNAPII.
Model kompleksu poru jądrowego (NPC ang. nuclear pore complex)
- cytoplazmatyczne filamenty dołączone do cytoplazmatycznego pierścienia
- cytoplazmatyczny pierścień w zewnętrznej błonie
- spoke-ring assembly (?) - kompleks poru jądrowego, w błonie jądra (transbłonowy)
- na środku pierścień środkowy łączy poszczególne elementy
- w środku pierścienia środkowego centralny transporter transbłonowy, centralny kanał (? dalej
nie mogę rozczytać?)
- do wewnętrznej błony jądrowej zakotwiczony pierścień jądrowy
- do tego doczepiony jądrowy koszyk (kosz)
NPC kręgowców zbudowane są z około 30 różnych białek z nukleoporynami, które występują w 8
lub 16 (czasem nawet 32) kopiach na NPC
Nukleoporyny (nups) podzielono na trzy klasy
FG zawierają domeny bogate w powtórzenia Phe-Gly zaangażowane w translokację receptorow
transportu
nukleoporyny pozbawione domen FG; stanowią elementy strukturalne NPC
nukleoporyny należące do białek błonowych, zakotwiczają NPC w blonie jądrowej.
Transport przez kompleks poru jądrowego
Transport aktywny:
RNA/białko rozpoznawane i wiązane z receptorami transportu wiązanie kompleksu transportu
z NPC i translokacja przez kanał centralny uwolnienie RNA/białka z kompleksu transportu
Przejście przez poryny wiąże się z dostarczeniem energii (rozkładem GTP)
Karioferyny pojedyncza rodzina receptorów transportu
- importyny
- eksportyny
Rozpoznają bezpośrednio lub pośrednio z udziałem cząsteczek adaptorowych (?) krótki peptyd
sygnalny na transportowanym białku tj. sygnał lokalizacji jądrowej (NLS ang. nuclear
localization signal) lub sygnał eksportu jądrowego (NES ang. nuclear export signal)
Jądro: Ran-GDP RanGEF (Ran-GDP-exchange factor) Ran-GTP
Cytoplazma: Ran-GTP RanGAP (Ran-GTPase-deactivating protein) Ran-GDP
Karioferyny - specyficzne receptory transportu przez błony jądrowe: eksportyny i importyny,
wymagają białka Ran z GDP/GTP, w jądrze przewaga Ran-GTP, w cytoplaznie przega Ran-GDP
Import
Białka które są transportowane do jądra posiadają sekwencję NLS, czyli miejsce lokalizacji
jądrowej, sekwencja ta wiąże się z importyną, powstaje taki kompleks transportu, przechodzi on
przez kompleks poru jądrowego do jądra
Do kompleksu bialko-importyna w jądrze przyłącza się Ran-GTP oddyscjowanie białka,
importyna połączona z Ran-GTP powraca poryną do cytoplazmy
W białku działa Ran GAP (hydrolaza GTP związanego z Ran) daje energię do rozdysocjowanie
kompleksu
Eskport
Białka ma sekwencję NES (sygnał eksportu jądrowego) sekwencja ta łączy się z eksportyna i z
bialkiem Ran-GTP, tworzy się potrójny kompleks, przechodzi przez porynę w cytoplazmie białko
Ran GAP, rozdysocjowanie eksportyny, białka, Ran-GDP + Pi. Eskportyna przechodzi z
powrotem przez por jądrowy.
Szlaki eksportu RNA
tRNA przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi wiązanie z exp-t
i Ran-GTP, przez pory przechodzą do cytoplazmy
mRNA przetwarzanie, dojrzewanie i wiązaniez czynnikami transportowymi wiązanie z exp-5
i Ran-GTP transport przez por do cytoplazmy
snRNA przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie zczynnikami transportowymi wiązanie z
białkami CBC, PHAX, CRM1, Ran-GTP transport przez por do cytoplazmy.
mRNA nie wymaga białka Ran-GTP przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami
transportowymi mRNA przechodzi przez por jako kompleks białkowy, do tego dowiązują się
inne białka
Etapy translacji
- inicjacja
- elongacja rosnący polipeptydowy łańcuch aminokwasów połączonych wiązaniem połączonych
wiązaniem peptydowym
- terminacja
Rola tRNA w translacji
mRNA do niego lączy się antykodonem tRNA do tRNA przyłączony aminokwas
kodon glicyny: GGA do niego dołącza się tRNAGly z dołączoną Gly (glicyną)
Budowa tRNA
ramię akceptorowe (koniec 5' i 3') na końcu 3' ostatni nukleotyd A tam dołącza się
aminokwas; miejsce konserwatywne CCA (?)
