Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
UNIWERSYTET MARII CURIE-SKA
ODOWSKIEJ
WYDZIAA
BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII
ZAKA
AD BIOLOGII MOLEKULARNEJ
ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ
dla studentów II roku biologii oraz
III roku mikrobiologii i biotechnologii
LUBLIN 2012
Wersja 1.0
1
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Spis treści:
1. Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych & & & & & & & & & & & & & & 3
2. Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae & & & & & & & & .6
3. Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B
drożdży Saccharomyces cerevisiae& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & .10
4. Izolacja jąder komórkowych i histonów& & & & & & & & & & & & & & & & & & ..13
5. Analiza składu białkowego chromatyny& & & & & & & & & & & & & & & & & & ..16
6. Trawienie DNA chromatyny nukleazÄ… ze Staphylococcus aureus& & & & & & & & & ..17
7. Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazÄ…
ze Staphylococcus aureus& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 20
8. Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ...21
9. Izolacja RNA z komórek drożdży& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ....23
10. Elektroforetyczna analiza RNA& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 25
11. Translacja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych& & & & .26
12. Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych& & & & & ..28
13. Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej
drożdży Saccharomyces cerevisiae& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ..30
14. Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży& & & & & & & & & & & & & ..33
15. Analiza elektroforetyczna białek rybosomowych& & & & & & & & & & & & & & & 35
16. Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae& & & & & & & & & 36
17. Lokalizacja i regulacja aktywności kinazy białkowej CK2 & & & & & & & & & & & 38
18. Aktywacja i specyficzność substratowa kinazy zależnej od cAMP& & & & & & & & .42
19. Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych & & & & & & & & & & & & & & & ...46
20. Identyfikacja inhibitora trypsyny metodÄ… elektroforezy w warunkach
niedenaturujÄ…cych& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 49
21. Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
na przykładzie inwertazy & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 51
22. Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae & & & & & & & & & & & & & & .54
23. Transfer genów do komórek ssaczych  transfekcja& & & & & & & & & & & & & & 60
24. Załącznik do ćwiczeń& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ...68
2
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych
Analiza składu chemicznego RNA lub DNA jest poprzedzona ich hydrolizą.
W przypadku RNA, można stosować zarówno hydrolizę zasadową, jak i kwaśną. DNA zaś
jest odporny na działanie zasad. Decyduje o tym brak grupy -OH przy węglu 22 -
deoksyrybozy. Z tego względu, analizę chemiczną DNA przeprowadza się po hydrolizie
kwasami.
Hydroliza kwaśna RNA i DNA
W celu całkowitej hydrolizy RNA lub DNA i uzyskania wolnych zasad purynowych
i pirymidynowych, stosuje się wysokie stężenia kwasu solnego, nadchlorowego lub
siarkowego.
Odczynniki
1% wodne roztwory DNA i RNA (preparaty handlowe)
1M roztwór H2SO4
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej zlewki odmierzyć 10 ml 1% roztworu RNA, a do drugiej 10 ml 1% roztworu DNA.
Następnie, do obu zlewek odmierzyć po 10 ml 1M H2SO4. Zlewki zatkać gumowym korkiem
z umieszczoną w nim rurką szklaną i gotować na wrzącej łaz
ni wodnej przez 60 min. Po tym
czasie zlewki wyjąć z łaz
ni, oziębić i zachować do dalszych doświadczeń.
Wykrywanie pentoz (reakcja Biala)
Pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach) ogrzewane ze stężonym HCl ulegają
cyklizacji do furfuralu, który w obecności jonów Fe3+ kondensuje z orcyną, tworząc związek
barwy zielonej.
Odczynniki
0,5% roztwory RNA i DNA po hydrolizie
Odczynnik orcynolowy; nietrwały-przygotować bezpośrednio przed użyciem (0,3 g orcyny
rozpuścić w 100 ml stężonego HCl i dodać 5 kropli 10% roztworu FeCl3)
3
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml hydrolizatu RNA, a do drugiej 0,5 ml hydrolizatu
DNA. Do każdej z probówek dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i ogrzewać
ok. 5-10 min. we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej. W probówce zawierającej pentozę pojawia się zielone
zabarwienie.
Wykrywanie deoksyrybozy (reakcja Dischego)
Odczynniki
Odczynnik difenyloaminowy (1g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml lodowatego CH3COOH
z dodatkiem 2,75 ml stężonego H2SO4 cz.d.a.)
0,5% roztwory RNA i DNA (przed lub po hydrolizie)
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml roztworu RNA, a do drugiej 0,5 ml roztworu DNA. Do
każdej z probówek dodać po 1 ml odczynnika difenyloaminowego. Probówki umieścić
we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej na 5-10 min. Pojawienie się niebieskiego zabarwienia próby
świadczy o obecności deoksyrybozy.
Wykrywanie kwasu ortofosforowego
Wykrywanie ortofosforanów w hydrolizatach kwasów nukleinowych polega na reakcji
z molibdenianem amonu. Jon ortofosforowy tworzy kompleks soli amonowej
heteropolikwasu tetratrimolibdeniano-fosforowego o barwie żółtej.
Odczynniki
Roztwór molibdenianu amonowego: 10g kwasu molibdenowego rozpuścić w mieszaninie:
14,4 ml 25% roztworu amoniaku i 27,1 ml wody. Następnie całość wlać powoli, ciągle
mieszając, do roztworu kwasu azotowego (48,9 ml stężonego kwasu azotowego plus 114,8 ml
wody)
0,5% roztwory RNA i DNA po hydrolizie
0,5% roztwór NaH2PO4 ( roztwór wzorcowy)
4
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Wykonanie ćwiczenia
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml hydrolizatu RNA, do drugiej 0,5 ml hydrolizatu DNA,
a do trzeciej 0,5 ml wzorcowego roztworu ortofosforanu (kontrola). Do każdej z probówek
dodać po 1 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówek ogrzać na łaz
ni
wodnej do wrzenia. W obecności ortofosforanów wytrąca się żółty osad fosfo-molibdenianu
amonowego.
Wykrywanie zasad purynowych
Odczynniki
1M roztwór NaOH
1% roztwór CuSO4
0,5% roztwor RNA po hydrolizie
Nasycony roztwór Na2S2O5 (10 ml)
Wykonanie ćwiczenia
Do 0,5 ml hydrolizatu RNA dodawać kroplami 1M NaOH, by uzyskać pH roztworu około 6,0
(odczyn sprawdzać papierkiem wskaz
nikowym). Następnie, roztwór zagotować, po czym
wprowadzić 6 kropli 1% CuSO4, a potem ostrożnie kroplami nasycony roztwór Na2S2O5.
Pirosiarczyn sodu redukuje jony Cu2+ do Cu+, które z purynami tworzą nierozpuszczalne sole
miedziawe.
Rozpuszczalność kwasów nukleinowych w kwasach, zasadach i alkoholu
Odczynniki
1 % wodne roztwory RNA i DNA
2M roztwór HCl
2M roztwór NaOH
Alkohol izopropylowy (oziębiony)
Wykonanie ćwiczenia
1. Do dwóch probówek zawierających oddzielnie po 0,5 ml roztworów RNA i DNA,
dodawać kroplami 2M HCl, aż nastąpi wytrącenie się kwasów nukleinowych.
Następnie dodawać kroplami 2M NaOH. Zanotować wynik.
2. Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml roztworu RNA, a do drugiej 0,5 ml roztworu
DNA. Do każdej z nich dodać po 1,5 ml oziębionego izopropanolu. Zanotować wynik.
5
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae
Izolacja kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem wielu procedur stosowanych
w inżynierii genetycznej oraz diagnostyce molekularnej. Celem jest uzyskanie materiału
wysokiej czystości, czyli wolnego od białek i polisacharydów mogących negatywnie wpływać
na dalsze analizy. Istotne jest także, aby izolowany kwas nukleinowy nie uległ zbytniej
fragmentacji czy enzymatycznej degradacji w czasie stosowanych procedur. Aktualnie
dysponujemy bardzo zróżnicowanymi metodami otrzymywania kwasów nukleinowych,
od złożonych, wieloetapowych procedur wykorzystujących rozpuszczalniki organiczne
do szybszych, prostszych i bezpieczniejszych. Wybór odpowiedniej metody izolacji
zależy od:
" rodzaju otrzymywanego kwasu nukleinowego (DNA genomowe, mitochondrialne,
plazmidowe, RNA itd.),
" pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe itd.) i rodzaju materiału
z którego przeprowadzamy izolację (np. z tkanek, organu, hodowli komórkowej
itd.),
" docelowego przeznaczenia kwasu nukleinowego (np. PCR, klonowanie, synteza
cDNA, itd.), co nakłada konkretne wymagania względem jego czystości
i jakości.
Każda izolacja drożdżowego DNA wymaga rozbicia ściany komórkowej. Stosowane
są metody mechaniczne lub łagodniejsze obejmujące enzymatyczną degradację ściany
komórkowej drożdży i lizę otrzymanych sferoplastów przy udziale detergentów. Enzymy
wykorzystywane do otrzymania sferoplastów drożdżowych to najczęściej litykaza
(z Arthrobacter luteus) lub glukulaza (ze Å›limaka), hydrolizujÄ…ce wiÄ…zanie ²-1,3
glikozydowe występujące w glukanie ściany komórkowej.
Zastosowana na ćwiczeniach metoda izolacji umożliwia otrzymanie kilkunastu
mikrogramów drożdżowego DNA, które jest gotowe do cięcia enzymami restrykcyjnymi
i może służyć jako matryca w rekcji PCR.
