Akademia Medyczna w Gdańsku
Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
Ćwiczenia z Biologii Molekularnej
dla III roku Medycyny Laboratoryjnej.
Rok 2007
Spis treści:
CZ
ŚĆ PIERWSZA: DNA................................................1
1. KLONOWANIE DNA......................................................................................................1
1. 1. Zagadnienia ogólne:...................................................................................................1
1.2. System ekspresyjny z udziałem polimerazy faga T7..................................................4
1.3. Przygotowanie i transformacja komórek kompetentnych...........................................9
2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO MODYFIKACJI DNA.........11
2.1. Enzymy restrykcyjne - Obróbka enzymatyczna oczyszczonego DNA.....................11
2. 2. Fosfataza alkaiczna  enzym modyfikujÄ…cy koniec 5 DNA..................................11
2. 3. Ligaza DNA faga T4................................................................................................12
2. 4. Polimeraza DNA Taq...............................................................................................13
3. IZOLACJA PLAZMIDU METOD
LIZY ALKALICZNEJ...................................14
4. AMPLIFIKACJA DNA in vitro METOD
PCR........................................................16
5. DETEKCJA I ANALIZA DNA.....................................................................................20
5. 1. Elektroforeza dna na żelu agarozowym...................................................................20
CZ
ŚĆ DRUGA: BIAA
KA...............................................22
1. PRODUKCJA ZREKOMBINOWANEGO BIAA
KA ................................................22
1.1 Sprawdzenie poziomu indukcji białka.......................................................................22
2. IZOLACJA I OCZYSZCZANIE BIAA
KA..................................................................24
3.ANALIZA ILOÅšCI I JAKOÅšCI BIAA
KA....................................................................26
3. 1. Elektorforeza poliakrylamidowa białek...................................................................26
3. 2. Western blotting  immunobloting..........................................................................29
CZ
ŚĆ PIERWSZA: DNA
1. KLONOWANIE DNA.
1. 1. Zagadnienia ogólne:
Technika klonowania polega na wprowadzeniu do komórek biorcy ściśle określonego
odcinka DNA dawcy zawierającego jeden lub kilka genów w celu zmienienia właściwości
biorcy. Fragment DNA, który ma być wprowadzony do komórek biorcy musi zostać
połączony odpowiednim wektorem (nośnikiem). W efekcie otrzymuje się klony, czyli zbiór
identycznych organizmów. Narzędzia wykorzystywane w klonowaniu to:
1) szczepy bakteryjne, 2) wektory, 3) enzymy.
W dużym skrócie najczęściej wykonywany schemat klonowania przebiega w następujący
sposób:
1. DNA przeznaczony do klonowania może być wyizolowany z komórek dawcy lub
zsyntetyzowany chemicznie (PCR).
2. Następnie oba końce klonowanego fragmentu DNA zostają pocięte przy użyciu
enzymów restrykcyjnych.
3. Otrzymane fragmenty miesza się następnie in vitro w odpowiednim stosunku z
wektorem uciętym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Użycie odpowiednich
enzymów restrykcyjnych powoduje, że klonowany fragment DNA i ucięty wektor
posiadają komplementarne do siebie końce (końce lepkie lub tępe  patrz roz. 2.1)
4. Wektor i fragment DNA zostają połączone przy udziale ligazy DNA faga T4. (patrz
roz. 2.3)
5. Uzyskane w ten sposób hybrydowe cząsteczki DNA wprowadza się metodą
transformacji do odpowiednio przygotowanego biorcy. Biorca powinien zapewnić
ekspresję klonowanego DNA, jak również zwiększyć liczbę kopii zrekombinowanego
wektora.
6. Uzyskane klony selekcjonuje się na odpowiednich podłożach (zwykle zawierającymi
antybiotyk). Najczęściej stosowanym gospodarzem dla obcego DNA są komórki
bakteryjne.
Klonowanie umożliwia wyizolowanie z heterogennej mieszaniny DNA fragment DNA
będący przedmiotem naszego zainteresowania i jego powielenie, tzn. amplifikację w np.
komórce mikroorganizmu. Użyty do klonowania DNA nie musi być pochodzenia
bakteryjnego, z kolei musi zostać połączony z wektorem, który ma zdolność do
autonomicznej replikacji w mikroorganizmie. Wybór eukariotycznego gospodarza wiąże się z
użyciem wektora zdolnego do replikacji w tym organizmie. Hodowanie bakterii niosących
zrekombinowane DNA nie stanowi większego problemu, umożliwia to wyizolowanie dużej
ilości zarówno specyficznego DNA jak i produktu białkowego, które można poddać dalszym
badaniom.
Do klonowania genów są potrzebne:
1. Fragment DNA, który zamierzamy klonować. Najczęściej jest to krótki odcinek DNA
powstały po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (posiada lepkie lub
tępe końce) lub mechanicznym fragmentowaniu (tępe końce lub lepkie
niespecyficzne) bÄ…dz
produkt PCR.
2. Wektor, zapewniający powielenie obcego DNA w komórkach gospodarza. Stosuje się
generalnie dwa rodzaje wektorów: plazmidowe i pochodzenia wirusowego. Wśród
tych drugich dużą popularność zyskały prokariotyczne fagi Escherichia coli
dwuniciowe (bakteriofag ) i jednoniciowe (bakteriofagi M13 i f1) oraz eukariotyczny
wirus SV40.
3. Gospodarz, zwykle jest to szczep bakteryjny, drożdżowy lub eukariotyczna linia
komórkowa o odpowiednio zmodyfikowanym dla celów inżynierii genetycznej i ściśle
określonym genotypie.
1.1.1. Wektory plazmidowe.
Plazmidy - koliste zamknięte, pozachromosomalne, autonomicznie replikujące się
cząsteczki DNA. Stały się one główną bazą do konstrukcji wektorów plazmidowych.
Występują naturalnie w komórkach wielu gatunków bakterii Gram-dodatnich i Gram-
ujemnych. Przenoszą informację genetyczną, która wielokrotnie pełni ważną funkcje w
komórce. Wśród najistotniejszych cech fenotypowych kodowanych przez plazmidowe
DNA wymienić można: oporność na antybiotyki, jony metali ciężkich, produkcje
antybiotyków, kolicyn, prostych węglowodanów, niektórych toksyn itp. Obecnie
praktycznie nie wykorzystuje siÄ™ ich w nie zmienionej formie w procesie klonowania.
Wektor  to autonomicznie replikująca się cząsteczka DNA, która została
skonstruowana sztucznie na bazie naturalnych plazmidów w celu przenoszenia
dodatkowej informacji genetycznej. Ogólnie rzecz biorąc wektory są pochodnymi
naturalnie występujących plazmidów.
Podstawowe modyfikacje wprowadzone do wektorów plazmidowych:
1. Redukcja masy cząsteczkowej. Im mniejszy wektor tym większa jego pojemność
oraz prościej nim manipulować (np. tworzyć mapę restrykcyjną klonowanego
DNA)
2. Usunięcie genów warunkujących możliwość transferu zrekombinowanego
plazmidu do innych bakterii  przekazywanie wektora odbywać się będzie jedynie
w pionie (czyli z komórek macierzystych do potomnych).
3. Włączenie w miejsce gdzie ma być wklonowanie obce DNA syntetycznego
oligonukleotydu z sekwencjami rozpoznawanymi przez wiele enzymów
restrykcyjnych  miejsce wielokrotnego klonowania (ang. Multiple Cloning Sites
 MCS).
MCS umożliwia bezpośrednie wstawienie fragmentów klonowanego DNA, które
powstały przez trawienie jednym z wielu lub (najczęściej) dwoma różnymi
enzymami. Oznacza to, że wektor który zostanie wybrany do klonowania musi w
miejscu MCS posiadać miejsca restrykcyjne dla takich samych enzymów, jakimi
zostanie potraktowany fragment obcego DNA, który ma być do niego
wprowadzony. Dzięki temu łączone za pomocą ligazy końce będą
komplementarne. Klonowanie tylko w miejscu MCS gwarantuje, że przy ekspresji
klonowanego genu będzie zachowana ramka odczytu.
4. Wprowadzenie silnego promotora przed miejscem MCS. Jego obecność zapewnia
wydajnÄ… ekspresjÄ™ klonowanego genu.
Inne istotne cechy, które powinien posiadać dobry wektor:
1. Obecność jednego lub kilku genów markerowych, służących do wyróżnienia i
selekcji transformantów, czyli komórek, które pobrały zrekombinowany wektor
(głównie są to geny oporności na antybiotyk np. ampicylinę, tetracyklinę,
chloramfenikol, kanamycynÄ™)
2. Powinien być dobrze scharakteryzowaną pod względem fizycznym i chemicznym
czÄ…steczkÄ…, Å‚atwÄ… do oczyszczenia.