ramię D zawiera dihydroksyurydynę (decyduje o tym jakie aminokwasy mogą się dołączyć do
danej cząsteczki tRNA)
ramię T�c tymina, pseudourydyna, cytozyna
ramię C
ramię antykodonowe po ramieniu C
trójka nukleotydów anty-kodon komplementarne do kodonu, dołącza się do odpowiedniego
kodonu na matrycy mRNA
między antykodonowym a T�c ramię zmienne w tRNA I klasy (??) 3-5 nukleotydów, w II
klasy 13-21 nukleotydów
tRNA izoakceptorowe kilka typów tRNA oddziałujące z jednym aminokwasem
Mechanizm aminoacylacji
Etap 1: aktywacja aminokwasu
aa + ATP "! aa~AMP + PPi
Etap 2: Przenoszenie grupy aminoacylowej na tRNA
aa~AMP + tRNA "!aa-tRNA + AMP
Syntetaza aminoacylo~tRNA wiąże aminokwas i ATP dołącza do aminokwasu AMP, wytwarza
2-
się PPi rozkłada na 2PO następnie chwyta tRNA i łączy z zaktywowanym aminokwasem,
4
wypuszcza AMP
tRNA łączy się z aminokwasem przez adeninę na końcu ramienia akceptorowego
Charakterystyczne cechy syntetaz aminoacylo-tRNA
Cecha Enzymy klasy I
Struktura centrum Równoległa harmonijka �
aktywnego enzymu
Oddziaływanie z tRNA mniejszy rowek
Nietypowe przykłady aminoacylacji do tRNA przyłączony jest inny aminokwas, który dopiero
potem jest modyfikowany np. Bacillus, tRNA przyłączający glutaminę przyłącza się kwas
glutaminowy modyfikacja w glutaminę
metionina N-formylometionina
seryna selenocysteina
Oddziaływanie kodon-antykodon
3' 36-35-34 5' antykodon tRNA
5' 1 - 2 3 3' mRNA
Działanie komplementarności par zasad na pozór (?), zasada tolerancji Cricka
''Pierwsza zasada od 5'-końca antykodonu moŻe z pierwszą i drugą zasadą kodonu tworzyć
tylko właściwe pary, natomiast z trzecią zasadą kodonu - nawet trzy róŻne pary. Oddziaływanie
tego rodzaju między pierwszą zasadą antykodonu i trzecią kodonu jest znane pod nazwą: zasada
tolerancji Cricka.''
oddzialywanie między III nukleotydem kodonu a pierwszym antykodonu oddziaływanie
natywne (?), nie musi być kanoniczne:
G-U
Inozyna (zmodyfikowana puryna) może oddziaływać z A, C lub U
dzięki temu jeden antykodon może oddziaływać z różnymi kodonami
61 kodonów ok. 30 antykodonów
Budowa rybosomu
Rybosom 70S prokariota
2500000 Da
a) podjednostka 50S
- 23S rRNA 2900 nukleotydów
- 34 białka
-5S rRNA 120 nukleotydów
b) podjednoska 30S
21 białek
- 16S rRNA 15400 nukleotydów
Rybosom 80S eukariota
4200000 Da
a) podjednostka 60S
- 28S rRNA 4700 nukleotydów
- 48 białek
- 5S rRNA 120 nukleotydów
b) 40S
- 18S rRNA
- 32 białka
Porównanie rybosomu bakteryjnego, drożdżowego i ludzkiego
40S drożdży dużo białek dodanych
40S człowieka kilka białek dodanych
głowa
dziób
platforma
ramię
ciało
ostroga
w dużej podjednostce u człowieka więcej białek dodanych niż w drożdżowej
Miejsca wiązania tRNA na rybosomie
Duża podjednostka
Miejsce A - aminoacylowe - tkwi na dużej podjednostce
Miejsce P inicjatorowy tRNA podczas inicjacji, cząsteczki tRNA dołączają się do mRNA,
miejsce peptydowe
Miejsce E exit tu się przesuwa cząstki (tRNA) przed odłączeniem ich od rybosomu
Mała podjednostka
- miejsce dekodujące na małej podjednostce, oddziaływanie między kodonem a antykodonem
Centrum peptydylo-transferazy dochodzi do tworzenia się wiązania peptydylowego między
aminokwasem aminoacylotRNA w miejscu a a łańcuchem polipeptydowym w miejscu P.