6
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Materiały i odczynniki
1. 12- godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w pożywce YPD (50 ml)
2. Bufor do sferoplastyzacji:
1 M sorbitol,
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
20 mM EDTA,
20 mM ²-MET (dodać bezpoÅ›rednio przed użyciem)
3. Zymoliaza 100T (handlowy preparat zawierajÄ…cy litykazÄ™) - 2,5 mg/ml w buforze
do sferoplastyzacji
4. 10 % w/v SDS
5. Bufor do lizy (50 mM Tris pH 7.5; 20 mM EDTA)
6. 5 M octan potasu
7. 5 M NaCl
8. 96% i 70% etanol (oziębiony)
9. Bufor TE (10 mM Tris  HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA)
10. Termoblok lub Å‚az
nia wodna
11. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 2 ml i końcówki do pipet
12. Mikroskop świetlny oraz szkiełka podstawowe i nakrywkowe
13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona 70)
Wykonanie ćwiczenia
1. Przenieść 4 ml zawiesiny komórek do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.
Osadzić komórki przez wirowanie przy prędkości 5000 rpm przez 3 min.
w temp. 40C.
2. Osad komórek zawiesić łącznie w 0,5 ml buforu do sferoplastyzacji w jednej
probówce Eppendorfa (dodać ²-MET do koÅ„cowego stężenia 20 mM!).
3. Dodać 20 źl roztworu zymoliazy 100T, dobrze wymieszać i inkubować przez 20 min
w temp. 370C (sferoplastyzacja trwa od 20 do 120 min, zależnie od szczepu, rodzaju
podłoża czy fazy wzrostu komórek). Formowanie się sferoplastów można sprawdzić
poniższymi metodami:
a) pod mikroskopem świetlnym, pobierając na jedno szkiełko podstawowe 4 źl
zawiesiny komórek oraz 4 źl 0,1% SDS, a na drugie 4 źl zawiesiny komórek oraz
7
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
4 źl buforu do sferoplastyzacji; formowanie sferoplastów jest zakończone,
gdy 80-90 % komórek występuje jako tzw. komórki-duchy (z ang. ghost cells);
b) dodając do dwóch szklanych probówek po 0,5 ml buforu do sferoplastyzacji,
potem do jednej z nich 50 źl 10 % roztworu SDS, następnie do obu probówek
dodać po 5 źl zawiesiny komórek i energicznie zamieszać; stopień strawienia
ściany komórkowej można uznać za zadowalający, jeśli zawiesina w probówce
z SDS stanie siÄ™ klarowna.
4. Osadzić uzyskane sferoplasty przez wirowanie przy prędkości 3000 rpm przez 5 min.
w temp. 40C. Supernatant delikatnie usunąć za pomocą pipety, a osad sferoplastów
zawiesić w 0,5 ml buforu do lizy.
5. Dodać 25 źl 10% SDS (końcowe stężenie 0,5 % SDS). Zawartość dokładnie
wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki. Uważać aby zawartość
probówki nie uległa spienieniu! Całość inkubować 20 min. w temp. 650C.
6. Schłodzić probówkę w lodzie po czym dodać 0,2 ml 5M octanu potasu, Zawartość
dokładnie wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki, a następnie inkubować
w lodzie przez 20 min. Widoczny po dodaniu octanu potasu biały precypitat tworzą
kompleksy SDS ze zdenaturowanymi białkami.
7. Odwirować próbki przy prędkości 10000 rpm przez 10 min. w temp. 40C.
8. Przenieść 500 źl supernatantu do nowej probówki Eppendorfa o poj. 2 ml (temp.
pokojowa).
9. Do supernatantu dodać trzy objętości oziębionego 96% etanolu i 1/10 objętości 5M
NaCl (precypitacja kwasów nukleinowych). Próbkę pozostawić w temp.  200C
do kolejnych ćwiczeń (co najmniej godzinę).
10. Osadzić wytrącony kwas nukleinowy przez wirowanie przy prędkości 10000 rpm
przez 15 min. w temp. 40C, po czym delikatnie usunąć supernatant.
11. Uzyskany osad DNA przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu, po czym odwirować
przez 5 min. przy prędkości 10000 rpm w temp. 40C. Supernatant odrzucić, a osad
wysuszyć w eksykatorze przez 20 min. (aż do całkowitego zaniku zapachu etanolu).
8
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
12. Rozpuścić osad w 50-100 źl buforu TE (pH 8.0); gdy pojawią się problemy
z rozpuszczalnością DNA - inkubować ok. 10 min w temp. 620C lub pozostawić
w lodówce na okres około 12 godzin.
13. Sprawdzić wyizolowane DNA (przygotowując próbki do elektroforezy zawierające
15 źl DNA i 5 źl buforu próbkowego do DNA) na 0.7 % żelu agarozowym
(przygotowanie żelu i przeprowadzenie elektroforezy DNA  patrz przepis strona 70).
DNA przechowywać w temp.  700C. Należy unikać wielokrotnego zamrażania
i odmrażania próbek DNA.
9
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B
drożdży Saccharomyces cerevisiae
Oczyszczone genomowe DNA może służyć jako matryca do amplifikacji genów
z wykorzystaniem metody PCR (z ang. Polymerase Chain Reaction). Amplifikacja sekwencji
DNA odbywa się z użyciem pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest
komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA. Startery te są wydłużane
w kierunku do siebie przy udziale termostabilnej polimerazy DNA w cyklu kilkunastu
(kilkudziesięciu) reakcji, na które składają się: denaturacja, przyłączanie starterów oraz
polimeryzacja. Poszczególne etapy cyklu reakcji PCR zachodzą w różnych temperaturach:
" zaczynajÄ…ca caÅ‚y cykl reakcja denaturacji odbywa siÄ™ w temperaturze 93-96°C i jej
zadaniem jest rozplecenie podwójnych nici DNA,
" po czym, następuje ochłodzenie mieszaniny reakcyjnej do doświadczalnie dobranej
temperatury (42-680C) w której następuje przyłączenie starterów do matrycy,
ang. annealing (na tym etapie można kontrolować specyficzność łączenia się starterów
do DNA),
" w kolejnym etapie, polimeryzacji, temperatura wzrasta do 720C (optymalna temp.
działania polimerazy) i następuje wydłużanie nici - począwszy od końca 3' startera
enzym dokłada kolejne, komplementarne w stosunku do matrycy nukleotydy w tempie
około 1000 nukleotydów na minutę dla najczęściej wykorzystywanej polimerazy Taq
(z Thermus aquaticus).
Ze względu na jednoczesne kopiowanie dwóch komplementarnych nici matrycy, po
każdym cyklu następuje podwojenie liczby amplifikowanych cząsteczek DNA, a liczba kopii
DNA po zakończeniu około 30 cykli przekracza już kilka milionów. Jakość uzyskanego
za pomocą reakcji PCR DNA można analizować metodą elektroforezy w żelu agarozowym,
wybarwiajÄ…c DNA bromkiem etydyny.
Interpretując wyniki uzyskane metodą PCR, należy pamiętać, że najczęstszą
przyczyną braku amplifikacji jest hamujący wpływ zanieczyszczeń obecnych w matrycowym
DNA. Innym często występującym problemem jest obecność niespecyficznych produktów
amplifikacji, która najczęściej wynika z niewłaściwego doboru temperatury przyłączania się
10
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
starterów czy nieodpowiedniego stężenia jonów Mg2+, koniecznych do prawidłowego
Å‚Ä…czenia siÄ™ DNA ze starterami.
Celem ćwiczenia jest porównanie długości genów dla dwóch drożdżowych białek
rybosomowych: P1A i P1B powielonych metodą PCR z genomowego DNA drożdży. Białka
te cechuje jednakowa długość łańcucha polipeptydowego (106 aa) i duże podobieństwo
struktury pierwszorzędowej, czego pochodną są zbliżone masy cząsteczkowe białek
wynoszące odpowiednio 10 908 i 10 667 Da. Pozwala to założyć jednakową długość
sekwencji mRNA kodującej te białka. Startery reakcji PCR zostały zaprojektowane w ten
sposób, aby powieleniu uległa sekwencja obejmująca początkowy kodon ATG jak też kodon
STOP obu białek, dlatego uzyskane po reakcji PCR fragmenty DNA będą bezpośrednio
odpowiadały długości genów kodujących te białka.
P1A 1 MSTESALSYA ALILADSEIE ISSEKLLTLT NAANVPVENI WADIFAKALD
P1B 1 MSDSIISFAA FILADAGLEI TSDNLLTITK AAGANVDNVW ADVYAKALEG
P1A 51 GQNLKDLLVN FSAGAAAPAG VAGGVAGGEA GEAEAEKEEE EAKEESDDDM
P1B 51 KDLKEILSGF HNAGPVAGAG AASGAAAAGG DAAAEEEKEE EAAEESDDDM
P1A 101 GFGLFD
P1B 101 GFGLFD
Rys. Porównanie sekwencji aminokwasowych drożdżowych białek P1A i P1B
Materiały i odczynniki
1. Genomowe DNA drożdży uzyskane na poprzednich ćwiczeniach.
2. Startery reakcji PCR dla genów kodujących białka P1A i P1B
3. Polimeraza Taq 0,5U/źl
4. Bufor dla polimerazy Taq (firmowy)
5. 2 mM mieszanina deoksynukleotydów (dNTP)
6. 25 mM MgCl2 (firmowy)
7. Jałowa dejonizowana woda
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 0,5 ml i cienkościenne probówki do reakcji PCR
o poj. 0,2 ml oraz końcówki do pipet
9. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona 70)
11
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Wykonanie ćwiczenia
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 0,5 ml, umieszczonej w lodzie, odmierzyć następujące
składniki mieszaniny reakcyjnej:
23 źl dejonizowanej wody
5 źl dNTP
5 źl buforu dla polimerazy Taq
5 źl roztworu MgCl2
2 źl genomowego DNA drożdży
2 źl polimerazy DNA Taq
2. Wymieszać zawartość probówki i osadzić płyn ze ścianek przez odwirowanie, po
czym rozdzielić mieszaninę reakcyjną na dwie równe części do dwóch próbówek do
PCR. Następnie do jednej z próbówek dodać po 2 źl obu starterów do amplifikacji
genu kodującego białko P1A, a do drugiej probówki dodać po 2 źl obu starterów do
amplifikacji P1B.