3. Nie powinien zawierać genów, których rozprzestrzenianie może stanowić
zagrożenie dla życia lub zdrowia ludzi, zwierząt czy roślin.
Gwałtowny rozwój biologii molekularnej sprawił, że ilość konstruowanych wektorów jest
olbrzymia i nie sposób w skrócie opisać całej wiedzy na ich temat. Tworzono serie wektorów
przeznaczonych do bardzo konkretnych celów. Jedną z ważniejszych to grupa wektorów
ekspresyjnych.
1.1.2. Wektory ekspresyjne
Zawierają one silny promotor, podlegający regulacji zewnętrznej, służący do
wyrażania obcych genów
Wykorzystuje siÄ™ m. in. promotor laktozowy, dziki lub zmodyfikowany (lacUV5),
tryptofanowy, lambdowe PL (promotor lewy) i PR (p. prawy), promotory fuzyjne tac
(połączenie laktozowego i tryptofanowego) i inne.
Mogą zawierać też terminatory transkrypcji oraz sygnały translacyjne.
Obce geny mogą być wyrażone jako białko natywne lub jako fuzja z innym, dobrze
scharakteryzowanym białkiem.
Ważnymi seriami wektorów w tej grupie są wektory zawierające promotor faga T7
rozpoznawane wyłącznie przez polimerazę faga T7.
Polimeraza RNA faga T7 jest bardzo specyficzna wobec swoich promotorów, nie
rozpoznaje również obcych (inne niż faga) sygnałów terminacyjnych. Przeprowadzana
przez nią transkrypcja przebiega 5 razy szybciej niż w przypadku polimerazy RNA E.
coli. Ponadto jest białkiem niewrażliwym na rifampicynę (antybiotyk ten blokuje
polimerazÄ™ RNA E. coli).
Zespół F. Studiera skonstruował serię wektorów pET (plazmid for expression by T7
RNA polymerase). Wektory wykorzystywane do ekspresji produktu białkowego
klonowanego genu.
Posiadają promotor i terminator dla polimerazy RNA faga T7 oraz sygnały startu
translacji pochodzące od fagowego genu 10 (główne białko kapsydu).
Do promotora polimerazy T7 dodano operator promotora laktozowego w pozycji +2
(patrz mapa plazmidu pET16b). Daje to możliwość regulacji ekspresji przy pomocy
represora LacI, dla którego gen też został wprowadzony do wektorów pET (Warto
przypomnieć sobie regulacje operonu laktozowego!). Aby zaszła wydajna ekspresja
klonowanego genu z takiego wektora w szczepie bakteryjnym musi posiadać on gen
polimerazy RNA faga T7.
Aby ułatwić oczyszczanie klonowanego białka dodatkowo do wektorów pET
wprowadzono za MCS sekwencje kodującą 10 lub 6 reszt histydyny. Dzięki temu
produkt białkowy na swym N lub C końcu dodatkowo uzyskiwał polihistydynowy
 ogon . Do oczyszczania takiego białka można wykorzystać chromatografię
powinowactwa (roz. 9). Wektory i szczepy oraz zestawy do oczyszczania
wykorzystywane do stworzenia takiego produktu białkowego nazwano systemem pET
His-Tag lub systemem ekspresyjnym z udziałem polimerazy faga T7.
1.2. System ekspresyjny z udziałem polimerazy faga T7
1.2.1.Elementy składowe systemu:
Wektor zwierajÄ…cy promotor Ø 10 (promotor genu 10 z faga T7)  np. pT7 i
rodzina wektorów pET (firma Novagen) np. PET16b, pET15b , pET23a.
Promotor Ø 10 jest bardzo wydajnym promotorem in vitro i in vivo, który
rozpoznawany jest tylko przez polimerazÄ™ RNA faga T7
Szczep bakteryjny posiadajÄ…cy gen kodujÄ…cy polimerazÄ™ RNA faga T7.
- Gen ten może znajdować się na plazmidzie np. pGP1-2 w przypadku szczepu
E. coli K 38.
- Może też znajdować się na chromosomie bakteryjnym jak w przypadku
szczepu E. coli BL 21 (DE3). Szczep ten jest stabilnym lizogenem faga DE3
z genem polimerazy T7 pod kontrolÄ… promotora lacUV5.
Wektor pET 16b
" Plazmid ekspresyjny do klonowań translacyjnych - celem klonowania jest
produkt białkowy
" MCS z odpowiednimi miejscami cięcia dla enzymów restrykcyjnych (NdeI,
XhoI, BamHI)
" Promotor T7 rozpoznawany tylko przez polimerazÄ™ RNA faga T7
" Sekwencja OPERATORA lacO, (fragment regulatorowy operonu
laktozowego) zlokalizowany tuż za promotorem a przed sekwencją MCS (patrz
mapa plazmidu). Jeżeli z sekwencją operatora połączy się represor LacI,
transkrypcja zostanie zablokowana. Represor stanowi fizycznÄ… przeszkodÄ™ dla
polimerazy. Do zajścia ekspresji klonowanego genu oprócz polimerazy RNA
faga T7 wymagana jest obecność induktora, IPTG znoszącego represje.
" Klonowanie genu białka w miejsce MCS pET16 wprowadza na N-końcu
białka 10 reszt His (ogon polihistydynowy), dzięki temu do oczyszczania
produktu białkowego można wykorzystać chromatografię powinowactwa.
" Obecność genu bla gwarantującego gospodarzowi oporność na ampicylinę,
- umożliwia selekcję odpowiednich klonów. Po transformacji bakterie należy
wysiewać wyłącznie na pożywkę z ampicyliną. Dzięki temu
uzyskamy wzrost tylko tych komórek, które pobrały plazmid.
IPTG  induktor niemetaboliczny. Znosi represję, ale w odróżnieniu od laktozy nie jest
rozkładany przez bakterie i dzięki temu jego stężenie w pożywce jest stałe.
*
region
ekspresji T7
gen bla
gen
pET 16b
represora
(5711 pz)
lacI
miejsce startu
replikacji
* Region ekspresji T7:
promotor T7 operator lac 10 His
Miejsce przyłączenia represora
MCS
Nde I XhoI BamH I
terminator T7
Miejsce klonowania nowego genu
Szczep E. coli BL 21 (DE 3)
" Szczep ten na chromosomie posiada sztucznie wprowadzony gen kodujÄ…cy
polimerazÄ™ RNA faga T7 pod kontrolÄ… promotora lacUV5 rozpoznawanego
przez polimerazÄ™ RNA E. coli.
" Promotor podlega regulacji zewnętrznej. Bez induktora do sekwencji operatora
zostaje przyłączony represor LacI. Ekspresja jest indukowana przez dodanie
do pożywki IPTG.
Indukcja IPTG Indukcja IPTG
Polimeraza T7
Polimeraza
RNA T7
gen polimerazy gen kodujÄ…cy
RNA
RNA faga T7 białko
E.coli polimeraza
RNA T7
lacO lacO
promotor
promotor T7
lacUV5
represor
represor
pET 16b
LacI
LacI
gen
gen
represora
represora
LacI
LacI
Genom
E.coli
Rys. 1 Elementy regulatorowe w systemie nadprodukcji białek faga T7.
Przy braku induktora uzyskujemy podwójną blokadę:
1. Represor blokuje promotor lacUV5 na chromosomie bakteryjnym  polimeraza RNA
E. coli nie może transkrybować genu polimerazy RNA faga T7.
2. Represor łączy się z sekwencją operatora (lacO) blokując dostęp do promotora faga
T7 na plazmidzie.
Gdyby z jakiegoś powodu nie doszło do represji promotora na plazmidzie (np.
mutacja sekwencji operatora lacO) przy braku induktora i tak nie dojdzie do ekspresji
klonowanego genu  brak polimerazy RNA T7
Dodanie induktora: w pierwszej kolejności musi dojść do ekspresji genu polimerazy
RNA T7 z chromosomu, odpowiada za to polimeraza bakteryjna. Dopiero jak
powstanie polimeraza T7 rozpozna ona specyficznie promotor faga T7 na plazmidzie i
dojdzie do ekspresji klonowanego genu.
1.3. Przygotowanie i transformacja komórek kompetentnych.
Wprowadzenie zrekombinowanych cząsteczek do wnętrza komórek gospodarza stanowi
jeden z najważniejszych etapów klonowania DNA. Wprowadzone do wnętrza komórki DNA
ulega często degradacji, ale może się zdarzyć, że nie zostanie zniszczone. Dotyczy to głównie
plazmidów, które posiadają miejsce startu replikacji (ang. origin), mogą autonomicznie
utrzymywać się we wnętrzu komórki bakteryjnej. Pobranie plazmidu wiąże się z nabyciem
przez komórkę nowych cech.