Nagroda Nobla z chemii 2009
za badania struktury i funkcji rybosomu
Biogeneza rybosomu drożdżowego
Proces skomplikowany, dużo dodatkowych białek bierze udział, jąderko, nukleoplazma,
cytoplazma
transkrypcja RNA pre-rRNA ulega cięciom, dołączają się pierwsze białka 90S pre-
rybosom
podział na 2 podjednostki:
pre-40S i pre-50S, kolejne cięcia w rRNA, białka rybosomalne dołączają się w cytoplazmie
końcowy etap dojrzewania
Translację jednej cząsteczki mRNA może prowadzić jednocześnie kilka rybosomów, co znacznie
zwiększa wydajność wykorzystywania mRNA
cząsteczka mRNA od 5'AUG do UAA 3' wzdłuż niej siedzą sobie rybosomu, każdy syntetyzuje
polipeptyd, wolny N-koniec, powstaje wiele polipeptydów w jednym czasie, rybosomy przesuwają
się od końca 5' do 3', na końcu 3' wypuszczają wolny polipeptyd/białko
Struktura mRNA
Prokariotyczne mRNA
5'UTR (miejsce nieulegające translacji)|białko 1||białko 2||białko 3||UTR 3'
wiele miejsc inicjujących start translacji (dla każdego białka oddzielne)
Eukariotyczne mRNA
5'm7G UTR-jeden kodon start dla translacji- białko 1 - UTR -AAAA 3'
przy końcu 5' guanozyna zmetylowana w pozycji 7 czapeczka; przy końcu 3' ogon
poliadenylowy
Bakteryjne miejsce wiązania rybosomu
AGGAAGGU RBS rybosome binding site na mRNA
UCCUCCA 12S rRNA sekwencja Shine-Dalgarno
Inicjacja translacji u E.coli
IF ang. initiation factor
Inicjacja inna u bakterii, inna u eukariotów
Mała podjednostka rybosomalna IF
30S IF1 IF2 IF3
Inicjatorowy tRNA fenylometionylotRNA
mRNA, który ulega translacji
Rybosom przyłączenie IF1, IF3 powoduje dosocjację podjednostek uniemożliwiającą
przyłączenie dużej podjednostki
do kompleksu dołącza się mała podjednostka + IF + IF3,
przyłącza się formylometionylotRNA, mRNA,czynnik IF2 związany z GTP, przyłączają się
przypadkowo, następnie zmiany konformacji kompleks inicjacyjny 30S oddysocjowanie
czynników IF1 i IF3 hydroliza GTP związanego z IF2 oddysocjowanie czynnika IF2
oddysocjowanie tych wszystkich czynników umożliwia dołączenie się dużej podjednostki
kompleks inicjacyjny 60S
Inicjacja u eukariotów
Inicjacja translacji u Eukariota
eIF ang. eukaryotic initiation factor > 10, niektóre z nich składają się z kilku podjednostek
Przyłączanie kompleksu preinicjacyjnego do mRNA
kompleks preinicjacyjny
inicjatorowy tRNA metionylo-tRNA z dołączonym eIF2 związanym z GTP mała podjednostka
rybosomu 3-eIF-3 inicjatorowy kompleks translacyjny (?), miejsce regulacji translacji u
eukariotów, konserwatywny (?)
Mechanizmy transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów przy udziale RNA
Regulacja ekspresji genów przy udziale ryboprzełączników (ang. riboswitch)
Ryboprzelącznik- ustrukturyzowany fragment mRNA, znajdujący się na końcu 5' w częscie nie
ulegającej translacji (nie zawierającej sekwencji kodującej białko. Ma on dwa fragmenty: aptamer,
mogący wiązać specyficzny ligand i platformę ekspresyjną. Wiązanie ligandu w aptamerze
powoduje zmianę w platformie ekspresyjnej tak, że transkrypcja nie zachodzi.
A hamowanie tranksprypcji - jeżeli aptamer nie ma związanego ligandu, platforma ekspresyjna
tworzy struktura zwaną anty-terminatorem spinka do włosów w dół, nie przeszkadza to w
transkrypcji
jeżeli aptamer zwiąże ligand, anty-terminator przekształca się w terminator, spinka do włosów w
górę, transkrypcja nie zachodzi
B hamowanie translacji w platformie ekspresyjnej siedzi RBS białko wiążace rybosom, tak
dowiązuje się rubosom i rozpoczyna translację
jeżeli ligand wiąże się z aptamerem zmiana konformacji RNA tak że RBS staje się niedostępne dla
rybosomu translacja nie zachodzi.
Regulacja przy udziale ryboprzełączników wiążących TPP (pirofosforan tiaminy) niezbedna
substancja dla metabolizmu cukrowego
mRNA białka wiążące TPP (receptory) są wiązane przez mRNA związane z syntezą i
transportem TPP, jeżeli TPP jest obficie w po|zywce wtedy synteza własnego bylaby stratą
energii, dlatego mamy mechanizm hamujący wtedy transkrypcje.
Jeżeli stężenie TPP jest małe komórka musi dosyntetyzować mRNA 5'-ryboprzełącznik z
aptamerem i miejscem wiązanie rybosomu, dołącza się rybosom, translacja regionu kodującego,
wtedy gen działa zwiększa się poziom TPP, dolącza do ryboprzełącznika (aptameru) miejsce
wiążące rybosom niedostępne translacja nie zachodzi, gen wyłączony.
Mechanizmy potranslacyjnej represji genów przez ncRNA w komórkach bakteryjnych.
Mamy mRNA z miejscami wiązania rybosomu, przyłączają się rybosomu, jeżeli jest tam snRNA
wiąże się z sekwencją RBS 'przykrywają ją' uniemożliwiając wiązenie rybosomów, jeżeli takie
snRNA się dowiąże to zaraz wpada Rnasa (E, III) i tnie mRNA powodując jego degradację.