3. Reakcje przeprowadzić w termocyklerze w warunkach wskazanych przez
prowadzącego ćwiczenia. Po reakcji do każdej probówki dodać po 5 źl buforu do
elektroforezy DNA i dokonać elektroforetycznego rozdziału powstałych fragmentów
oraz komercyjnego wzorca DNA w 1% żelu agarozowym (według przepisu na stronie
70).
Interpretacja wyników
1. Porównać długość fragmentów DNA i zinterpretować otrzymane wyniki.
2. Samodzielnie przeprowadzić porównanie sekwencji genów dla obu białek korzystając
z bazy http://www.yeastgenome.org/ (nazwy genów dla białek to odpowiednio
RPP1A i RPP1B) i przedstawić zestawienie sekwencji genów obu białek w formie
pisemnej na następnych zajęciach.
12
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Izolacja jąder komórkowych i histonów
W komórkach eukariotycznych większość DNA znajduje się w wyspecjalizowanych
organellach  jądrach komórkowych. DNA jądrowy występuje w postaci kompleksu
nukleoproteinowego, zwanego chromatynÄ…. PodstawowÄ… jednostkÄ… strukturalnÄ… chromatyny
jest nukleosom. W skład nukleosomu wchodzi tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core particle),
cząsteczka histonu H1 i fragment DNA o długości ok. 190-220 pz. Cząstkę rdzeniową tworzy
kompleks ośmiu histonów (oktamer) zwanych histonami rdzeniowymi (po dwie cząsteczki
histonów H2A, H2B, H3 i H4). Wokół oktameru owinięty jest odcinek DNA o długości 140-
150 pz. Pozostałą część stanowi łącznikowy DNA (ang. linker DNA) o długości 50-70 pz
z którym oddziałuje pojedyncza cząsteczka histonu H1. Znanych jest wiele wariantów
sekwencyjnych histonu H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju
danego organizmu. Na przykład w jądrzastych erytrocytach ptaków zamiast histonu H1
występuje histon H5.
Histony mogą podlegać szeregu modyfikacjom potranslacyjnym, np. acetylacji,
metylacji, fosforylacji czy ubikwitynacji. Modyfikacje te majÄ… istotne znaczenie w regulacji
stopnia upakowania DNA i jego dostępności dla replikacji i transkrypcji np. acetylacja reszt
lizyny na N-końcu łańcucha polipeptydowego histonów rdzeniowych zmniejsza ich
powinowactwo do DNA, co powoduje rozluz
nienie struktury chromatyny i zwiększenie
poziomu ekspresji genów. Warto zauważyć, że wpływ modyfikacji potranslacyjnych
histonów na stopień kondensacji chromatyny i ekspresję genów nie zależy tylko od rodzaju
modyfikacji ale także od miejsca wystąpienia takiej modyfikacji na białku histonowym,
np. metylacja reszty lizyny w pozycji 9 łańcucha polipeptydowego histonu H3 powoduje
zwiększenie stopnia upakowania chromatyny i wyciszenie ekspresji genów zaś metylacja
reszty lizyny w pozycji 4 wpływa na rozluz
nienie struktury chromatyny. Wysunięto hipotezę
 kodu histonowego , która sugeruje, że istnieją pewne określone wzory modyfikacji histonów
odpowiedzialne za zachodzenie konkretnych procesów w komórce.
Materiał badawczy na ćwiczeniach stanowi linia komórkowa fibroblastów mysich
NIH 3T3 lub linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy HeLa. Komórki
hodowane są na płytkach Petriego (10x14cm) odpowiednio w płynie hodowlanym DMEM
i RPMI, w temperaturze 370C i w atmosferze 5% CO2. Celem ćwiczenia jest otrzymanie
preparatów zawierających wszystkie białka jądrowe oraz izolacja histonów z jąder komórek
linii NIH 3T3 lub HeLa. Histony oczyszcza się z jąder komórkowych wykorzystując zdolność
13
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
tych białek do rozpuszczania się w kwasach nieorganicznych, np. 0,25M HCl lub 0,2M
H2SO4.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości
komórek ok. 90% (dwanaście płytek Petriego na cztery zespoły studentów)
2. Bufor PBS
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4, pH 7,5
3. Bufor do izolacji jÄ…der:
200 mM Tris-HCl, pH 7,5
100 mM NaCl
250 mM sacharoza
1 mM EDTA
0,5% Triton X-100
4. Bufor próbkowy do elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym
SDS-PAGE (4x stężony)
5. 0,25 M HCl
6. Aceton (oziębiony)
7. PBS z 66% glicerolem
8. Zdrapywacz do komórek
9. Homogenizator szklano-teflonowy o pojemności 2 ml
10. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. +40C
Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa
1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść
na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.
14
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
2. Przepłukać komórki buforem PBS i zeskrobać je z płytek za pomocą specjalnego
zdrapywacza do komórek. Następnie zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich płytek
2 ml oziębionego PBS i przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml.
3. Komórki odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,
a osad zawiesić w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować 20 min. w lodzie.
4. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego
i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji
można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).
5. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml
i odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.
6. Supernatant (zawierający białka cytoplazmatyczne) przenieść do nowej probówki
Eppendorfa, oznaczyć w nim stężenie białka metodą Bradford (przepis strona 80),
a następnie przygotować próbki do elektroforezy SDS-PAGE zawierające po 15 źg
i 30 źg białka (przepis strona 74). Gotowe próbki do analizy metodą SDS-PAGE
przechowywać w temp. -200C do kolejnych ćwiczeń.
7. Uzyskany osad jąder zawiesić, za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego,
w 2 ml buforu PBS.
8. Z kolejnych trzech płytek Petriego z komórkami fibroblastów mysich izolować jądra
według powyższej procedury ale z zachowaniem warunków jałowych, zaś uzyskany
osad jąder zawiesić, za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego, w 2 ml buforu
PBS z 66% glicerolem i przechowywać w temp. -200C do kolejnych ćwiczeń.
Izolacja białek jądrowych
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 źl zawiesiny jąder i wirować
przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.
2. Supernatant odrzucić a osad jąder zawiesić w 100 źl buforu próbkowego
do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).
3. Próbki dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 950C przez 5 min.
W wyniku uwolnienia DNA z jÄ…der zawiesina przyjmuje galaretowatÄ… konsystencjÄ™.
4. Po inkubacji próbki odwirować przy prędkości 6000 rpm przez 10 min. Supernatant
zawierający białka jądrowe przenieść do nowej probówki Eppendorfa i zamrozić.
15
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Izolacja histonów z użyciem 0,25 M HCl
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 źl zawiesiny jąder i wirować
przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.
2. Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić w 50 źl 0,25 M HCl i dokładnie
wymieszać.
3. Próbkę pozostawić w temp. pokojowej na 30 min. (ekstrakcja histonów),
a następnie odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.
4. Supernatant zawierający histony przenieść do nowej probówki Eppendorfa o poj.
1,5 ml.
5. Do osadu dodać ponownie 50 źl 0,25 M HCl, dokładnie wymieszać i pozostawić
na 30 min. w temp. pokojowej (ponowna ekstrakcja w celu zwiększenia wydajności).
6. Próbkę odwirować przy prędkości 1500 rpm przez 10 min.
7. Uzyskane supernatanty, zawierające histony, połączyć.
8. Wytrącać histony z supernatantu przez dodanie 8 objętości (0,8 ml) oziębionego
acetonu. Całość pozostawić do kolejnych ćwiczeń (minimum na 24 godziny)
w temp. -20OC.
Analiza składu białkowego chromatyny
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek jądrowych techniką elektroforezy
jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE
(metoda Laemmli ego).
Materiały i odczynniki
1. Aceton (oziębiony)
2. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona 74)
3. Preparaty białek jądrowych, cytoplazmatycznych i histonów otrzymane na poprzednim
ćwiczeniu
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących według przepisu na stronie 74.
16
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
2. Próbki z wytrąconymi histonami odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 15 min.
w 40C w celu otrzymania osadu białek histonowych. Następnie osad trzykrotnie
przemyć 1 ml oziębionego acetonu i wysuszyć na powietrzu. Osad białek
histonowych zawiesić w 40 źl buforu próbkowego do elektroforezy SDS-PAGE
(1x stężony).
3. Próbki zawierające wszystkie białka jądrowe, wyizolowane histony oraz białka
cytoplazmatyczne zawieszone w buforze próbkowym do elektroforezy SDS-PAGE
ogrzewać przez 3 min. w temp. 900C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po
30 źl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V, tak długo,
aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić
błękitem Coomassie (patrz strona 76).
Interpretacja wyników
1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe białek histonowych.
Trawienie DNA chromatyny nukleazÄ… ze Staphylococcus aureus
Nukleaza ze Staphylococcus aureus (MN-aza, nukleaza mikrokokowa) jest
stosunkowo niespecyficzną endonukleazą, która tnie zarówno jedno- jak i dwuniciowe kwasy
nukleinowe, chociaż bardziej aktywna jest wobec substratów jednoniciowych. Cięcie DNA
lub RNA następuje preferencyjnie w regionach bogatych w AT lub AU. Zmieszana
z chromatyną MN-aza tnie fragmenty DNA, które nie są chronione przez związanie
z białkami. Dlatego też w wyniku działania MN-azy na chromatynę otrzymuje się szereg
fragmentów odpowiadających mono- i oligonukleosomom. Enzym wykazuje swoją
aktywność w obecności jonów Ca2+. Reakcję trawienia chromatyny przez MN-azę można
zatrzymać stosując odpowiednie stężenie EGTA lub EDTA, które działając jako chelatory
jonów dwuwartościowych, hamują aktywność enzymu.