Wiele bakterii (np. Bacillus czy Hemophilus) posiada naturalną zdolność do pobierania
cząsteczek DNA ze środowiska, w którym żyją. Często używana w biologii bakteria
Escherichia coli może być w ten stan wprowadzona na drodze indukcji chemicznej (np. przez
traktowanie komórek chlorkiem wapnia tzw. metoda chlorkowa). Wydajność tej metody waha
siÄ™ w granicach 105-106 transformantów/µg plazmidowego DNA. Komórki zawiesza siÄ™ w
zimnym (0°C) roztworze 50 lub 100 mM chlorku wapnia. Po dodaniu roztworu DNA,
cząsteczki kwasu nukleinowego absorbują się na powierzchni komórek. Szybkie
podwyższenie temperatury (do 43°C na okoÅ‚o 3 min.) powoduje zmiany w powÅ‚okach
komórkowych bakterii pozwalające na wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza komórek.
W przypadku transformacji bakterii plazmidami niosącymi geny warunkujące oporność na
antybiotyki, przed wysianiem mieszaniny transformacyjnej na płytki selekcyjne konieczna
jest inkubacja hodowli (przez około godzinę) w pożywce bez antybiotyku. Pozwala to na
ekspresję genu oporności na antybiotyk.
Rys. 2 Przypuszczalny mechanizm transformacji komórek E. coli
CZEŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały i sprzęt:
" Pożywki LB
" Jałowy roztwór 0,1 M CaCl .
2
" Jałowe probówki wirownicze
" Wirówka z chłodzeniem
" szczep BL21
A. Otrzymywanie świeżych komórek kompetentnych.
1. Pojedynczą kolonię bakteryjną pobraną z płytki agarowej zaszczepić 5- 25 ml pożywki
LB w kolbie o objÄ™toÅ›ci 100 ml. HodowlÄ™ inkubować przez noc w temperaturze 37°C
w wytrzÄ…sarce wodnej.
2. Odmłodzić hodowlę bakteryjną przez zaszczepienie 50 ml pożywki LB 0.5 ml
hodowli nocnej. Hodować z wytrzÄ…saniem w temp. 37 °C do OD =0,2.
600
3. Hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w lodzie. Przenieść hodowlę bakteryjną
do jaÅ‚owej probówki. Bakterie osadzić przez wirowanie 4000 obr./min. W temp. 4°C,
10 min.
4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml schłodzonego w lodzie roztworu 0,1 M CaCl .
2
Całość inkubować w lodzie przez 10 min. Zawiesinę osadzić przez wirowanie jw.
Supernatant odrzucić.
5. Bakterie zawiesić w 2 ml zimnego roztworu 0,1M CaCl . Po 20-30 min inkubacji w
2
lodzie gotowe są do użycia. Inkubacje w lodzie można przedłużyć do 12 godz. Co
może zwiększyć wydajność transformacji.
B. Transformacja.
1. Do 0,2 ml przygotowanych jw. komórek kompetentnych dodać roztwór plazmidowego
DNA o objÄ™toÅ›ci maksymalnie 10 µl.
2. Inkubować próby w lodzie przez 30 min.
3. Szybko przenieść je na 60 s do 3 min do 42°C.
4. Dodać 0,8 ml pożywki LB i hodować w 37°C przez 45 - 60 min.
5. Na płytki z odpowiednim antybiotykiem wysiewać po 0,1ml hodowli.
6. Hodować przez noc w cieplarce w temp 37°C.
7. Obecność plazmidów sprawdzić stosując metodą lizy alkalicznej i elektroforezy
agarozowej.
8. Sprawdzenie obecności odpowiedniego klonowanego genu (odpowiedniego produktu
ligacji) przy użyciu reakcji PCR.
2. WYBRANE ENZYMY WYKORZYSTYWANE DO
MODYFIKACJI DNA.
2.1. Enzymy restrykcyjne - Obróbka enzymatyczna oczyszczonego DNA.
Enzymy restrykcyjne dzięki zdolności rozpoznawania i cięcia specyficznych sekwencji
nukleotydowych stanowią narzędzie do obróbki DNA. Większość z nich rozpoznaje
sekwencje palindromowe sześcio- (NdeI, BamHI, PstI) lub czteronukleotydowe (AluI).
Produktami trawienia DNA tymi enzymami sÄ… fragmenty restrykcyjne posiadajÄ…ce lepkie lub
tępe końce. Do przeprowadzenie reakcji niezbędne są jony magnezu (Mg++).
Obróbka DNA - trawienie enzymami restrykcyjnymi AluI, NdeI, BamHI, PstI.
a) enzym trawiący DNA z pozostawieniem tępych końców
AluI
5  N-N-A-G-C-T-N-N  3 5 - N-N-A-G - 3 5 - C-T-N-N - 3
3  N-N-T-C-G-A-N-N  5 3  N-N-T-C  5 3 - G-A-N-N  5
Tępe końce
b) enzymy trawiące DNA pozostawiające lepkie końce 5 .
NdeI
5  N-N-C-A-T-A-T-G-N-N  3 5  N-N-C-A-3 5 -T-A-T-G-N-N  3
3  N-N-G-T-A-T-A-C-N-N  5 3  N-N-G-T-A-T-5 3 - A-C-N-N  5
Lepkie końce 5
BamHI
5  N-N-G-G-A-T-C-C-N-N  3 5  N-N-G-3 5 -G-A-T-C-C-N-N  3
3  N-N-C-C-T-A-G-G-N-N  5 3  N-N-C-C-T-A-G-5 3 -G-N-N  5
Lepkie końce 5
c) enzym trawiący DNA pozostawiający lepkie końce 3 .
PstI
5  N-N-C-T-G-C-A-G-N-N  3 5  N-N-C-T-G-C-A-3 5 -G-N-N  3
3  N-N-G-A-C-G-T-C-N-N  5 3  N-N-G-5 3 -A-C-G-T-C-N-N  5
Lepkie końce 3
2. 2. Fosfataza alkaiczna  enzym modyfikujÄ…cy koniec 5 DNA.
y
ródłem jest jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase). Jest to
dimeryczny glikopeptyd, złożony z dwóch identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej
69 kD. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę. CIP może być inaktywowany termicznie
przez inkubacjÄ™ w 65°C.
Właściwości.
5 fosfataza, usuwajÄ…ca 5 grupÄ™ fosforanowÄ… z ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA z
deoksyrybonukleotydotrójfosforanów i rybonukleotydotrójfosforanów:
3
5 3 5
P OH
P OH
3 5 3 5
Zastosowanie.
1) Defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji wektora użytego do
klonowania
2) Defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5 za pomocą kinazy
polinukleotydowej T4
3) Jako składnik w systemie immunodetekcji
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
CiÄ™ty i wytrÄ…cony plazmid np. 30µl
Alkaiczna fosfataza 1,3µl
Bufor do alkaicznej fosfatazy 10" 10µl
DopeÅ‚nić wodÄ… do 100µl
(10"- 10 razy stężony)
º%Inkubacja w 37°C przez 30 min.
º%Zahamowanie reakcji  dodanie 1,1µl EDTA 0,5M, inkubacji w 75°C przez 10 min
º%Przed dalszymi manipulacjami należy usunąć biaÅ‚ko przez ekstrakcjÄ™ mieszaninÄ…
fenol/chloroform
º%Ponowne wytrÄ…cenie plazmidu.
2. 3. Ligaza DNA faga T4
Właściwości
Katalizuje odtwarzanie wiązania fosfodwuestrowego pomiędzy grupa fosforanową znajdującą
się na końcu 5 fragmentu restrykcyjnego a grupą hydroksylową na końcu 3 (wcześniej te
wiązania są niszczone przez enzymy restrykcyjne). Reakcja ta zależna jest od ATP. In vitro
enzym ten niezbędny jest w procesie replikacji (łączeni fragmentów Okazaki). Bierze też
udział w naprawie DNA.
3 5
OH P GATC
CTAG P OH
5 3
Ligaza + ATP
GATC
CTAG
Zastosowanie.
Dzięki ligazie możemy połączyć ze sobą fragmenty restrykcyjne, które posiadają takie same
końce lepkie bądz
tępe. Ligacja tępych końców jest procesem mniej wydajnym, wymaga
użycia większej ilości enzymu i wydłużenia czasu inkubacji.
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
Mieszanina w odpowiednio dobranej
Proporcji zdefosforylowanego plazmidu i insertu  5-7µl
Bufor do ligazy faga T4 10" 1µl
10mM ATP 1µl
Ligaza 1u/ dla lepkich końców
2u/dla tępych końców
DopeÅ‚niamy do 10 µl wodÄ… dejonizowanÄ…
º%Inkubacja ok. 2 -10 godz. w 16°C. Czas i temperaturÄ™ inkubacji należy zastosować zgodnie
z zaleceniami producenta
º%Zahamowanie reakcji  10 min w 65°C
º%Użyć mieszaninÄ™ do transformacji.