Interferencja RNA mechanizm kontroli ekspresji genów u Eukariota
Interferencja RNA (RNAi) to zachowawczy ewolucyjnie mechanizm wyciszenia ekspresji genów
przez małe cząsteczki RNAo długości ~ 20-30 nukleotydów
Funkcją maszynerii RNAi jest m.in. ochrona genomu przed wirusami, hamowanie przemieszczania
się do transpozonow wewnątrz genomu, regulacja aktywności genów.
Historia odkrycia interferencji RNA
Pierwszych dowodów na wyciszanie RNA dostarczyły w 1990 roku badania zespołu R. Jorgensena
nad modyfikacją koloru kwiatów petunii
Wprowadzenie transgenu dodatkowej kopii genu syntazy chalkonowej syntaza chalkonowa
odpowiedzialna za produkcję antyocyjanów myslał, że więcej genów będzie powodowało
nadekspresję i ściemnienie kwiatów wynik nietypowy, czesci kwaitów pstrokata purpurowo-
biała a część w ogóle biała.
Sytuację, w której wyciszeszniu ulega zarówno własny gen jak iw prowadzony nazywamy
kosupresją.
S. Guo i K. Kemphues użyli antysensownego RNA aby specyficznie inaktywować gen zwany par-1
u Caenorhabditis elegans (1995 r)
Dna na jego matrycy mRNA > do niego dołącza się komplementarny antysensowny framgent
RNA rybosom nie może się po tym fragmencie przesuwać translacja nie zachodzi.
Caenorhabditis elegans
Pierwszy podzial zygoty w trakcie embriogenezy jest asymetryczny odpowiada za to gen PAR -
1.
Wprowadzenie antysensownego RNA kinazy PAR-1 spowodowało zanik aktywności tego białka.
Pierwszy podział był symetryczny.
Ku zaskoczeniu badaczy ten sam efekt obserwowano po wprowadzeniu sensownego RNA! - a
miala to być próba kontrolna.
Przełom w wyjaśnieniu teg zjawiska badania Andrew Fire'a i Craiga Mello opublikowane w
Nature w 1998 r.
C. elegans typu dzikiewgo mutageneza delecyjna genu unc-22 fenotyp twitcher (kurczenia
ciała_ spowodowany unieczynnieniem genu unc-22 (delecja unc-22), co powoduje utrate kontroli
nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang. uncoordinated
po wprowadzeniu sensownego RNA brak efektu
po wprowadzeniu antysensownego RNA brak efektu
po otrzymaniu dwuniciowego (ds) RNA fenotyp twitcher.
Analiza ilościowa mRNA genu unc-22
Tam gdzie nie było efektu fenotypu ilośc mRNA była stabilna i zbliżona do typu dzikiego
Tam gdzie był twitcher mRNA było na bardzo niskim poziomie lub niewykrywalne
Wniosek: dsRNA powoduje wyciszenie endogennego genu nazwano do zjawisko interferencją.
Wnioski płynące z badań nad C. elegans.
- Mechanizm RNAi jest bardzo specyficzny (wprowadzony do komórki dsRNA) o sekwencji
odpowiadającej fragmentowi endogennego genu, wycisza tylko ten mRNA);
- dsRNA musi zawierać sekwencje odpowiadające dojrzałemu mRNA aby wywołaś efekt RNAi
(dsRNA zawierający sekwencje intronowe lub promotorowe nie wywołuje odpowiedzi);
- wyciszenie przebiega postranskrypcyjnie, prawdopodobnie na terenie cytoplazmy;
- do wywołania RNAi wystarczy obecność zaledwie kilku cząsteczek dsRNA, co gueruje działanie
mechanizmu amplifikujacego cząsteczki dsRNA i/lub katalitycznego
- RNAi może być przydatnym narzędziem w genomice funkcjonalnej organizmów eukariotycznych.
W jaki sposób dwuniciowe cząsteczki RNA wywołują wyciszanie docelowego mRNA?
A. J. Hamilton i D.C Baulcombe, jako pierwsi (1999r.) pokazali, że w potranskrypcyjne
wyciszanie genów u roślin (PTGS) są zaangażowane krótkie, 25-nukleotydowe dsRNA
Mechanizm interferencji RNA badania nad Drosophila melanogaster
dsRNA obcy dwuniciowy RNA bedący składnikiem RNA muszki potrafią go zniszczyć.
Bierze w tym udział występująca u eukariotów rybonukleaza Dicer dsRNA jest cięte na siRNA
i inaktywowane
siRNA małe, interferujące RNA, dwadzieścia kilka nukleotydów, specyficzne, dwa końce
niezwiązanie na nici jednej z jednej strony, dwie z drugiej lepkie końce
Dolączają się białka argonauta i inne, tworzy się RISC (an.g RNA-induced silencing complex)
siRNA zostaje rozwinięte, jedna nić zostaje pocięta czyli zdegradowana,a druga wiąże się z
komplementarnym RNA i powoduje jego degradację, tną nam to nukleazy gdzie jest zaznaczone
siRNA.