Ćwiczenie ma na celu otrzymanie mieszaniny oligonukleosomów w wyniku trawienia
chromatyny jąder fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa przez niespecyficzną
endonukleazÄ™ ze Staphylococcus aureus.
17
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Materiały i odczynniki
1. Zawiesina jąder fibroblastów mysich lub komórek HeLa w PBS z 66% glicerolem
2. Bufor do cięcia MN-azą:
20 mM boran sodu, pH 8,8
5 mM CaCl2
3. Roztwór MN-azy w H2O (300 u/µl). BezpoÅ›rednio przed ćwiczeniami rozcieÅ„czyć
MN-azÄ™ 240-krotnie (1 µl roztworu MN-azy dodać do 239 H2O µl). Uzyskuje siÄ™
koÅ„cowe stężenie 1,25 u/µl
4. 100 mM EDTA
5. 10% SDS
6. Pronaza E  roztwór w H2O o stężeniu 25 mg/ml
7. Fenol, pH 7,5- 8,0
8. Chloroform
9. 5 M NaCl
10. 96% etanol (oziębiony)
11. 70% etanol (oziębiony)
12. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych.
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 1 ml zawiesiny jąder i dodać 0,5 ml
buforu do cięcia MN-azą.
2. Zawiesinę wymieszać i odwirować przy prędkości 5000 rpm przez 5 min. w celu
uzyskania osadu jÄ…der.
3. Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić ponownie w 1 ml buforu do cięcia
MN-azÄ….
4. Dodać 5 µl przygotowanego roztworu MN-azy (6,25u) i wymieszać zawartość
probówki.
5. BezpoÅ›rednio po dodaniu enzymu przenieść 300 µl mieszaniny do nowej probówki
Eppendorfa o poj. 1,5 zawierajÄ…cej 30 µl oziÄ™bionego 100 mM EDTA (czas
trawienia 0).
18
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
6. Pozostałą część mieszaniny inkubować w temp. 37oC. Po upływie 5 i 10 min. (licząc
od czasu 0) inkubacji, przenosić po 300 µl mieszaniny do nowych probówek
Eppendorfa zawierajÄ…cych po 30 µl oziÄ™bionego 100 mM EDTA.
7. Do tak otrzymanych próbek dodać po 5 µl 10% SDS i 3 µl roztworu pronazy.
8. Inkubować próbki przez 30 min. w temp. 37oC (trawienie białek jądrowych). Reakcję
zatrzymać przez dodanie 34 µl 10% SDS.
9. Do każdej probówki dodać po 400 µl fenolu i wytrzÄ…sać caÅ‚ość przez 10 min.
(ekstrakcja DNA) po czym odwirować przez 5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej
wszystkie wirowania wykonywać przy 10000 rpm w 40C) w celu rozdzielenia faz.
10. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa, dodać po 400 źl
chloroformu i wytrząsać przez 5 min. (usuwanie resztek fenolu), a potem odwirować
przez 5 min.
11. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa i dodać po 6 źl 5M
NaCl oraz 800 źl oziębionego 96% etanolu. Próbki pozostawić w temp. -20oC, w celu
precypitacji DNA, do kolejnych ćwiczeń.
19
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazÄ…
ze Staphylococcus aureus
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach
preparatów DNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona 70)
2. Preparaty DNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.
Wykonanie ćwiczenia
1. Wytrącony na poprzednich ćwiczeniach DNA odwirować przy prędkości 10000 rpm
przez 15 min. w 40C. Uzyskany osad DNA przemyć 0,5 ml oziębionego 70% etanolu,
po czym odwirować przez 5 min. i wysuszyć na powietrzu.
2. Osad DNA rozpuścić w 30 źl buforu próbkowego do elektroforezy DNA.
3. Przygotować 100 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu na stronie
70.
4. Na żel nanosić po 5-30 źl próbek DNA. Rozdział fragmentów DNA prowadzić przy
napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej
elektroforezie obserwować rozdzielone fragmenty DNA pod lampą UV. Obrazem
trawienia powinna być  drabinka prążków, które odpowiadają fragmentom DNA
stanowiącym wielokrotność około 200 par zasad.
Interpretacja wyników
1. Porównać obraz elektroforetyczny DNA przed i po trawieniu MN-azą.
2. Określić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku działania MN-azy.
20
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych
W procesie transkrypcji, katalizowanej przez polimerazy RNA zależne od DNA,
informacja zawarta w DNA zostaje przepisana na RNA. Celem ćwiczenia jest zbadanie
wpływu ryfampicyny i aktynomycyny D na transkrypcję w warunkach in vivo w komórkach
bakterii E. coli i drożdży S. cerevisiae. Ryfampicyna, półsyntetyczna pochodna ryfamycyn,
oddziaÅ‚uje z podjednostkÄ… ² bakteryjnej polimerazy RNA i blokuje inicjacjÄ™ transkrypcji
nowych łańcuchów RNA nie wpływając na transkrypcję łańcuchów, których synteza już się
rozpoczęła. Aktynomycyna D zaś wiąże się do dwuniciowego DNA, uniemożliwiając
wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA.
Materiały i odczynniki
1. 18 godzinna hodowla bakterii E. coli w podłożu LB (20 ml)
2. 18 godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w podłożu SD (20 ml)
3. Podłoże LB i SD
4. Ryfampicyna (20 mg/ml w metanolu)
5. Aktynomycyna D (5 mg/ml w 96% etanolu)
6. [3H]-urydyna
7. Wysuszone krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 2,0 cm, moczone uprzednio
przez dobÄ™ w roztworze 0,5M NaCl z dodatkiem 1 mg/ml nie znakowanej urydyny
8. TCA 5% i 10%
9. PÅ‚yn scyntylacyjny
Wykonanie ćwiczenia
1. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm
(OD600). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (pożywka SD). Jeśli zaistnieje
konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości.
2. Znając gęstość optyczną hodowli drożdży, przygotować 5 ml hodowli rozcieńczonej
pożywką SD, do OD600=0,4.
3. Tak przygotowaną hodowlę rozlać, po 1 ml, do trzech probówek. Następnie do jednej
z probówek hodowli dodać 100 µg aktynomycyny D, do drugiej 100 µg ryfampicyny,
21
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
a trzecią pozostawić jako kontrolę. Zawartość probówek dokładnie wymieszać
i inkubować w temp. 300C przez 15 min.
4. Do wszystkich probówek dodać znakowanÄ… trytem urydynÄ™ w iloÅ›ci 10 µCi/ml
i wymieszać. BezpoÅ›rednio po dodaniu urydyny z probówek pobrać po 50 µl hodowli
i nanieść na przygotowane wcześniej krążki bibuły Whatman 3MM moczone
w roztworze nie znakowanej urydyny (czas 0). Identyczne próbki hodowli pobierać
po 15, 30, 45 i 60 minutach inkubacji.
5. Krążki wysuszyć pod lampą, przenieść do 10% TCA (ok. 200 ml) i pozostawić przy
stałym mieszaniu na 15 min.
6. Przenieść krążki do naczynia z 5% TCA (ok. 200 ml) i ponownie mieszać przez
10 min, po czym wysuszyć pod lampą.
7. Suche krążki umieścić w naczynkach scyntylacyjnych zawierających po 5 ml płynu
scyntylacyjnego i liczyć radioaktywne piętno pochodzące od wbudowanej do RNA
[3H]-urydyny przy użyciu licznika scyntylacyjnego.
8. Identyczne doświadczenie wykonać z bakteriami E. coli, zachowując temperaturę
inkubacji 370C.
Interpretacja wyników
1. Porównać poziom inkorporacji [3H]-urydyny w hodowli bakteryjnej i drożdżowej
w zależności od czasu inkubacji i obecności antybiotyków. Wyniki przedstawić
w formie wykresu, odkładając na osi X czas inkubacji, a na osi Y poziom
inkorporacji [3H]-urydyny (w imp/min.)
22
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Izolacja RNA z komórek drożdży
Uzyskanie wysokiej jakości RNA jest pierwszym i często krytycznym etapem wielu
zasadniczych eksperymentów w biologii molekularnej m. in. analizy  Northern , RT-PCR,
badaniu ochrony przed nukleazami, translacji in vitro, mapowania RNA, konstrukcji bibliotek
cDNA. W izolacji RNA duże znaczenie ma szybkość przeprowadzania procedury
oczyszczania i kontrolowanie aktywności rybonukleaz komórkowych, które mogą
doprowadzić do szybkiej degradacji RNA. Dlatego też podczas izolacji RNA wszystkie
odczynniki należy przygotowywać z użyciem wody traktowanej 0,1% pirowęglanem dietylu
(DEPC), który jest silnym inhibitorem RNaz, ponadto trzeba stosować jednorazowy sterylny
sprzęt laboratoryjny wykonany z tworzyw sztucznych, który jest wolny od RNaz, a sprzęt
wielokrotnego użytku umieszczać w 3% roztworze H2O2, po czym przepłukać wodą
traktowanÄ… DEPC.
Opracowano szereg metod pozwalajÄ…cych na wyizolowanie czystych
i niezdegradowanych preparatów kwasów nukleinowych o pełnej aktywności biologicznej.
Jedną z nich jest ekstrakcja fenolowa. W podanej procedurze, całe nienaruszone komórki
drożdży poddawane są ekstrakcji fenolowej podczas, której RNA  przechodzi do tzw. fazy
wodnej. DNA jako substancja wielkocząsteczkowa pozostaje w fazie fenolowej, w której
obok DNA znajdują się inne składniki komórkowe stanowiące razem nierozpuszczalną
frakcję komórkową.
Materiały i odczynniki
Uwaga! Wszystkie roztwory należy przygotować z użyciem wody traktowanej DEPC.
1. Hodowla S. cerevisiae OD600 = 2 (100 ml)
2. H2O (DEPC, oziębiona)
3. Bufor do zawieszania komórek drożdży ( bufor AE):
50mM CH3COONa, pH 5,3
10 mM EDTA
4. 10% SDS
5. Kwaśny fenol (stały fenol nasycony wodą a następnie buforem AE )
z 0,1% hydroksychinoliną. Przechowywać w ciemności w 40C.