2. 4. Polimeraza DNA Taq
y
ródłem tego enzymu są termofilne bakterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E. coli.
Enzym ten funkcjonalnie podobny jest do DNA polimerazy I E. coli. CennÄ… jego
wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ciÄ… jest termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C, a optimum
dziaÅ‚ania wykazuje przy 80°C.
Właściwości.
1) 5 3 DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy
jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz primera DNA lub RNA z końcem 3 -OH.
2) 5 3 egzonukleaza, degradująca od końca 5 -P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub
hybryd DNA-RNA.
Zastosowanie
1) Amplifikacja DNA przez łańcuchową reakcję polimeryzacji (ang. Polimerase Chain
Reaction  PCR)
2) Sekwencjonowanie DNA metodÄ… Sangera
3) W genomowym  footprintingu
3. IZOLACJA PLAZMIDU METOD
LIZY ALKALICZNEJ.
Metoda ta pozwala na izolację plazmidów i pozbycie się większości chromosomalnego
DNA gospodarza i białek.
Roztwór I  GET  niszczenie ściany komórkowej, uwrażliwienie błony cytoplazmatycznej
Glukoza  powoduje, że roztwór jest hipertoniczny, wnikając do komórki powoduje jej
pęcznienie
Tris  HCl  utrzymuje stałe pH, związek o dużej pojemności buforowej.
EDTA  chelatuje jony dwuwartościowe potrzebne do działania DN-az (Ca2+, Mg2+)
Lizozym  niszczenie peptydoglikanu (wiÄ…zanie ² 1,4 glikozydowe)
Roztwór II
SDS  detergent jonowy  zmienia napięcie powierzchniowe osłon komórkowych  ułatwia
pękanie błony, treść komórki wypływa na zewnątrz.
NaOH  silna zasada  denaturacja DNA i białek
Roztwór III
octan potasu  pH 4,8 w niskiej temperaturze, DNA ulega renaturacji. DNA chromosomalne
jest długie zlepia się i nie poddaje się całkowitej renaturacji  wraz z większością białek i
resztkami błon tworzy kompleksy i ulega precypitacji. Stosunkowo małe cząsteczki DNA
(plazmidy) w formie CCC oraz RNA pozostajÄ… w roztworze.
Po odwirowaniu pozostające w roztworze białka usuwa się poprzez ekstrakcję mieszaniną
fenol-chloroform. Zagęszczenie preparatu DNA plazmidowego przeprowadza się przez
wytrącanie 95% etanolem. Osad po wysuszeniu rozpuszcza się w wodzie jałowej lub buforze
TE ( Tris i EDTA) RNA można usunąć z preparatu za pomocą RN-azy wolnej od DN-azy.
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Pożywka LB
2. Roztwór I (bufor GET):
50 mM glukoza 1,8 g glukozy = 10 ml 1 M glukozy
10 mM EDTA 4 ml 0,5 M EDTA
25 mM Tris-HCl, pH 8 5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8
200 ml
Przechowywać w 40C
3. Roztwór II- mieszanina lizująca, przygotowana tuż przed użyciem:
jałowa woda 4 ml
0,2 N NaOH 1,2 ml 1N NaOH
1% SDS 0,6 ml 10%SDS
6 ml (wystarczy na 24 próbki)
4. Roztwór III (3M K+ - 5M CH COO-):
3
5 M CH COOK 12 ml
3
CH COOH lodowaty 2,3 ml
3
jałowa woda 5,7 ml
20 ml
5. Fenol
6. Chloroform: alkohol izoamylowy w stosunku obj. 24:1
7. 96% alkohol etylowy
8. 70% alkohol etylowy
9. Woda redestylowana jałowa
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 16
Wykonanie:
1. Zaszczepić pojedynczą kolonie bakteryjną w 25 ml pożywki LB uzupełnionej
ampicylinÄ… do stężenia 10 µg/ml (hodowle prowadzić w kolbie o objÄ™toÅ›ci 100 ml).
Bakterie hodować przez noc w temp. 370C w wytrząsarce.
2. Wprowadzić 1,5 ml hodowli do probówki. Wirować 1- 2 min. Supernatant odrzucić.
Czynności te powtórzyć 2 - 3 razy (w tej samej probówce).
3. Osad rozpuÅ›cić w 100 µl buforu GET + lizozym (roztwór I), energicznie
worteksujemy do całkowitego rozbicia osadu.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
5. Dodać 200 µl Å›wieżo przygotowanego roztworu II. Mieszać delikatnie przez
odwracanie probówki trzy razy. Nie worteksować!
6. Inkubować w lodzie 5 minut.
7. Dodać 150 µl zimnego roztworu III. Worteksować przez okoÅ‚o 30 sekund.
8. Wirować 5 - 15 minut.
9. Przenieść supernatant (okoÅ‚o 400 µl) do czystych probówek (nie naruszyć osadu!)
Zebrany roztwór musi być klarowny
10. Dodać 200 µl fenolu i 200 µl mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy 23:1 v:v.
Worteksować przez około 30 sekund.
11. Wirować 5 min.
12. Zebrać ok. 400 µl górnej fazy do nowej probówki. Nie wolno naruszyć dolnej
warstwy! Zebrany roztwór musi być klarowny. Zmętnienie roztworu świadczy o
zanieczyszczeniu fenolem. Gdy tak się stanie należy zebrany roztwór ponownie
zwirować. Zebrać delikatnie supernatant nie naruszając osadzonego na dnie fenolu.
13. Dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego. Mieszać przez czterokrotne obracanie
probówki. Inkubować, co najmniej 10 min. w temperaturze pokojowe lub niższej.
Niższa temperatura jest wskazana przymałej ilości wytrącanego DNA.
14. Wirować 5 - 15 min.
15. Supernatant odrzucić, do osadu dodać 1ml 70% alkoholu etylowego. Mieszać przez
czterokrotne obracanie probówki.
16. Wirować 30 sek.
17. W razie potrzeby powtórzyć punkty 16 i 17.
18. Supernatant odrzucić i osad suszyć pod próżnią.
19. Osad rozpuÅ›cić w 20  40 µl jaÅ‚owej wody,
20. Efekt izolacji sprawdzić na żelu agarozowym
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 17
OC
L
CCC
Rys 3. Rozdział w żelu agarozowym plazmidu pET16b.
Plazmid widoczny w trzech formach:
OC  kolista powstała po przecięciu jednej z nici DNA,
L  liniowa powstała po przecięciu obu nici DNA
CCC  kolista, superzwinięta
4. AMPLIFIKACJA DNA in vitro METOD
A
AC
CUCHOWEJ REAKCJI
POLIMERAZY (PCR).
Metoda ta służy do amplifikacji segmentu DNA położonego pomiędzy regionami o znanej
sekwencji. W reakcji tej używane jako primery (startery) są dwa oligonukleotydy,
komplementarne do sekwencji położonych na przeciwległych niciach matrycowego DNA,
flankujące rejon DNA, który ma podlegać amplifikacji. DNA jest syntetyzowane w serii
reakcji katalizowanych przez polimerazę DNA. Każdy cykl składa się z następujących
etapów:
1. Denaturacji matrycowego DNA w temperaturze 94-950C, w obecności czterech
rodzjów dNTP oraz dużego nadmiaru primerów.
2. Przyłączenia primerów do sekwencji homologicznych w matrycowym DNA, co
następuje po ochłodzeniu do temperatury 45-650C,
3. Wydłużania primerów przez polimerazę DNA w temperaturze 720C, co w rezultacie
pozwala na syntezÄ™ fragmentu DNA.
Temperatura przyłączania primerów zależy od długości oligonukleotydów (długość
ich nie powinna być mniejsza niż 15-16 nukleotydów, optymalna to 22-28 nt), ich
temperatury topnienia i specyficznego łączenia się z matrycowym DNA. Każdy cykl,
składający się z denaturacji, przyłączenia i syntezy, powtarzany jest wielokrotnie (od
25 do 40 razy). DNA będący produktem każdego cyklu służy jako matryca w
następnych cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększanie puli syntetyzowanego
DNA.
Produktem reakcji PCR jest dwuniciowy fragment DNA, którego końcami są końce 5
primerów, a długość określona jest przez odległość pomiędzy primerami. Poza tym
zsyntetyzowany DNA posiada tępe końce.