Proces RNAi przebiega w szczegółach nieco inaczej u roślin, grzybów, bezkręgowców i
kręgowców. Odpowiednio też u roślin proces ten często nazywa się potranskrypcyjnym
wyciszaniem genów PTGS (ang. postrtranscriptional gene silencing), tłumieniem genów u
grzybów (ang. quelling) i RNAi u zwierząt.
Obecnie wiadomo, że małe RNA są kodowane przez genomy eukariotyczne. Ze względu na
mechanizm biogenezy i typ białek Argonaute (Ago) z któryi są zasocjowane dzielimy je na trzy
klasy:
- siRNA (~21 nt): endo-siRNA i exo-siRNA
oddziałuja z białkami Ago
- miRNA (microRNA, ~22nt)
- piRNA (~24-31 nt) RNA oddziałujące z białkami Piwi
miRNA regulatory ekspresji mRNA w komórkach zwierzęcych i roślinnych
- Regulują ekspresję genów poprzez hamowanie ekspresji mRNA (uważa się, że ekspresja ok. 10-
30% genów kodujących białka w komórkach zwierzęcych jest regulowana przez miRNA)
- odkryte w 1993 roku (lin-4 u C.elegans)
Biogeneza miRNA
w jądrze mamy geny je kodujące, czasem są to introny, RNA pol II/II transkrypuje, mamy pri-
mikroRNA tniemy, powstaje pre-mikroRNA, eksportyna 5 i Ran-GTP dowiązuje sie,
transportowane do cytoplazmy cięcie Dicerem w kompleksie z TRBP
Zasady oddziaływania miRNA mRNA
Sekwencja kodująca koniec 3' UTR koniec poliadenylowy,
Do fragmentu 3' UTR dołącza się miRNA w kompleksie białkowym na zasadzie
komplementarności komplementarność pełnia u roślin, u zwierząt tylko niektóre nukleotydy (od
2 do 8 nukleotydu i potem znowu)
Wyciszanie ekspresji genów
a) transkrypcyjne wyciszanie genów (ang. transcriptional gene silancing TGS) modyfikacja
chromatyny ->brak transkryptu RNA
b) potranskrypcyjne wyciszanie genów (ang. post-transciptional gene silencig-PTGS)
- zahamowanie translacji
- degradacja mRNA
RNAi jako narzędzie badawcze
Jeżeli wprowadzimy dwuniciowe RNA i wyciszymy dany gen możemy po obserwacji fenotypu
wnioskować o jego funkcji
gotowe wektory ekspresji RNAi do jądra, tam powstaje RNAi, możemy tez od razu
zsyntetyzować RNAi de novo w wyniku syntezy chemicznej i wprowadzić do komórki gotowe
Zastosowanie technologii malych RNA w rolnictwie
wyciszanie genów sluży do eliminacji elrgenów z orzeszków ziemnych
kontrola szkodników,
Zastosowanie technologii małych RNA w terapii chorób u człowieka
Schorzenie Etap
AMD (starcze zwyrodnienie plamki) II faza badań klinicznych
Cukrzycowy obrzęk plamki (DME) II faza badań klinicznych
RSV (wirus zapalenia oskrzeli) II faza badań klinicznych
Aktywacja RNA (ang. RNA activation, RNAa)
Pierwsze doniesienie o istnieniu mechanizmu RNAa 2006r. aktywacja ekspresji genów za
pośrednictwem małych dsRNA zwanych saRNA (ang, small activating RNA) saRNA są
komplementarne do pewnych regionów promotorowych DNA i aktywują transkrypcję DNA ok.
10-krotnie
Molekularne podstawy chorób nowotworowych
Biologia molekularna nowotworu
* onkos (z greckiego) masa, guz; logos nauka ONKOLGIA
* nowotwór (łac. nieoplasma) nieprawidłowy i nadmierny rozrost tkanki ustroju,
nieskoordynowany z pozostałymi tkankami, trwający mimo ustapienia czynnika, który go wywołał.
Nowotwór łagodny komórki rozrastające się tworzą pojedyczny guzek, otorbiony, który
powiększa stopniowo swój rozmiar i rozpycha okoliczne tkanki, nie dając przrzutów. Takimi
nowotworami są np. tłuszczaki, wywodzące się z tkanki tłuszczowej. Występują w tkance
podskórnej pod postacią miękkich, ruchomych guzków.
Nowotwor złośliwy nowotwór rozrastający się w sposób naciekający wnika między komórki
prawidłowej tkanki. Nie ma wyraznej granicy między nowotworem złośliwym a łagodnym.