6. Mieszanina chloroform  alkohol izoamylowy (24:1)
7. 3 M CH3COONa, pH 5,3
23
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
8. 100% etanol (oziębiony)
9. 70% etanol (oziębiony)
10. 2M LiCl  0,1M CH3COONa, pH 5,3
11. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych.
1. Hodowlę drożdży odwirować w probówkach Eppendorfa o poj. 2 ml przez 5 min. przy
1500 rpm w 40C tak, aby w każdej probówce otrzymać osad komórek drożdży
pochodzący z 4 ml hodowli. Supernatant odrzucić, a osad komórek drożdży zawiesić
w 1 ml oziębionej H2O, po czym odwirować przez 5 min. przy 1500 rpm w 40C (na
tym etapie osad komórek drożdży można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać
w  800C). Na wykonanie poniższej procedury potrzebny jest osad komórek
drożdży w dwóch probówkach.
2. Osad komórek drożdży w każdej probówce zawiesić w 400 źl buforu AE, dodać po
40 źl 10% SDS i wytrząsać przez 1 min.
3. Dodać do każdej probówki po 440 źl kwaśnego fenolu i wytrząsać całość przez 5 min.
po czym inkubować przez 15 min. w 650C (wytrząsając co 5 min.).
4. Po inkubacji probówki oziębić przez 5 min. w lodzie, a następnie odwirować przez
5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy
10000 rpm w 40C) w celu rozdzielenia faz.
5. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml,
ponownie dodać po 400 źl kwaśnego fenolu i wytrząsać przez 5 min. po czym
odwirować przez 5 min.
6. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, dodać po
400 źl mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy (usuwanie resztek fenolu)
i wytrząsać przez 5 min. a potem odwirować przez 5 min.
7. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa o poj. 1,5 ml, dodać po
40 źl 3M octanu sodu, pH 5,3 oraz 1 ml oziębionego 100% etanolu.
8. Próbki pozostawić w temp.  200C na 30 min. lub na noc w celu precypitacji RNA.
Następnie precypitat RNA odwirować przez 15 min. Uzyskany osad przemyć 1 ml
oziębionego 70% etanolu i powtórnie odwirować przez 5 min.
24
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
9. Osad z jednej probówki wysuszyć na powietrzu (kilka minut do odparowania etanolu,
nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia osadu) a następnie rozpuścić w 20 źl
wody i pozostawić w temp.  700C do analizy elektroforetycznej (surowy preparat
RNA).
10. Osad z drugiej probówki rozpuścić w 1 ml roztworu 2M chlorku litu z 0,1M octanem
sodu o pH 5,3 i mieszać przez 15 min.
11. Odwirować próbkę przez 15 min. i delikatnie usunąć, przy pomocy pipety,
supernatant. Uzyskany po wirowaniu osad to rRNA, który należy wysuszyć,
a następnie zawiesić w 20 źl wody i pozostawić w temp.  700C do analizy
elektroforetycznej.
Elektroforetyczna analiza RNA
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach
preparatów RNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz strona 70)
2. Preparaty RNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotować 100 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu na stronie 70.
Do próbek RNA zawieszonych w wodzie dodać równą objętość buforu próbkowego do
elektroforezy RNA. Na żel nanosić po 5-30 źl próbek RNA. Rozdział prowadzić przy
napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej
elektroforezie obserwować rozdzielone RNA pod lampą UV.
Interpretacja wyników
1. Porównać skład preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe rozdzielonych cząsteczek RNA.
25
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Translacja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych
Zdolność precyzyjnej translacji mRNA na białko jest jedną z podstawowych cech
życia na Ziemi. Chociaż aparat translacyjny wykazuje znaczne podobieństwa między
organizmami to jednak w toku ewolucji wykształciły się subtelne różnice w mechanizmie
biosyntezy białka u prokariontów i eukariontów. Te różnice wykorzystano w medycynie,
gdyż wiele związków selektywnie hamujących proces translacji u bakterii należy do
najbardziej skutecznych antybiotyków stosowanych przez człowieka.
Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu chloramfenikolu, cykloheksimidu
i puromycyny na biosyntezę białka w warunkach in vivo w komórkach bakterii E. coli
i drożdży S. cerevisiae. Chloramfenikol i cykloheksimid są inhibitorami aktywności
peptydylotransferazy, odpowiednio rybosomów bakteryjnych i eukariotycznych, zaś
puromycyna jest strukturalnym analogiem aminoacylo-tRNA i powoduje przedwczesnÄ…
terminację syntezy białka.
Materiały i odczynniki
1. 18 godzinna hodowla bakterii E. coli w podłożu M9 (20 ml)
2. 18 godzinna hodowla drożdży S. cerevisiae w podłożu SD (20 ml)
3. Podłoże M9 i SD
4. Chloramfenikol (10 mg/ml w 96% etanolu)
5. Cykloheksimid (10 mg/ml w H2O)
6. Puromycyna (10 mg/ml w H2O)
7. [35S]-metionina
8. Wysuszone krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 2,0 cm, moczone uprzednio
przez dobÄ™ w roztworze 0,5M NaCl z dodatkiem 1 mg/ml nie znakowanej metioniny
9. TCA 5% i 10%
10. PÅ‚yn scyntylacyjny
Wykonanie ćwiczenia
1. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm
(OD600). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (pożywka SD). Jeśli zaistnieje
konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
26
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną
hodowli drożdży, przygotować 5 ml hodowli rozcieńczonej pożywką SD,
do OD600 = 0,4.
2. Tak przygotowaną hodowlę rozlać, po 1 ml, do czterech probówek. Następnie do
jednej z probówek hodowli dodać 200 µg cykloheksimidu, do drugiej 200 µg
puromycyny, do trzeciej 200 µg chloramfenikolu, a czwartÄ… pozostawić jako kontrolÄ™.
Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 300C przez
20 min.
3. Do wszystkich probówek dodać znakowanÄ… metioninÄ™ w iloÅ›ci 10 µCi/ml
i wymieszać. BezpoÅ›rednio po dodaniu metioniny z probówek pobrać po 50 µl
hodowli i nanieść na przygotowane wcześniej krążki bibuły Whatman 3MM moczone
w roztworze metioniny (czas 0). Identyczne próbki hodowli pobierać po 15, 30, 45
i 60 min. inkubacji.
4. Krążki wysuszyć pod lampą, przenieść do 10% TCA (ok. 200 ml) i ogrzewać w temp.
850C przez 20 min.
5. Przenieść krążki do naczynia z 5% TCA (ok. 200 ml) i mieszać przez 15 min, po czym
wysuszyć pod lampą.
6. Suche krążki umieścić w naczynkach scyntylacyjnych zawierających po 5 ml płynu
scyntylacyjnego i liczyć radioaktywne piętno pochodzące od wbudowanej do białek
[35S]-metioniny przy użyciu licznika scyntylacyjnego.
7. Identyczne doświadczenie wykonać z bakteriami E. coli, zachowując temperaturę
inkubacji 370C.
Interpretacja wyników
1. Porównać poziom inkorporacji [35S]-metioniny w hodowli bakteryjnej i drożdżowej
w zależności od czasu inkubacji i obecności antybiotyków. Wyniki przedstawić
w formie wykresu, odkładając na osi X czas inkubacji, a na osi Y poziom
inkorporacji [35S]-metioniny (w imp/min.)
27
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek
drożdżowych
Rybosom jest miejscem działania wielu chemicznie zróżnicowanych antybiotyków,
które wiążą się ze specyficznymi fragmentami tego rybonukleoproteinowego kompleksu,
wpływając w ten sposób na syntezę białka i wzrost komórek. Mutacje w niektórych białkach
rybosomowych mogą powodować zmianę wrażliwości komórek na inhibitory translacji.
Celem ćwiczenia jest przebadanie wpływu cykloheksimidu, anizomycyny,
higromycyny B i paromomycyny na wzrost komórek mutantów drożdżowych pozbawionych
różnych białek rybosomowych.
Anizomycyna i cykloheksimid są inhibitorami aktywności peptydylotransferazy
w podjednostce 60S rybosomów eukariotycznych. Z kolei higromycyna B i paromomycyna
należą do antybiotyków aminoglikozydowych, działających zarówno na komórki bakteryjne
jak i eukariotyczne, które wiążą się z rRNA małej podjednostki rybosomowej. Poprzez
oddziaływanie z miejscem A na rybosomie aminoglikozydy zwiększają częstotliwość błędów
w odczytywaniu mRNA. Ponadto higromycyna B hamuje etap translokacji podczas
biosyntezy białka.
Materiały i odczynniki
1. Całonocne hodowle drożdży S. cerevisiae  po 20 ml
(cztery szczepy wskazane przez prowadzącego ćwiczenia)
2. Podłoże YPD oraz YPD z 2% agarem
3. Roztwór higromycyny B (15 mg/ml w H2O)
4. Roztwór paromomycyny (250 mg/ml w H2O)
5. Roztwór anizomycyny (3 mg/ml w roztworze wodnym o pH d" 5)
6. Roztwór cykloheksimidu (0,25 mg/ml w H2O)
7. Jałowe płytki Petriego
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml i końcówki do pipet
9. Jałowe krążki bibuły Whatman 3MM o średnicy 6 mm i pęsety.
28
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych
1. Na cztery jałowe płytki Petriego wylać po 20 ml podłoża YPD z agarem i pozostawić
do zastygnięcia.
2. Zmierzyć gęstość optyczną całonocnych hodowli drożdży przy długości fali 600 nm
(OD600). Pomiar wykonać względem próby kontrolnej (podłoże YPD). Jeśli zaistnieje
konieczność, (tzn. wielkość OD przekracza 1), należy próbkę hodowli rozcieńczyć,
a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jej gęstości. Znając gęstość optyczną
hodowli drożdży przygotować 1 ml hodowli rozcieńczonej pożywką YPD,
do OD600 = 1,0.