DNA, Izolacja plazmidu (liza alkaliczna) 18
W reakcji syntezy DNA stosowana jest termostabilna polimeraza wyizolowana z
termofilnej bakterii Thermus aquaticus-Taq polimeraza (II.4.).
Matrycą do syntezy DNA może być DNA liniowy, plazmidowy (ccc), cały genom np.
bakterii; nie musi być on oczyszczany. Reakcja amplifikacji DNA metodą PCR odbywa się w
specjalnym urządzeniu, umożliwiającym szybkie zmiany temperatury (termocykler).
Zastosowanie PCR
1. Amplifikacja fragmentu DNA  uzyskanie dużej ilości określonego fragmentu DNA
np. do klonowania
2. Diagnostyka molekularna  wykrywanie patogenów w próbkach klinicznych,
identyfikacja próbek w medycynie sądowej (możliwa z bardzo niewielkiej próbki, np.
pojedynczego włosa), analiza mutacji w chorobach nowotworowych
3. Synteza specyficznych sond.
4. Tworzenie bibliotek genomowych
cykl 1
cykl 2
cykl 3
cykl 4
Rys. 4 Schemat obrazuje cztery pierwsze cykle łańcuchowej reakcji polimerazy
in vitro  PCR. Prosta ciągła linia oznacza matrycową nić DNA, która ulega powieleniu
(amplifikacji). Strzałki biała i czarna obrazują odpowiednio lewy i prawy primer.
Oligonukleotydowe primery mają długość 18 30 pz i są komplementarne do obszarów
ograniczajÄ…cych amplifikowanÄ… sekwencjÄ™.
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR) 19
Temp.
[0C]
Cykl 1 Cykl 2
100 denaturacja denaturacja
94
Wydłużanie
łańcucha
72
Dołączanie
50
startera
37
czas [min]
1 2 3 4
Rys 5. Profil termiczny PCR
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
UWAGA!!!
W reakcji PCR mogą być amplifikowane tak małe ilości DNA, jak nawet pojedyncza
cząsteczka. Zalecane są następujące środki ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu
próbki:
" Wszystkie czynności wykonywać w rękawiczkach
" Używać buforów przeznaczonych wyłącznie do reakcji PCR
" Używać wyłącznie jałowych tipsów i probówek
" Nie chlapać roztworami DNA
I. Przygotowanie matrycowego DNA.
1. Plazmid oczyszczony metodÄ… lizy alkaicznej do mieszaniny reakcyjnej 2.
2. Próbka bakteryjna do mieszaniny reakcyjnej 1:
- pojedynczą kolonię bakteryjną przenieść jałowo do probówki
- zawiesić w 1ml buforu lizującego (40 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,3 M KCl,
10 mM EDTA), próbkę energicznie wymieszać
- wirować 5 min
- supernatant odrzucić, osad zawiesić ponownie w 1ml buforze lizującym z dodatkiem
lizozymu
- wymieszać i inkubować 5 min na stole
- wirować 2 min
- supernatant odrzucić, osad zawiesić w 300 µl jaÅ‚owej wody
- próbkę gotować 10 min w łaz
ni wodnej
- po ostudzeniu wirować 5 min
20
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)
 supernatant przenieść do jałowej probówki i używać do reakcji PCR w objętości 5
µl
II. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
Reakcja odbywa siÄ™ w caÅ‚kowitej objÄ™toÅ›ci 50 µl. W mieszaninie znajduje siÄ™ 10
pmoli każdego primera, 2 ng DNA plazmidowego, 200 µM dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3
50 mM KCl, 1,5 mM MgCl , 1 jednostka Taq polimerazy.
2
UWGA!
Kolejność dodawania poszczególnych składników jest istotna!
Probówka podczas dodawania poszczególnych składników powinna
znajdować się w lodzie.
Przepis praktyczny na jedną reakcje (próbkę).
Mieszanina 1
1. woda redestylowana jaÅ‚owa 39,9 µl
2. bufor 10x stężony 5 µl
3. 10 mM dNTP 0,8 µl
4. 10 µÅ› primer lewy 1 µl
5. 10 µÅ› primer prawy 1 µl
6. matryca DNA  plazmid 1 µl
7. Å„aq polimeraza DNA 1u/µl 1,3 µl
Mieszanina 2
1. woda redestylowana jaÅ‚owa 36,5 µl
2. bufor 10x stężony 5 µl
3. 10mM dNTP 0,8 µl
4. 10µÅ› primer lewy 1 µl
5. 10µÅ› primer prawy 1 µl
6. matryca DNA  próbka bakteryjna 5 µl
7. Å„aq polimeraza DNA 1u/µl 1,3 µl
Wszystkie odczynniki do reakcji PCR przechowujemy w lodzie. Po wykonaniu reakcji
natychmiast chowamy do  200C.
Wykonanie:
1. Powyższe składniki dokładnie wymieszać.
2. Umieścić w termocyklerze nastawionym na określony program.
3. Włączyć program.
4. Zanalizować produkty amplifikacji na żelu agarozowym
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR) 21
5. DETEKCJA I ANALIZA DNA.
5. 1. Elektroforeza DNA na żelu agarozowym.
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA.
Materiały i sprzęt:
1. Agaroza 0,45 g (mały żel 1,5 % o długości około 8 cm)
2. 1 x stężony bufor TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA)
3. Bufor obciążający 6 x razy stężony do próbek.
4. Marker DNA
5. Roztwór bromku etydyny.
6. Zasilacz.
7. Mały aparat do elektroforezy poziomej.
Wykonanie
1. Agarozę rozpuścić w 30 ml buforu TBE.
2. Agarozę wylać na płytę aparatu, przed zastygnięciem umieścić w żelu grzebień na
odpowiedniej głębokości, aby uzyskać studzienki.
3. Po zastygnięciu żelu zalać go buforem 1 x stężonym TBE tak, aby pokrywał on
powierzchnię żelu.
4. Próbki DNA po 10 µl zawiesić w buforze obciążajÄ…cym 2 µl.
5. Nanieść próbki do studzienek w żelu.
6. Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu 100 V do momentu uzyskania
prawidłowego rozdziału próbek
7. Żel barwić w roztworze bromku etydyny
8. Analizę wyników prowadzić w świetle UV.
a).wylewanie żelu agarozowego a). cząsteczka bromku etydyny
A B
grzebień NH
2
N+ CH Br-
3
H N
2
agaroza
Para zasad
CzÄ…steczka
PÅ‚ytka do
Taśma uszczelniająca bromku etydyny
wylewania żelu
3,4 Å I EtBr
Szkielet cukrowo-fosforanowy
>3,4 Å
b). prawidłowe ustawienie grzebienia
I 3,4 Å
Zęby grzebienia Cząsteczka DNA
Żel agarozowy
b). interkalacja bromku etydyny
w obręb podwójnej nici DNA
22
DNA, AMPLIFIKACJA (PCR)
23
DNA, Detekcja i analiza
CZ
ŚĆ DRUGA: BIAA
KA
1. PRODUKCJA ZREKOMBINOWANEGO BIAA
KA  EKSPRESJA
KLONOWANEGO GENU.
Uzyskane w procesie transformacji klony należy sprawdzić na obecność
zrekombinowanego genu. W celu można wykonać reakcję PCR na wyizolowanym lizą
alkaliczną plazmidzie. Plazmid można też trawić enzymami restrykcyjnymi wykorzystanymi
wcześniej w procesie klonowania. W obu przypadkach uzyskanie fragmentów DNA o
określonej długości będzie świadczyło o obecności w wektorze klonowanego genu. Gdy
celem klonowania jest produkcja białka na dużą skalę zanim się do tego przystąpi należy
sprawdzić poziom indukcji i czy uzyskane białko ma oczekiwaną masę.
1.1 Sprawdzenie poziomu indukcji białka.
Klonowanie z wykorzystaniem sytemu polimerazy faga T7 daje możliwość ścisłej kontroli
ekspresji klonowanego białka. Transkrypcja białka zajdzie tylko w momencie dodania do
hodowli induktora IPTG (zniesienie represji z operatora; I  1.2). Poziom indukcji dodatkowo
można regulować stężeniem IPTG. Najlepszym momentem do indukcji dla bakterii jest faza
logarytmicznego wzrostu. W tym czasie intensywnie zachodzą wszystkie procesy komórkowe
(replikacja, transkrypcja, translacja), duże jest stężenie wykorzystywanych enzymów. W
jakiej fazie wzrostu znajdują się bakterie można określić spektrofotometrycznie. Mierzy się
poziom zmętnienia pożywki (absorbancję) na spektrofotometrze nastawionym na długości fali
 = 600, wyskalowanym na czystej pożywce. OD =0,5 świadczy, że bakterie znajdują się
600
logarytmicznej fazie wzrostu. Do tego momentu białko rekombinacyjne nie powinno być
wykrywane w komórce bakteryjnej, albo znajdować się na bardzo niskim poziomie. Po
dodaniu w tym momencie IPTG rusza intensywna ekspresja klonowanego genu. Prawidłowy
przebieg indukcji można sprawdzić dopiero na żelu poliakrylamidowym, w tym celu przed i
po dodaniu IPTG należy pobrać i przygotować próbki na żel.