* rak nowotwór złośliwy wywodzący się z tkanek nabłonkowych skóry, płuc , piersi, trzustki,
wątroby, innych narządów, jest najczęściej spotykanym nowotworem złośliwym; w literaturze
anglosaskiej i popularnie synonim nowotworu złośliwego (ang. carcinoma)
* mięsak rodzaj nowotworu złośliwego, który powstaje z tkanki mięśniowej, tłuszczowej i
chrząstki
*chłoniak nowotwór złośliwy powstający wukladzie limfatycznym
Nowotwór złośliwy miejscowo mają niektóre cechy nowotworów złośliwych, ale nie dają
przerzutów, lub mają histologiczne cechy nowotworu łagodnego a często dają nawroty. Należą do
nich:
- rak podstawnokomórkowy skóry
- większość glejaków złozlwych mózgu
- guz mieszany ślinanek
Nowotwór jest chorobą o podłożu genetycznym rozwijający się w wyniku zmian w różnych genach
o charakterze:
- mutacji dotyczą następujących genów
* protoonkogeny (mutacja powoduje ich aktywację onkogeny)
* geny supresorowe (mutacja powoduje ich inaktywację)
* geny naprawy DNA (mutacja powoduje niestabilność genetyczną)
* geny microRNA (mutacja powoduję zmianę ekspresji białek)
- zaburzeń epigenetycznych, np. hipermetylacji genów
Mutacje genowe zwiększające ryzyko rozwoju nowotworu
a) dziedziczne
b) nabyte
- spontaniczne
- działanie czynników środowiskowych
Pojedyncza mutacja nie powoduje transformacji nowotworowej
Zmiany Zwiększona ilość Wzrost polipa Wzrost złośliwego
komórkowe: podziałów komórkowych guza (carcinoma)
ZmianyZaktywowany gen supresorowy drugi gen
DNA: onkogen guza supresorowy
zinaktywowany guza zinaktywowany
Nowotów nie jest chorobą dziedziczną, dziedziczą się predyspozycje do zachorowania.
Predyspozycje genetyczne można podzielić na
- predyspozycje silne związane z dziedziczonymi od rodziców zmianami (najczęściej mutacjami)
w genach supresorowych i genach naprawy DNA
Nazwa zespołu Gen Typ nowotworu
Zespół siatkówczaka RB1 siatkówczak, mięsaki
Polipowatość gruczolakowata jelit APC rak jelita grubego, kostniaki
Zespół Blooma BLM białaczki, chłoniaki
i gruczolakoraki układu
pokarmowego
Zespół Li-Fraumeni TP53 mięsaki, glejaki, rak piersi, rak
kory nadnerczy
Dziedziczny niepolipowaty rak jelita grubego, trzonu
rak jelita macicy, moczowodu
i miedniczki nerkowej
Etapy karcynogenezy
Przekształcanie się komórki prawidłowej w nowotworową nazywamy transformacją nowotworową.
To złozony proces w którym można wyodrębnić cztery etapy
ETAP I
Preinicjacja
Ekspozycja na karcynogeny: chemiczne, fizyczne, biologiczne
Chemiczne: związki alkilujące, barwniki akrydynowe, wielkopierścieniowe węglowodory
aromatyczne
Fizyczne: promieniowanie UV
Biologiczne: wirusy (HPV, Epstein Barr, HCV typu B, Herpesvirus)
bakterie (Helicobacter pylori)
Trwa całe życie
ETAP II
Inicjacja
Ngromadzenie zmian prowadzących do transformacji
Trwa od kilku do 20-30 lat
Tor mutacyjny
Predyspozycje genetyczne
ETAP III
Promocja
Selekcja klonalna
Nowotwór in situ
Trwa zwykle do kilku lat
Etap III nieleczony zawsze przechodzi w ETAP IV
Progresja
Dalsza selekcja mutacji
Nowotwór nabywa zdolność do przerzutowania
Trwa od kilku miesięcy do kilku lat
Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku
http://www.onkologia.org.pl/
Spośród 100 typów nowotworów rozpoznawanych każdego roku, zaladwie kilka stanowi aż 60
proc. wszystkich zachorowań.
U mężczyzn dominuje rak: pluca (20 proc.), gruczołu krokowego (14 proc.), jelita grubego (7
proc.), pęcherza moczowego (7 proc.) oraz żołądka (5 proc.)
U kobiet dominują rak: piersi (23 proc.), płuca (9 proc.) , trzonu macicy (7 proc.), jelita grubego
(6 proc.), jajnika (5 proc.)
Rak zaczyna powstawać wówczas, gdy komórka wyłamuje się z mechanizmów regulujących jej
podziały i degradację.
Cykl komórkowy a transformacja nowotworowa
M (profaza, metafaza anafaza, telofaza) G0 zatrzymanie podziałów i końcowe róznicowanie
Czas trwania cyklu komórkowego
Typ komórek Czas trwania cyklu komórkowego
Komórki embrionalne żaby 30 minut
Komórki drożdży piekarniczyc 1,5- 3 godziny
Komórki nabłonka jelit ~ 12 godzin
Ssacze fibroblasty
Układ kontroli cyklu komórkowego włącza replikację i mitozę oraz sprawdza, czy poprzedni
etap cyklu został zakończony, czy komórka jest w pełni przygotowana do następnego etapu
Punkty kontrolne cyklu komórkowego punkty kontrolne G1 i G2.
Programator cyklu komórkowego: M G1 S M
wejście w fazę S punkt kontroli G1:
czy środowisko jest sprzyjające?
czy DNA jest uszkodzony?