3. Rozprowadzić po 100 źl tak rozcieńczonych hodowli na przygotowane wcześniej
płytki Petriego ze stałym podłożem YPD.
4. Na płytki nanieść po cztery jałowe krążki bibuły Whatman 3MM i nakroplić na nie
po 10 źl roztworów paromomycyny, higromycyny B, anizomycyny i cykloheksimidu.
Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 300C zmierzyć średnice stref
zahamowania wzrostu komórek drożdży wokół krążków bibuły nasączonych
roztworami antybiotyków.
Interpretacja wyników
Porównać wpływ antybiotyków na wzrost poszczególnych szczepów drożdżowych
29
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej drożdży
Saccharomyces cerevisiae
Frakcjonowanie komórek to metoda rozdzielania struktur subkomórkowych
polegająca na wstępnej dezintegracji oraz poddaniu homogenatu wirowaniu różnicowemu
(kilkukrotnemu wirowaniu ze stopniowo wzrastającą siłą odśrodkową) albo wirowaniu
w gradiencie sacharozy czy chlorku cezu (poszczególne struktury subkomórkowe osadzają się
w roztworze o różnej gęstości).
Celem ćwiczenia jest izolacja mikrosomów i frakcji cytoplazmatycznej oraz
oczyszczenie rybosomów z drożdży S. cerevisiae techniką wirowania różnicowego.
Mikrosomy są pęcherzykami, powstającymi z samozasklepiających się fragmentów gładkiego
lub szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W celu uwolnienia rybosomów od błon
retikulum endoplazmatycznego stosuje siÄ™ bufor z dodatkem 1% niejonowego detergentu
jakim jest Triton X-100. Tak traktowane rybosomy (tzw. rybosomy surowe) zawierajÄ…
zasocjowane z nimi białka cytoplazmatyczne, które można usunąć z powierzchni rybosomów
za pomocą zbuforowanych roztworów o wysokim stężeniu soli.
Materiały i odczynniki
1. Osad zamrożonych komórek drożdży S. cerevisiae
2. Korund
3. 2 M Tris
4. 10% roztwór Tritonu X-100 w buforze A
5. Bufor A (do dezintegracji)
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
80 mM KCl
12,5 mM MgCl2
0,5 mM EDTA
1 mM PMSF
6 mM ²- MET
6. Bufor B (do zawieszania rybosomów)
50% glicerol
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
80 mM KCl
30
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
10 mM MgCl2
0,5 mM EDTA
5 mM DTT
7. Bufor A z dodatkiem 0,5 M KCl
8. 30% sacharoza w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl
9. Stały siarczan amonu
10. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)
50 mM Tris  HCl, pH 7,5
0,5 mM EDTA
6 mM ²- MET
0,5 mM PMSF
11. Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu
12. Wąż dializacyjny
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. 40C
Dezintegracja komórek drożdży i otrzymywanie ekstraktu bezkomórkowego
1. Komórki drożdżowe dezintegrować, ucierając je z korundem w moz
dzierzu
porcelanowym przez około 30 min. Korund dodawać stopniowo w ilości wagowej
3 -krotnie większej od masy komórek. Podczas dezintegracji utrzymywać wartość pH
w zakresie 7,2  7,5 poprzez dodawanie 2 M Trisu (niebuforowanego).
2. Uzyskany dezintegrat drożdży zawiesić w buforze A i wirować przy 3000 rpm przez
10 min. celem osadzenia korundu i resztek komórek.
3. Uzyskany supernatant wirować przy 30000 x g w ciągu 20 min. aby osadzić struktury
subkomórkowe (mitochondria, jądra, ściany komórkowe).
4. Tak otrzymany ekstrakt komórkowy (tzw. frakcja S30) podzielić na dwie części. Do
jednej części, przy stałym mieszaniu, dodać 10% Tritonu X-100 tak, aby jego
końcowe stężenie wynosiło 1%, po czym ekstrakt mieszać jeszcze przez 15 min.
Drugą część ekstraktu przechowywać w tym czasie w temp. 40C.
5. Obie części wirować przy 100000 x g przez 1,5 godz. W wyniku wirowania otrzymuje
siÄ™ frakcjÄ™ cytoplazmatycznÄ…, tzw. frakcjÄ™ S100 i frakcjÄ™ mikrosomalnÄ…
31
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
(z części nietraktowanej Tritonem X-100) oraz rybosomy surowe (z części
traktowanej Tritonem X-100).
6. Osad stanowiący frakcję mikrosomalną oraz połowę osadu rybosomów surowych
zawiesić w buforze B (za pomocą homogenizatora szklano-teflonoego), oznaczyć
stężenie rybosomów (przepis - strona 83) i przechowywać do kolejnych ćwiczeń
w temp.  200 C.
Oczyszczanie rybosomów
1. Pozostałą część osadu rybosomów surowych zawiesić w buforze A z dodatkiem 0,5 M
KCl i mieszać w homogenizatorze szklanym przez 15 min. i ponownie osadzić przez
wirowanie przy 100000 x g przez 1,5 godz. Czynność tę wykonać dwukrotnie.
2. Uzyskany preparat rybosomów ponownie zawiesić w buforze A z 0,5 M KCl
i wirować przez 1cm warstwę zbuforowanego roztworu sacharozy (30% sacharoza
w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl) przy 100000 x g przez 3 godz. Po osadzeniu,
rybosomy zawiesić w buforze B, oznaczyć ich stężenie (przepis - strona 83)
i przechowywać do kolejnych ćwiczeń w temp.  200 C.
Wysalanie białek z frakcji cytoplazmatycznej
1. Białka z frakcji cytoplazmatycznej wytrącać stałym siarczanem amonu przy
wysyceniu 0-55% (tabela frakcjonowania siarczanem amonu  strona 86). Siarczan
amonu dodawać stopniowo mieszając przez 1 godzinę. Zawiesinę odwirować przy
12000 rpm przez 20 min.
2. Osad wytrąconych białek rozpuścić w buforze C i poddać dializie (przepis  strona 84)
wobec buforu C z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór białek
cytoplazmatycznych przechowywać w temp.  200 C.
32
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży
Większość białek rybosomowych stanowią małe białka o charakterze zasadowym,
których punkt izoelektryczny oscyluje w pobliżu pH 8,5 lub wyższym. Duża podjednostka
rybosomów zawiera jednak grupę powierzchniowych białek kwaśnych, tworzących
charakterystyczną strukturę zwaną  kciukiem , który oddziałuje z czynnikami translacyjnymi
podczas syntezy białka. U bakterii kwaśne białka rybosomowe tworzą pentameryczny lub
heptameryczny kompleks, złożony, odpowiednio, z dwóch lub trzech dimerów białka L12
oraz pojedynczej cząsteczki białka L10. U Escherichia coli białko L12 nazywane jest L7/L12.
Różnica między L7 i L12 polega na potranslacyjnej acetylacji na N-końcu polipeptydu L7.
Białko L7/L12 E. coli złożone ze 120 aminokwasów i posiada masę cząsteczkową 12,2 kDa.
Eukariotyczne białka kwaśne noszą nazwę białek P, ze względu na ich fosforylacyjną
modyfikację. Białka te podzielono na dwie grupy. Jedną z nich stanowią dwa małe białka P1
i P2 o masie 11 kDa i pI równym 3,0-3,5, będące funkcjonalnymi odpowiednikami
bakteryjnego białka L12. U niższych eukariontów takich jak drożdże stwierdzono obecność
czterech białek P1/P2. Kwaśne białka drożdży S. cerevisiae nazwano P1A, P1B, P2A i P2B.
Ponadto u roślin zidentyfikowano dodatkowo białko P3. Drugą grupę białek P stanowi
pojedyncze białko P0 o masie ok. 34 kDa, będące odpowiednikiem bakteryjnego białka L10.
Na rybosomie białka P tworzą pentameryczny kompleks P0-(P1-P2)2, który wiąże się,
poprzez N-końcowy fragment białka P0, do wysoce konserwatywnego regionu 25S/28S
rRNA, zwanego centrum GTPazowym. U S. cerevisiae białka z grupy P1/P2 tworzą
preferencyjnie dwa heterodimery P1A-P2B i P1B-P2A w których N-końcowe fragmenty
białek są odpowiedzialne za dimeryzację i interakcje z białkiem P0, zaś karboksylowe końce
są wolne i oddziałują z czynnikami translacyjnymi takimi jak EF-2.
Białka z grupy P1/P2 nie są niezbędne dla aktywności translacyjnej rybosomu,
natomiast białko P0 jest stabilnym białkiem rdzenia rybosomowego i jest konieczne dla jego
funkcjonowania. Delecja genu dla P0 prowadzi do śmierci komórki. Wszystkie białka P
charakteryzują się niezwykle konserwatywną C-końcową domeną, zawierającą resztę seryny
ulegającą fosforylacyjnej modyfikacji oraz stanowiącą antygen, przeciwko któremu
skierowane są przeciwciała u ludzi cierpiących na niektóre choroby autoimmunologiczne
(układowy toczeń trzewny) i infekcyjne (choroba serca Chagasa, leiszmanioza).
W odróżnieniu od pozostałych składników rybosomu kwaśne białka rybosomowe,
zarówno bakteryjne jak i eukariotyczne, występują w postaci wolnej w cytoplazmie.
33
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
U organizmów eukariotycznych, w przeciwieństwie do bakterii, odbywa się ponadto wymiana
tych białek między rybosomem a pulą cytoplazmatyczną.