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Pożywki LB
2. roztwór ampicyliny 1mg/ml
3. IPTG
4. Bufor A (20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.2 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerol,
0, 5 M ²-merkaptoetanol, PMSF 1 mM.
5. Bufor lizujący do przygotowania próbek na żel.
EDTA  blokuje metaloproteazy chelatując jony metali, które są w centrum aktywnym tych
enzymów.
²-merkaptoetanol  w procesie oczyszczania biaÅ‚ek używa siÄ™ go w celu ochrony biaÅ‚ek
tiolowych przed utlenieniem.
PMSF  inhibitor proteaz serynowych.
24
Białka, Ekspresja klonowanego genu
Wykonanie:
Sprawdzanie poziomu indukcji białka:
1. Przygotować hodowlę nocną.
- do 25 ml pożywki LB z dodatkiem ampicyliny w stężeniu koÅ„cowym 1 µg/ml
posiać jedną kolonie szczepu E. coli BL21 zawierającego plazmid pET16b z
klonowanym genem.
- inkubować przez noc z wytrzÄ…saniem w temp. 37°C
2. Odmłodzenie hodowli nocnej.
- do świeżej pożywki LB 50 ml uzupełnionej ampicyliną jw. Przenieść 0,5 - 1 ml
hodowli nocnej
3. Prowadzić hodowle do OD = 0,5
600
4. Pobrać próbkę 1,5 ml hodowli do jałowej probówki  przygotować
próbkę na żel.
5. Do hodowli dodać IPTG do stężenia 0,5 mM (albo 1 mM).
6. Co 30 min (cztery razy  po 1, 1.5, 2 i 2.5 godziny) od momentu indukcji pobierać
próbki tak jak w punkcie 4.
7. Przeprowadzić analizę próbek na zawartość białka metodą elektroforezy
poliakrylamidowej.
Produkcja zrekombinowanego białka na dużą skalę.
1-5.Wykonujemy jak wyżej. Zmieniamy tylko objętość pożywki hodowli
nocnej i hodowli właściwej w zależności jak dużo chcemy uzyskać pasty
bakteryjnej do dalszego oczyszczania produktu białkowego. Hodowle po
dodaniu IPTG prowadzimy do momentu uzyskana najlepszego poziomu
indukcji określonego w poprzednim doświadczeniu.
6. Po określonym czasie prowadzenia hodowli całą pożywkę z wirować (30 min.
4000 obr./min, 4°C)
8. Osad bakteryjny zawiesić w buforze A zamrozić w ciekłym azocie i
przechowywać w temperaturze - 80°C.
25
Białka, Ekspresja klonowanego genu
2. IZOLACJA I OCZYSZCZANIE BIAA
KA.
Liza komórek bakteryjnych.
1. Do osadu bakteryjnego zawieszonego w 5 ml buforu lizującego dodać lizozym do
stężenia końcowego 0,2 mg/ml oraz PMSF w stężeniu końcowym 1 mM.
2. Inkubować lodzie 30 min.
3. Rozbić komórki ultradz
więkami przy użyciu sonikatora (6 cykli po 1 min z 1 min
przerwami).
4. Lizat zwirować  30 min 22 tys. obr/min, 4°C
5. Supernatant użyć do dalszego oczyszczania.
Oczyszczania białka przy użyciu chromatografii powinowactwa w warunkach
natywnych.
Dzięki użyciu do klonowania jednego z wektorów pET (pET16b) białko rekombinacyjne
uzyskuje na końcu N  ogon polihistydynowy . Do oczyszczania białka wykorzystana zostanie
metoda chromatografii powinowactwa na złożu Ni-NTA.
Rys. 7 Interakcja pomiędzy osadzonym na nośniku jonem niklu a dwiema resztami histydyny.
Macierz złoża Ni-NTA to ziarna agarozowe z ligandem chelatującym metale  nośnikiem
(kwas nitrylotrioctowy - NTA). Jon metalu (Ni2+) unieruchomiony jest na nośniku poprzez
cztery stabilne wiązania. Jon metalu związany ze złożem ma dwa wolne miejsca wiążące i
może tworzyć wiązania koordynacyjne z histydyną na N końcu białka. Imidazol który ma
większe powinowactwo do niklu niż histydyna wypiera białko za złoża. Do elucji białek nie
specyficznie związanych ze złożem używa się 20-40 mM stężenia imidazolu, do elucji białek
specyficznie związanych ze złożem (właściwe białko rekombinacyjne) używa się większego
stężenia imidazolu (200 - 400 mM).
26
Białka, Ekspresja klonowanego genu
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Kolumna upakowana złożem Ni-NTA  ok. 1 ml
2. Bufory: lizujący, płuczący, elucyjny
3. 30 % etanol
Bufor lizujący/wiążąc:
50 mM NaH PO
2 4
300 mM NaCl
10 mM imidazol
pH 8
Bufor płuczący:
50 mM NaH PO
2 4
300 mM NaCl
20 mM imidazol
pH 8
Bufor elucyjny:
50 mM NaH PO
2 4
300 mM NaCl
250 mM imidazol
pH 8
Wykonanie:
Zaktywowane złoże Ni-NTA, przechowujemy w 30 % etanolu lub 0,02 % azydku w
temperaturze pokojowej. Złoże powinno mieć jasnoniebieski kolor. Przyjmuje się, że raz
zaktywowane złoże można użyć od 5 do 10. Kiedy kolor złoża z jasnoniebieskiego zrobi się
brązowo-siwy, należy wypłukać jony Ni2+ 0,5 M EDTA i zregenerować złoże wg wskazań
producenta.
1. Zrównoważyć złoże buforem wiążącym  5- 10 objętości złoża.
2. Nanieść na przygotowaną kolumnę supernatant uzyskany z wirowania lizatu
komórkowego. Równocześnie zbierając frakcje białka nie związanego ze złożem.
3. Płukać złoże buforem płuczącym - 5- 10 objętości złoża.
4. Płukać złoże buforem elucyjnym - 5- 10 objętości złoża.
W przypadku pkt 3 i 4 zbierać każdą frakcje o objętości złoża do oddzielnych
probówek.
5. Płuczemy złoże 30 % etanolem.
6. Zawartość białka w kolejnych zbieranych frakcjach z kolumny określić za pomocą
elektroforezy poliakrylamidowej.
27
Białka, Ekspresja klonowanego genu
3. ANALIZA ILOÅšCI I JAKOÅšCI BIAA
KA.
3. 1. Elektorforeza poliakrylamidowa białek
Metoda ta jest powszechnie stosowana do rozdziału i charakterystyki białek. Na
jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie rozdział wielu próbek, a rozdzielone białka
można skutecznie wykryć na żelu metodą barwienia lub autoradiografii.
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku reakcji polimeryzacji akrylamidu z N,N -
metyleno-bis-akrylamidem. Gęstość żelu zależy od stężenia obu tych składników, stopień
usieciowania żelu od całkowitego stężenia Bis-akrylamidu. Reakcja polimeryzacji jest
katalizowana przez nadsiarczan amonu i TEMED. Utworzony żel służy jako nośnik do
rozdziału elektroforetycznego, funkcjonuje jednocześnie jako sito molekularne, co wpływa na
skuteczny rozdział makrocząsteczek. Wielkość porów sita uwarunkowana zarówno przez
stężenie akrylamidu (ze wzrostem stężenia maleje wielkość porów), jak i przez stopień
usieciowania, musi być właściwie dobrana do wielkości rozdzielanych cząsteczek.
Najczęściej stosowane są żele o stężeniu od 7,5 do 12,5%. Obecnie preferowana jest forma
płytowa żelu dająca możliwość naniesienia jednocześnie na jeden żel wielu próbek.
Najczęściej stosuje się elektroforezę na tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na
żel zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego (o
małych porach). W tej technice bufor elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli
różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu jest koncentracja białek podczas wędrówki przez
żel zagęszczający, co powoduje, że niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel
rozdzielający w postaci wąskiego, zatężonego pasma.
Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z użyciem anionowego detergentu,
siarczanu dodecylu (SDS), pozwala na rozdział białek zgodnie z ich masą cząsteczkową.
Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, co
nadaje im określony ładunek elektryczny - ujemny. W rezultacie czynnikiem decydującym o
szybkości poruszania się białek w trakcie elektroforezy jest ich masa cząsteczkowa. W
warunkach natywnych jest to nie możliwe ponieważ poszczególne białka mają różny punkt
izolelektryczny.