Kontrola cyklu komórkowego oparta jest na zmianach w aktywnościa kinaz zleżnych od cyklin
Cdk (ang. cyclin - dependent kinase)
U ssaków poszczególne etapy cyklu komórkowego są regulowane przez cztery różne kinazy
zależne od cyklin
Kompleks cyklina-Cdk Cyklina Partner Cdk
G1-Cdk cyklina D* Cdk 4, Cdk 6
G1/S-Cdk cyklina E Cdk 2
S-Cdk cyklina A Cdk 2
M-Cdk cyklina B Cdk 1
* U ssaków są 3 różne cykliny D
Cykliny są pozytywnymi regulatorami kinaz zależnych od cyklin, a ich poziom zmienia się w
czasie cyklu komórkowego.
Do pełnej aktywności Cdk niezbędna jest fosforylacja aktywująca
Cdk + cyklina + CAK (kinaza aktywująca) kompleks CAK-Cdk aktywny kompleks Cdk-
cyklina
Aktywność Cdk może być hamowana przez fosforylację oraz przyłączanie białek inhibitorowych.
Cdk ufosforylowana jedną resztą fosforanową aktywna, tworzy kompleks z cykliną, może być
jeszcze ufosforylowana fosfatazą Cdc25 i wtedy jej aktywność jest zahamowana druga reszta
fosforanu dziala hamująco. Podwójnie ufosforylowana Cdk może być zdefosforylowana do formy
aktywnej przez kinazę Wee1
Aktywność Cdk jest regulowana przez degradację cyklin.
Połączenie różnych Cdk z cyklinami uruchamia kolejne zdarzenia w komórce
* Zaburzenia w transmisji sygnałów wzrostu onkogeny
(pedał gazu w samochodzie się zaciął wciśnięty!)
* utrata zdolności do rozpoznawania sygnałów antywzrostowych geny supresorowe
(hamulce przestaly działać)
* zaburzenia w systemach naprawy DNA geny stabilizujące
(mechanik nic nie warty!)
Protoonkogeny stymulują wzrost komórek nadmierna aktywność onkogeny powstanie
nowotworu
DNA protoonkogenu
a)mutacja w genie onkogenu hiperaktywne białko w normalnej ilości
b) zwielokrotnienie kopii genu normalne białko w nadmiarze
c) gen przenoszony do nowego locus na DNA pod innymi mechanizmami kontroli nowy
promotor normalne białko w nadmiarze
Onkogen jest dominujący w stosunku do swojego prawidłowego allela.
Funkcje białek kodowanych przez protoonkogeny
- czynniki wzrostowe np. PDGF (ss)
- receptory czynników wzrostu
np. receptor EGF (erbB)
�!
Src(src) Ras (ras)- Raf(raf)
- kinazy białkowe lub białka aktywujące kinazy białkowe, cdk
- cykliny białka które kontrolują cykl komórkowy np. cyklina D
Geny supresorowe (anty-onkogeny) hamuja rozwój komórek mutacje powodujące zmianę
funkcji powstawanie nowotworu
* do powstania nowotworu dochodzi, gdy dwie niezależne mutacje unieczynniają oba allele
supresora
* o predyspozycji genetycznej do nowotworu mówimy, gdy jeden z dziedziczonych alleli jest już
uszkodzony
* dwa najlepiej scharakteryzowane geny supresorowe nowotworów to geny kodujące białko p53
Białko p53 strażnik genomu
przed zmianą genomu foton UV po dimery tymidynowe
aktywacja p53 w komórkach opalonej na czerwono skóry dwa możliwe efekty:
* zahamowanie cyklu komórkowego
* naprawa DNA umożliwia wznowienie cyklu komórkowego
lub
* apoptoza
* komórka umiera
Mechanizm regulacji cyklu komórkowego przez p53 punkcie restrykcyjnym G1/S
promienie X uszkodzenie DNA aktywacja kinazy białkowej i fosforylacja p53:
Mdm2 + p53' Mdm2 + aktywne, stabilne p53
(w przypadku, gdy do uszkodzenia DNA nie dochodzi, p53' nie jest fosforylowane i ulega
degradacji w proteasomach)
Aktywne p53 wiąże się do regionu regulatorowego genu p21
Transkrypt genu p21 + aktywne p53 translacja genu p21 powstaje p21 (inhibitor białka
Cdk)
Ufosforylowane,aktywne G1/S Cdk i S-Cdk + p21 nieaktywne, skompleksowane z p21
C1/S-Cdk i S-Cdk
Apoptoza prgramowana śmierć komórki
Etapy apoptozy:
kondensacja chromatyny i kurczenie się komórki fragmentacja DNA rozpad jądra
tworzenie ciałek apoptotycznych
Infekcja a nowotworzenie
Bakterie:
- Helicobacter pylori (rak i chłoniak żołądka)
- Chlamydia (chłoniaki)
- Fusobacterium nucleatum (rak jelita grubego i odbytu)
Pasożyty:
- przywra krwi (rak pęcherza moczowego)
- motylica wątrobowa (rak przewodow żółciowych)
Wirusy:
-Epstein Barr Virus (chłoniak Burkitta, rak nosogardła)
- HPV 16, 18, 31, 33 (rak szyjki macicy, sromu, pochwy, jamy ustnej i gardla)