Materiały i odczynniki
1. Oczyszczone rybosomy drożdżowe o stężeniu 20 mg/ml
2. Bufor do ekstrakcji kwaśnych białek rybosomowych
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
40 mM MgCl2
6 mM ²- MET
1 M NH4Cl
3. 96% etanol (oziębiony)
4. Aceton (oziębiony)
5. 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
6. Odczynnik Bradford
Wykonanie ćwiczenia
1. Kwaśne białka rybosomowe ekstrahować z 2 mg rybosomów oczyszczonych
S. cerevisiae o stężeniu 20 mg/ml. Do zawiesiny rybosomów (1 objętość) dodać 1
objętość buforu do ekstrakcji białek kwaśnych i pozostawić na 5 min. w lodzie.
2. Dodać 1 objętość 96% etanolu (oziębionego) i pozostawić na 10 min. w lodzie.
3. Powtórzyć punkt 2.
4. Odwirować przy 10000 rpm przez 15 min. w celu osadzenia cząstek rdzeniowych
rybosomów ( tj. rybosomów zawierających białka, które nie zostały wyekstrahowane).
5. Supernatant zawierający kwaśne białka rybosomowe przenieść do nowej probówki
Eppendorfa, dodać trzykrotną objętość oziębionego acetonu (w celu wytrącenia białek
z supernatantu) i pozostawić w temp.  200 C przez co najmniej 24 godz.
6. Wytrącone białka osadzić drogą wirowania przy 10000 rpm przez 15 min., po czym
supernatant odrzucić, a osad kwaśnych białek rybosomowych wysuszyć na powietrzu
i zawiesić w 50 µl 25 mM Trisu  HCl, pH 7,5.
7. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis  strona 80)
34
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Analiza elektroforetyczna białek rybosomowych
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek rybosomowych techniką elektroforezy
jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE
(metoda Laemmli ego).
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona 74)
2. Preparaty mikrosomów, rybosomów surowych i oczyszczonych oraz białek P
otrzymane na poprzednich ćwiczeniach
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących według przepisu na stronie 74.
2. Przygotować po dwie próbki zawierające: a) 50 źg mikrosomów, b) 50 źg rybosomów
surowych, c) 50 źg rybosomów oczyszczonych, d) 10-20 źg białek P, e) wzorce
białkowe, według przepisu na stronie 74.
3. Próbki białkowe zawieszone w buforze próbkowym SDS/PAGE nanieść na żel
poliakrylamidowy. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale, żel poliakrylamidowy
przeciąć na pół. Jedną część żelu wybarwić błękitem Coomassie (przepis strona 76),
a drugÄ… srebrem (przepis strona 77).
Interpretacja wyników
1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe białek P.
3. Porównać czułość obu metod barwienia białek w żelu poliakrylamidowym.
35
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae
Kinazy białkowe uczestniczą w regulacji wielu procesów metabolicznych, biorą udział
w transmisji sygnałów przez błony, regulują procesy wzrostu i różnicowania się komórek.
Oczyszczanie enzymów jest stosowane w badaniach ich struktury i funkcji. W tym
celu stosuje siÄ™ metody chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa
i sączenia molekularnego, w których wykorzystuje się takie cechy białek enzymatycznych
jak: wielkość, ładunek, powinowactwo wiązania do nośników. Poniżej podana jest jedna z
metod oczyszczania białek przez rozdział w procesie chromatografii jonowymiennej (ang. ion
exchange chromatography  IEC). Rozdział białek w technice IEC polega na odwracalnej
adsorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym makromolekuł na nośniku jonowymiennym
(jonowymieniaczu). Jonowymieniacz to złoże chromatograficzne z unieruchomionymi na
powierzchni polarnymi cząsteczkami posiadającymi ładunek elektryczny określonego znaku.
W zależności od tego jakie jony wiąże jonowymieniacz, mówimy o anionowymieniaczu
(anionicie)  wiążącym aniony lub o kationowymieniaczu (kationicie)  wiążącym kationy.
Celem ćwiczenia jest oczyszczenie kinaz białkowych PKA i CK2 z frakcji
cytoplazmatycznej komórek drożdży na DEAE-celulozie (anionit) i P-11 celulozie (kationit).
Materiały i odczynniki
1. Supernatant postrybosomalny z drożdży S. cerevisiae
2. DEAE-celuloza (DE-52) i P-11 celuloza wyrównoważone w buforze do preparatyki
kinaz białkowych
3. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)
4. 0,2 M NaCl w buforze C
5. 0,4 M NaCl w buforze C
6. 0,7 M NaCl w buforze C
7. Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu
8. Wąż dializacyjny
Wykonanie ćwiczenia
Chromatografia na DEAE-celulozie
1. Do 5 ml celulozy dodać odpowiednią ilość wysolonej na wcześniejszych ćwiczeniach
frakcji cytoplazmatycznej, przyjmując, że 1 ml DE-52 wiąże 5 mg białka.
36
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
2. Delikatnie mieszać przez 10 min., a następnie dodać 5 ml buforu C, zamieszać,
odwirować (jeśli nie zaznaczono inaczej wszystkie wirowania wykonywać przy
3000 rpm przez 5 min. w 40C) i zebrać supernatant (frakcja 1  zawierająca białka
niewiążące się do DE-52),
3. Do DE-52 dodać 50 ml 0,2 M NaCl w buforze C, zamieszać, odwirować i odrzucić
supernatant.
4. Powtórzyć pkt 3.
5. Do DE-52 dodać 5 ml 0,4 M NaCl (w celu elucji białek związanych z DE-52), mieszać
przez 10 min. i po odwirowaniu zebrać supernatant (frakcja 2).
Oczyszczanie PKA na P-11 celulozie
1. Supernatant zawierający białka niewiążące się do DE-52 (frakcja 1) dodać do 5 ml P-
11 celulozy, delikatnie mieszać przez 10 min. po czym odwirować i supernatant
odrzucić.
2. Do P-11 celulozy dodać 50 ml buforu C, zamieszać, odwirować i odrzucić
supernatant.
3. Powtórzyć pkt 2.
4. Następnie do P-11 celulozy dodać 5 ml 0,2 M NaCl w buforze C, mieszać przez 10
min. po czym odwirować i zebrać supernatant zawierający aktywność kinazy
białkowej A.
5. Zebrany supernatant poddać dializie (przepis  strona 84) wobec buforu C
z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór przechowywać w temp.
 200 C.
Oczyszczanie CK2 na P-11 celulozie
1. Supernatant ulegający elucji przy 0,4 M NaCl (frakcja 2) rozcieńczyć dwukrotnie
buforem C i dodać do 5 ml P-11 celulozy, delikatnie mieszać przez 10 min. po czym
odwirować i supernatant odrzucić.
2. Do P-11 celulozy dodać 50 ml 0,2 M NaCl w buforze C, zamieszać, odwirować
i odrzucić supernatant.
3. Powtórzyć pkt 2.
37
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
4. Następnie do P-11 celulozy dodać 5 ml 0,7 M NaCl w buforze C, mieszać przez 10
min. po czym odwirować i zebrać supernatant zawierający aktywność kinazy
białkowej CKII.
5. Zebrany supernatant poddać dializie (przepis  strona 84) wobec buforu C
z dodatkiem 50% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór przechowywać
w temp.  200 C.
Lokalizacja i regulacja aktywności kinazy białkowej CK2
Kinaza białkowa CK2 (dawniej nazywana kinazą kazeinową II) jest tradycyjnie
klasyfikowana jako kinaza serynowo-treoninowa, niezależna od wtórnych przekaz
ników.
Niemniej pojawiły się doniesienia o zdolności CK2 do fosforylacji białek w resztach
tyrozynowych. Wykazano m.in., że jądrowe białko immunofilina FPR3 u drożdży
Saccharomyces cerevisiae jest fosforylowane w reszcie tyrozyny w pozycji 183 przez CK2,
co czyni ją kinazą o podwójnej specyficzności. Lista przypuszczalnych fizjologicznych
substratów tego enzymu zawiera ponad 300 białek, wśród których znajdują się syntaza
glikogenu, receptor insuliny, białka c-Myc i c-Myb czy topoizomerazy DNA I i II. Kinaza
białkowa CK2 jest szeroko rozpowszechniona w organizmach eukariotycznych. W
większości z nich występuje jako tetrameryczny kompleks składający się z dwóch
podjednostek katalitycznych (Ä… i/lub Ä… ) i dwóch podjednostek regulatorowych ².
W fosforylowanym białku CK2 rozpoznaje resztę seryny lub treoniny w sekwencji Ser/Thr 
X  X - Asp/Glu/pSer/pThr/pTyr, gdzie X oznacza dowolny aminokwas.
Celem ćwiczenia jest wykazanie obecności CK2 w formie zasocjowanej
z rybosomami i wolnej w cytoplazmie komórki drożdżowej oraz określenie specyficzności
substratowej i wpływu efektorów na aktywność tej kinazy.
Materiały i odczynniki
1. Preparat enzymatyczny kinazy CK2 po oczyszczeniu na DE-52 celulozie i P-celulozie
2. Frakcja mikrosomalna i rybosomy surowe o stężeniu 15 mg/ml
3. Bufor do oznaczania aktywności kinaz  10 x stężony:
200 mM Tris-HCl, pH 7,5
150 mM MgCl2
60 mM ²-MET
38
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
4. Substraty dla kinaz białkowych  10 x stężone:
fosfityna (30 mg/ml)
kazeina defosforylowana (30 mg/ml)
histon IIA (3 mg/ml)
protamina (3 mg/ml)
rybosomalne białka P (3 mg/ml)
5. 0,5 mM polilizyna
6. Heparyna  50 µg/ml
7. 2 mM spermina
8. 3 mM GTP
9. [Å‚32P]ATP
10. Kwas octowy 30% i 15%
11. Kwas trójchlorooctowy 10% i 5%
12. Krążki z bibuły szklanej i P-81
13. PÅ‚yn scyntylacyjny
14. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona 74)
Wykonanie ćwiczenia
Ustalenie optymalnej ilości enzymu
Optymalną dla przebiegu reakcji ilość enzymu ustalić badając aktywność kinazy
białkowej CK2 wobec kazeiny jako substratu. Mieszanina reakcyjna w końcowej objętości 50
µl zawiera:
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
15 mM MgCl2
6 mM ²-MET
30µM [Å‚32P] ATP
150 µg kazeiny
2 - 10 µl frakcji enzymatycznej
39
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2 3 4 5 6
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz 5 5 5 5 5 5
Kazeina - 5 - 5 - 5
[Å‚32P] ATP 5 5 5 5 5 5
Frakcja enzymatyczna - 2 - 5 - 10
InkubacjÄ™ prowadzić 20 min. w temp. 300C. ReakcjÄ™ zatrzymać przez dodanie 100 µl
10% TCA w celu precypitacji białek a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej,
przemywając dwa razy po 5 ml roztworu 5% TCA. Krążki wysuszyć i umieścić w płynie
scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.