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały:
1. Bufor lizujący 4 x stężony do przygotowania próbek na żel
0,125 M Tris HCl pH 6.8
5% SDS
10% ²-merkaptoetanol
20% glicerol
2. 30 % roztwór akrylamidów
3. Bufor do żelu górnego 0,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS.
4. Bufor do żelu dolnego 1,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS.
5. Roztwór nadsiarczanu amonu 10%
6. TEMED
7. Bufor elektrodowy 10 x stężony
8. Woda redestylowana.
28
Białka, Ekspresja klonowanego genu
Wykonanie:
Zachować podaną kolejność czynności.
1. Przygotowanie próbek na żel.
" Do próbek (np. 50 µl), które chcemy sprawdzić na zawartość biaÅ‚ka (np. próbki
zebrane w czasie indukcji i oczyszczania białka) dodać ź objętości 4 x stężonego
buforu lizujÄ…cego.
" Umieścić próbki w łaz
ni wodnej na 4 min.
" Próbki mogą być przechowywane do miesiąca w 40C
2. Przygotowanie płytek.
" Dokładnie umyte płytki szklane odtłuścić przecierając alkoholem (denaturat).
" Złożyć płytki z odpowiednimi przekładkami i umieścić w statywie do wylewania
żeli
UWAGA!!!
Akrylamid jest związkiem toksycznym! Wszystkie czynności należy
wykonywać w rękawiczkach!
3. Przygotowanie żelu dolnego (rozdzielającego) 12,5%
" Sporządzić mieszaninę:
Bufor 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,4% SDS 2,0 ml
30% roztwór akrylamidów 3,3 ml
Woda 2,7 ml
10% nadsiarczan amonu 40 µl
TEMED 8 µl
TEMED dodajemy na samym końcu tuż przed wylaniem żelu.
" Wymieszać dokładnie wszystkie składniki
" Wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do 2/3 wysokości, zostawiając miejsce
na żel górny i grzebień.
" Na żel nawarstwić ostrożnie 1-2 mm wody
" Pozostawić do polimeryzacji ok. 20 min
4. Przygotowanie żelu górnego (zagęszczającego) 5%.
" Sporządzić mieszaninę:
Bufor 0,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,4% SDS 0,8 ml
30% roztwór akrylamidów 0,5 ml
Woda 2,1 ml
10% nadsiarczan amonu 30 µl
TEMED 6 µl
" Zlać wodę z żelu dolnego
" Napełnić płytki żelem górnym
" Wsunąć grzebień tak, aby nie powstały pęcherzyki powietrza
" Pozostawić do polimeryzacji
29
Białka, Ekspresja klonowanego genu
5. Przygotowanie aparatu do elektroforezy.
" Po spolimeryzowaniu żelu górnego umieścić płytki z żelem w aparacie do
elektroforezy
" Napełnić 1 x stężonym buforem elektrodowym dolne i górne naczynie
elektrodowe.
" Wyjąć ostrożnie grzebień, wszystkie utworzone studzienki muszą być zalane
buforem elktrodowym
6. Nanoszenie próbek na żel.
" Przygotowane wcześniej próbki nanosić do kolejnych studzienek w żelu przy
pomocy pipety automatycznej z tipsem o kapilarnym zakończeniu.
" Oprócz próbek badanych nanieść próbkę wzorcową
7. Rozdział elektroforetyczny
" Połączyć dolną elektrodę z biegunem  + , a górną z biegunem  - zasilacza.
" Włączyć zasilacz i prowadzić rozdzial przy napieciu 160V
" Kontynuować rozdział aż do wyjścia barwnika.
" Po zakończonym rozdziale wyłączyć prąd, wylać bufor, wyjąć płytkę
" Ostrożnie rozdzielić płytki
" Żel wybarwić
3. 1. 2. Barwienie żeli poliakrylamidowych.
1. Barwienie przy użyciu barwnika Coomassie Brillant Blue.
" Przygotować roztwór barwnika: 0,2% Coomassie Brillant Blue w mieszaninie
kwas octowy: metanol: woda o proporcjach 1: 5 : 5
" Żel zalać barwnikiem, czas barwienia zależy od grubości żelu, dla żelu 1 mm
jest to około 2 godz.
" Odbarwiać w mieszaninie kwas octowy  metanol  woda 1 : 2 : 8 przez noc.
2. Barwienie srebrem.
" Płukać żel w 50% metanolu przez godzinę lub całą noc
" Przygotować w odzielnych naczyniach dwie mieszaniny:
a) 0,8 g AgNO w 4 ml redestylowanej H O
3 2
b) 75,6 mg NaOH w 21 ml wody i 1,4 ml wody amoniakalnej
" Dodawać kroplami roztwór srebra do miszanego cały czas roztworu b),
dopełnić do 100 ml wodą
" Barwić żel 15 min.
" Płukać żel 3 x redestylowaną wodą po 5 min
" Zalać żel świeżo przygotowanym wywoływaczem
0,5 ml 1% kwasu cytrynowego
50 µl 37% formaldehydu
dopełnić do 100 ml H O redestylowaną
2
" Wywoływać żel do uzyskania prążków o pożądanej intensywności
" Zlać wywoływacz i przepłukać szybko żel wodą
30
Białka, Ekspresja klonowanego genu
" Zahamować reakcję roztworem "przerywacza"  10% kwas octowy i 45%
metanol
3. 2. Western blotting  immunobloting.
Immunoblotting jest połączeniem rozdziału elektroforetycznego w żelu ze specyficzną
detekcją immunochemiczną. Immunoblotting może być użyty do charakterystyki białka
(antygenu): wykrywania obecności białka, określania jego jakości i masy cząsteczkowej oraz
wydajności ekstrakcji.
Procedurę immunoblotingu można podzielić na sześć etapów:
1. Przygotowanie próby białka.
2. Rozdział elektroforetyczny próby białka w żelu poliakrylamidowym.
3. Transfer rozdzielonych polipeptydów na membranę.
4. Blokowanie niespecyficznych miejsc na membranie.
5. Dodanie przeciwciał.
6. Detekcja.
Ad. 1. Przygotowanie próby białka.
Jako próbę można użyć całe lizaty z komórek bakteryjnych, hodowli komórkowych, tkanek i
narządów. W większości przypadków przed naniesieniem na żel nie potrzeba ich wcześniej
oczyszczać. Ponieważ ograniczona jest całkowita ilość białka które może być wystarczająco
rozdzielone w żelu, niektóre mniejsze białka mogą być obecne w ilościach poniżej poziomu
detekcji. W tych przypadkach aby zwiększyć poziom detekcji, próbka białka musi być
częściowo oczyszczona przez standardową chromatografię (np HPLC).
Ad. 2. Rozdział elektroforetyczny próby białka w żelu poliakrylamidowym.
Wykonuje siÄ™ zgodnie z procedurÄ… opisanÄ… w 3.1.
Ad. 3. Transfer rozdzielonych polipeptydów na membranę.
Najczęściej do wiązania przenoszonych białek wykorzystuje się błony nylonowe i
nitrocelulozowe. Elektrotransfer wykonuje siÄ™ w specjalnym aparacie.
Ad. 4 i 5. Blokowanie niespecyficznych miejsc na membranie. Dodanie przeciwciał.
Próba białkowa zawiera mieszninę dużej ilości polipeptydow w której chcemy oznaczyć i
scharakteryzować jedno konkretne białko - antygen z dużą liczbą epitopów. W tym celu
wykorzystujemy przeciwciało królicze albo mysie (IgG), specyficznie wiążce się z tym
jednym antygenem znajdującym się na błonie. Zanim zostaną dodane przeciwciała należy
 zablokować powierzchnię błony gdzie nie ma przeniesionych białek, eliminując w ten
sposób tło i niespecyfiną hybrydyzację. W tym celu stosuje się bufor blokujący, w którym
jako czynnik blokujący można zastosować: odtłuszczone mleko, BSA, żelatynę i dodatkowo
detergent Tween 20. Dopiero po przepłukaniu błony w buforze blokującym dodaje się
zawiesinę podstawowego przeciwciała w odpowiednim mianie.
Ad. 6. Detekcja.
Detekcja może być bezpośrednia (rzadko) i pośrednia. Detekcja bezpośrednia polega na
użyciu wyznakowanego, podstawowego przeciwciała, wykrywającego osadzone w błonie
białko. Najczęściej jednak wykorzystywana jest detekcja pośrednia. Używa się drugiego
gwarantującego detekcję wyznakowanego przeciwciała, wiążącego specyficznie przeciwciało
podstawowe.