- HHV-8 (mięsak Kaposiego)
- Hepatitis B i C (rak wątrobowokomórkowy)
- HTLV-1, HIV
Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) a nowotwór
E7 pRB/E2F blokowanie zajścia w fazę S cyklu komórkowego
Jeżeli ten mechanizm zawiedzie mamy do czynienia z nieprawidłową proliferacją komórki
reaguje białko p53 kontrola cyklu komórkowego, apoptoza
Jeżeli nie zadziała ono na E6 w kompleksie w E6-12 wydłużona proliferacja komórki wtedy
E6 + C-Myc HERT powoduje skracanie telomerów starzenie się komórki, jeżeli jednak
telomery nie skracają się mamy do czynienia z immortalizmem komórki
M�rger K et al. J. Viral 2004
Cechy komórki nowotworowej
- samowystarczalność w zakresie sygnałów wzrostu (proliferacji)
- ignorowanie sygnałów hamowania proliferacji
- unikanie apoptozy samobójstwa komórki
- angiogeneza
- inwazja (?) tkanek i przerzutowanie
- nieograniczony potencjał replikacyjny nieśmiertelność
Przyczyny powstawania nowotworów
- obecnie nie można z całą pewnością określić przyczyny większości nowotworów
- epidemiolodzy uważają, że 31% (?) nowotworów u ludzi wywołują czynniki środowiskowe
- narażenie na czynniki rakotwórcze musi trwać przez wiele lat, aby postępująca dysplazja uległa
przemianie nowotworowej
- niektóre wyjątki
a) białaczki indukowane promieniowaniem jonizującym 2 lata
b) nowotwory wieku dziecięcego uw. genetycznie
Diagnostyka molekularna
Poznanie mechanizmów molekularnych prowadzących do rozwoju nowotworu przyczyniło się do
powstania testów umożliwiających:ocenę ryzyka zachorowania
ocenę przebiedu choroby i ustalenia prawdopodobieństwa
nawrotu choroby po zabiegu
Testy mogą być wykonywane w próbkach materiału biologicznego: pobrnego pod pacjenta
(fragment guza, próbka moczu czy krwi) w materiale archiwalnych (blok parafinowy)
* markery prognostyczne wskazują na przewidywalny przebieg naturalny choroby i rokowania
* markery predykcyjne markery, których obecność jest związana z prawdopodobieństwem
uzyskania korzyści (najczęściej obiektywna odpowiedz na leczenie)
* markery ryzyka dają możliwość oszacowania ?
Markerem biochemicznym jest dowolna substancja wielkocząsteczkowa umożliwiająca odróżnienie
komórki prawidłowej od nowotworowej (najczęściej białko adhezyjne lub empatyczne)
* specyficzne dla pewnych komórek ale w prawidłowych warunkach nieobecne w dorosłym
organizmie (albo w danej tkance): AFP, CEA
* obecne w prawidłowych komórkach, ale w mniejszym stężeniu niż wykrywalne
Pożądane cechy idealnego markera
- wysoka czułość i wysoka swoistość czułość testu zdolność do wykrycia nowotworu (np.
czułość rzędu 80% - badanie wykrywa chorobę u 8 na 10 chorych, 20% wyników test fałszywie
ujemny)
Markery biochemiczne CEA, ang. carcinoembryonic antigen
Glikoproteina, produkowana w życiu płodowym przez przewód pokarmowy, wątrobę i trzustkę.
Podwyższony w:
- raku jelita grubego ( u 2/3 pacjentów wzrost CEA pierwsza oznaka choroby)
- innych chorobach rozrostowych ( w 30-50%): raku piersi, torbielakogruczolakoraku jajnika,
gruczolakoraku szyjki macicy
- także: u palaczy, w przebiegu POChP, w chorobach zapalnych jelita grubego, zapaleniu
wątroby, marskości wątroby, niewydolności nerek
- także: u 3% zdrowej populacji

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Biologia ewolucyjna 2 Wykłady UMCS
wykład V biologia molekularna
wykład IV biologia molekularna najwazniejsze o laminach
Metody i techniki stosowane w biologii molekularnej
BIOLOGIA MOLEKULARNA
Metody stosowane w biologii molekularnej
Biologia molekularna DNA
notatek pl O yhar, biologia molekularna, Synteza i procesowanie eukariotycznego RNA
Biologia komórki wykład 2
Biologia Molekularna Roślin skrypt do ćwiczeń (2002)
Metody biologii molekularnej w diagnostyce medycznej
notatek pl dr Barbara Michalec Wawi Žrka, Biologia molekularna, zagadnienia do kolokwium zaliczeniow
biologia molekularna skrypt2010
notatek pl o yhar,biologia molekularna, opracowanie zagadnie kolokwium I

więcej podobnych podstron