Wykorzystuje siÄ™ dwie metody detekcji:
31
Białka, Ekspresja klonowanego genu
" Przeciwciała wyznakowane radioaktywnie. Metody detekcji radioaktywnej polegają
na odczycie densytometrycznym lub na ekspozycji na kliszÄ™ rentgenowskÄ….
" Przeciwciała wyznakowane enzymatycznie. Są to proste metody nie wymagające
specjalistycznego sprzętu i dające bezpośredni wynik. Używa się buforu z substratami
dla enzymu którym wyznakowane są przeciwciała. W wyniku reakcji otrzymuje się
barwny produkt  w postaci prążka na błonie w miejscu gdzie znajduje się wykrywane
białko.
Enzymy wykorzystywane do znakowania:
Alkaliczna fosfataza  substraty to BCIP/NBT  prurpurowo-czarny produkt
Peroksydaza chrzanowa  substrat AEC albo DAB  niebiesko-czarny produkt
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
Materiały i sprzęt:
1. Aparat do elektrotransferu.
2. Kuwety.
3. Błona nitrocelulozowa  przycięta do wymiaru żelu.
4. Papier absorbujÄ…cy  np. Whatman 3MM
5. Roztwory:
BUFOR DO TRANSFERU
Tris 25 mM 2,9 g
Glicyna 190 mM 14,5 g
Metanol 20% 200 ml
Dopełnić wodą do 1 L
BUFOR 1 x TBS
20 mM Tris 4,84 g
500 mM NaCl 58,48 g
Dopełnić wodą do 2 L pH 7,5
BUFOR DO PA
UKANIA 1 x TTBS
20 mM Tris 4,84 g
500 mM NaCl 58,48 g
Tween 20 0,5 ml
Dopełnić wodą do 1 L pH 7,5
BUFOR BLOKUJ
CY
3% żelatyna 3 g
1 x TBS 100 ml
Podgrzać do 37°C w celu rozpuszczenia żelatyny, nastÄ™pnie schÅ‚odzić.
32
Białka, Ekspresja klonowanego genu
BUFOR DO PRZECIWACIAA

1 % żelatyna 2 g
1 x TTBS 200 ml
Podgrzać do 37°C w celu rozpuszczenia żelatyny, schÅ‚odzić przed dodaniem
przeciwciał.
a) Pierwszy roztwór przeciwciał  100 ml
Rozpuścić gatunkowo specyficzne podstawowe królicze albo mysie IgG w
odpowiednim mianie.
b) Drugi roztwór przeciwciał  100 ml
Rozpuścić drugie przeciwciało odpowiednie do podstawowego, skoniugowane z
fosfatazÄ… alkalicznÄ… (miano 3,000 - 33 µl na 100 ml buforu).
BUFOR W
GLANOWY
0,1 M NaHCO 8,40 g
3
1 mM MgCl x 6 H O 0,203 g
2 2
Dodać wody do 900 ml i doprowadzić pH do 9,8 dodając NaOH. Dopełnić wodą do
1000 ml.
ROZTWÓR DO REAKCJI BARWNEJ Z FOSFATAZ
ALKALICZN

Roztwór A Roztwór B
140 µl DMF 200 µl DMF
60 µl H O 0,003 g BCIP
2
0,006 g NBT
Proporcje na jedną reakcję. Przed samym użyciem połączyć roztwór A i B. Dopełnić do
20
ml buforem węglanowym
33
Białka, Ekspresja klonowanego genu
Wykonanie:
1. Elektroblotting  transfer białek rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym SDS na błonę
nitrocelulozową w aparacie do transferu. Przed użyciem błonę należy płukać 10 min w
buforze TBS. W odpowiedniej kolejności ułożyć żel, błonę i papier absorbujący na
przekładkach do aparatu i zanurzyć w buforze do transferu, ostrożnie usuwając pęcherzyki
powietrza z pomiędzy układanych warstw.
2. Złożyć  kanapkę jak przedstawia rysunek poniżej. Wszystkie komponenty muszą być
zwilżone buforem i ściśle złożone. Umieścić  kanapkę transferową w aparacie z błoną
od strony elektrody dodatniej.
3. Transfer prowadzić przez 1  18 godzin przy ~ 100 V w chłodni, albo okładając aparat
lodem.
4. Po transferze zanurzyć błonę w buforze blokującym. Inkubować 30  60 min z delikatnym
wytrząsaniem. Żel poliakrylamidowy można teraz wybarwić Coomassie albo srebrem dla
sprawdzenia efektywności transferu.
5. Przenieść błonę do buforu TTBS, płukać mieszając przez 5 min
6. Wymienić bufor TTBS i ponownie płukać 5 min.
7. Zanurzyć błonę w pierwszym roztworze przeciwciał. Inkubować 1  2 godziny z
delikatnym wytrzÄ…saniem.
8. Przepłukać błonę dwukrotnie przez 5 min w buforze TTBS.
9. Przenieść błonę do drugiego roztworu przeciwciał.
10. Płukać błonę w TTBS 5 min dwa razy.
11. Płukać błonę w buforze TBS przez 5 min w celu usunięcia detergentu Tween 20.
12. Przygotować świeżą mieszninę BCIP/NBT.
13. Dla rozwinięcia reakcji barwnej zanurzamy błonę w roztworze substratów dla fosfatazy
alkalicznej. W zależności od czułości reakcji inkubować 4  30 min a nawet do 4 godzin.
14. Zahamować reakcję przez zanurzenie błony w buforze TBS z 20 mM EDTA.
34
Białka, Ekspresja klonowanego genu
miękka
podkładka
anoda
papier +
absorpcyjny
_
katoda
żel
bufor do
elektroblottingu
nitroceluloza
obudowa z plastyku
kierunek transferu białka
Rys. 8 Prawidłowe ułożenie żelu i błony w aparacie do elektrotransferu. Transfer przebiega
od katody do anody, dlatego błona musi znajdować się po stronie elektrody dodatniej.
Ile jest białka?
analiza spektrofotometria kolorymetria elektroforeza
aminokwasów (A280 ) (Bradford)
detekcja transfer na błonę
(elektrobloting)
barwienie Coomassie barwienie detekcja
Blue srebrem
tusz indyjski barwienie żelazem barwienie złotem przeciwciała
(immunobloting)
35
Białka, Ekspresja klonowanego genu
Czy białko jest czyste ?
Z ilu podjednostek jest zbudowane ?
Jaką masę cząsteczkową ma białko i jego
podjednostki ?
Elektroforeza Chromatografia
Detekcja
Konwencjonalna HPLC
Barwienie Barwienie
Coomassie Blue srebrem
Filtracja na żelu Size-exclusion
Porównanie masy cząsteczkowej w
odniesieniu do standardowego markera
białkowego
Oszacowanie masy cząsteczkowej i ilości Oszacowanie masy cząsteczkowej
podjednostek nieznanego białka nieznanego białka
Rys. 10 Analiza czystości, masy cząsteczkowej i struktury podjednostek białka.
36
Białka, Ekspresja klonowanego genu
Objaśnienienie skrótów:
IPTG  izopropylo-²-D-tiogalaktopiranozyd
PMSF  fluorek fenylometylo sulfonylu
EDTA  kwas etylenodiaminotertaoctowy
Tris  Trihydroksymetyloaminometan
SDS  siarczan dodecylu sodu
TEMED  N, N, N , N -tetrametyloetylenodiamina
NBT  azotan błękitu tetrazolowego
BCIP  fosforan bromochloroindolylowy
DMF  N-N Dimetyloformamid
AEC  3-amino-9-etylkarbazolu
DAB - diaminobenzydyna
CH3
HOCH2
HOOC-H C CH
2 2-COOH
O S-CH-CH3
OH
N-CH
2-CH
2-N
OH
HOOC-2 2-COOH
C CH
EDTA
OH
IPTG
O
H3C-(CH2)10-H2C O ONa
S
CH F
2-S0
2
SDS
O
PMSF
CH2-OH
H C CH
3 3
HO-H2C
CH2-OH
N-CH
2-CH
2-N
C
H C
3 CH
3
TEMED
NH2
TRIS
37
Skrypt zredagowany w oparciu o z
ródła:
1.  Short protocols in molecular biology pod redakcjÄ… F. M. Ausubel i inni.
Wydawnictwo WILEY 2002 r.
2.  Molecular Cloning  a laboratory manual J. Sambrook, E. F. Fritsch,
T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 r.
3.  Antibodies - a laboratory manual E. Harlow, D. Lane Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1988 r.
4.  Podstawy inżynierii genetycznej: teoria, ćwiczenia, testy J. Kur. Politechnika
Gdańska 1994.
5.  Inżynieria genetyczna skrypt pod redakcją T. Kaczorowski. Uniwersytet
Gdański.
.
KiZMF AMG, 2005-2007 38