Określenie specyficzności substratowej kinazy białkowej CK2
Zbadać aktywność kinazy białkowej CK2, uwzględniając optymalną ilość enzymu, z
wykorzystaniem poniżej podanych substratów. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać
według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.
Lp. Substrat Wyjściowe stężenie substratu Końcowe stężenie substratu
(w mieszaninie inkubacyjnej)
1. fosfityna 30 mg/ml 3 mg/ml
2. kazeina 30 mg/ml 3 mg/ml
3. histon IIA 3 mg/ml 0,3 mg/ml
4. protamina 3 mg/ml 0,3 mg/ml
5. rybosomalne białka P 3 mg/ml 0,3 mg/ml
Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 300C. Reakcję w probówkach zawierających
fosfitynÄ™, kazeinÄ™ i rybosomalne biaÅ‚ka P zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA,
a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając dwa razy po 5 ml 5%
roztworem TCA po czym wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć
radioaktywność. W przypadku próbek zawierających protaminę i histon IIA bezpośrednio po
40
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuÅ‚y P-81. Krążki pÅ‚ukać
przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym a następnie wysuszyć i umieścić
w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.
Badanie wpływu efektorów na aktywność CK2
Zbadać wpływ polilizyny i heparyny na aktywność kinazy białkowej CK2,
(uwzględniając optymalną ilość enzymu), wobec kazeiny jako substratu. Końcowe stężenie
polilizyny w mieszaninie inkubacyjnej powinno wynosić 0,05 mM, 0,1 mM i 0,2 mM, zaś
heparynÄ™ należy dodawać do koÅ„cowego stężenia równego 5 µg/ml oraz 10 µg/ml. SkÅ‚adniki
mieszaniny reakcyjnej dodawać i inkubację prowadzić według schematu podanego dla
ustalenia optymalnej ilości enzymu.
Lokalizacja CK2 w formie zasocjowanej z rybosomami
Występowanie kinazy CK2 w formie zasocjowanej z rybosomami można wykazać
inkubujÄ…c rybosomy ze z
ródłem reszty fosforanowej, np. [ł32P] ATP, w obecności efektorów
aktywności CK2, bez dodawania preparatu egzogennej kinazy.
Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2 3 4 5 6
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz 5 5 5 5 5 5
Mikrosomy 10 - - - - -
Rybosomy surowe - 10 10 10 10 10
Heparyna - - 5 10 - -
Spermina - - - - 5 -
GTP - - - - - 5
[Å‚32P] ATP 10 10 10 10 10 10
1. Mieszaninę inkubować 30 min. w temp. 300C, po czym dodać 20 źl buforu
próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
w celu zatrzymania reakcji.
41
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
2. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS-PAGE) według przepisu na stronie 74.
3. Próbki zawieszone w buforze próbkowym ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze
900C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po 20 źl przygotowanych próbek.
Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca
żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz strona 76),
wysuszyć, a następnie poddać autoradiografii.
Interpretacja wyników
1. Określić jakie substraty są fosforylowane przez kinazę białkową CK2.
2. Porównać wpływ poszczególnych efektorów na aktywność kinazy CK2.
3. Porównać poziom fosforylacji mikrosomów i rybosomów surowych przez
kinazę białkową CK2 zasocjowaną z rybosomami.
Aktywacja i specyficzność substratowa kinazy zależnej od cAMP
Kinaza białkowa zależna od cAMP, zwana także kinazą A (PKA) należy do najlepiej
poznanych wielofunkcyjnych kinaz serynowo-treoninowych. Substratami dla tej kinazy sÄ…
m.in. białka histonowe, białko S6 podjednostki rybosomowej 40S, syntaza glikogenu. PKA
jest holoenzymem składającym się z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch
podjednostek katalitycznych (C). W obecności cAMP w komórce następuje aktywacja kinazy
w wyniku dysocjacji nieaktywnego holoenzymu na dimer podjednostek regulatorowych i dwa
aktywne monomery podjednostki katalitycznej według wzoru:
R2C2 + 4cAMP R2(cAMP)4 + 2C
W warunkach in vitro, aktywację kinazy A można przeprowadzić drogą kontrolowanej
proteolizy przy użyciu trypsyny, która odcina w podjednostce regulatorowej kinazy A
domenę wiążącą cykliczne nukleotydy, co prowadzi do aktywacji kinazy. Podjednostki
regulatorowe są istotne dla lokalizacji PKA w komórce. Przy udziale białek AKAP (ang. A-
kinase anchoring protein) wiążących się z jednej strony do podjednostek regulatorowych
PKA a z drugiej do białek cytoszkieletu czy membran organelli kinaza A jest kierowana do
określonych miejsc w komórce.
Celem ćwiczenia jest określenie specyficzności substratowej kinazy A oraz sposobów
jej aktywacji.
42
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Materiały i odczynniki
1. Preparat enzymatyczny kinazy A po oczyszczeniu na DE-52 celulozie i P-celulozie
2. Bufor do oznaczania aktywności kinaz  10 x stężony (skład str. 38)
3. Substraty dla kinaz białkowych  10 x stężone (patrz str. 39)
4. 20 µM cAMP
5. 20 µM cGMP
6. [Å‚32P]ATP
7. Bufor T  10 x stężony:
100 mM Tris-HCl pH 8,0
100 mM ²-MET
8. BSA 6 mg/ml
9. Trypsyna 40 µg/ml w 1 mM HCl
10. 1 mM HCl
11. Inhibitor trypsyny 0,4 mg/ml
12. Kwas octowy 30% i 15%
13. Kwas trójchlorooctowy 10% i 5%
14. Krążki z bibuły szklanej oraz P-81
15. PÅ‚yn scyntylacyjny
Wykonanie ćwiczenia
Ustalenie optymalnej ilości enzymu
Optymalną dla przebiegu reakcji ilość enzymu ustalić badając aktywność kinazy PKA
wobec protaminy jako substratu. Mieszanina reakcyjna w koÅ„cowej objÄ™toÅ›ci 50 µl zawiera:
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
15 mM MgCl2
6 mM ²-MET
30µM [Å‚32P] ATP
15 µg protaminy
2 µM cAMP
2 - 10 µl frakcji enzymatycznej
43
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać według kolejności przedstawionej
w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2 3 4 5 6
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor do oznaczania aktywności kinaz 5 5 5 5 5 5
Protamina - 5 - 5 - 5
cAMP - 5 - 5 - 5
[Å‚32P] ATP 5 5 5 5 5 5
Frakcja enzymatyczna - 2 - 5 - 10
InkubacjÄ™ prowadzić 20 min. w temp. 300C. BezpoÅ›rednio po inkubacji nanosić po 40 µl
mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuły P-81. Krążki płukać przez 10 min. kolejno w 30%
i 15% kwasie octowym a następnie wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć
radioaktywność.
Określenie specyficzności substratowej kinazy A
Zbadać aktywność kinazy A, uwzględniając optymalną ilość enzymu, z
wykorzystaniem poniżej podanych substratów. Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać
według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu (zamiast protaminy
dodawać podane poniżej substraty).
Lp. Substrat Wyjściowe stężenie substratu Końcowe stężenie substratu
(w mieszaninie inkubacyjnej)
1. fosfityna 30 mg/ml 3 mg/ml
2. kazeina 30 mg/ml 3 mg/ml
3. histon IIA 3 mg/ml 0,3 mg/ml
4. protamina 3 mg/ml 0,3 mg/ml
5. rybosomalne białka P 3 mg/ml 0,3 mg/ml
Inkubację prowadzić 20 min. w temp. 300C. W probówkach zawierających fosfitynę,
kazeinÄ™ i rybosomalne biaÅ‚ka P, reakcjÄ™ zatrzymać przez dodanie 100 µl 10% TCA,
a następnie przesączyć na filtrach z bibuły szklanej, przemywając, dwa razy po 5 ml,
5% roztworem TCA, po czym wysuszyć i umieścić w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć
44
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
radioaktywność. W przypadku próbek zawierających protaminę i histon IIA bezpośrednio po
inkubacji nanosić po 40 µl mieszaniny inkubacyjnej na krążki z bibuÅ‚y P-81. Krążki pÅ‚ukać
przez 10 min. kolejno w 30% i 15% kwasie octowym, a następnie wysuszyć i umieścić
w płynie scyntylacyjnym. Zliczyć radioaktywność.
Badanie wpływu cGMP na aktywność kinazy A
Zbadać wpływ cGMP na aktywność kinazy A (uwzględniając optymalną ilość
enzymu), wobec protaminy jako substratu. Końcowe stężenie cGMP w mieszaninie
inkubacyjnej powinno wynosić 2 µM i 4 µM. SkÅ‚adniki mieszaniny reakcyjnej dodawać,
a także inkubację prowadzić według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości
enzymu (zamiast cAMP dodawać cGMP).
Aktywacja kinazy A drogÄ… kontrolowanej proteolizy
Preparat kinazy A poddać inkubacji z trypsyną i bez trypsyny. Składniki mieszaniny
reakcyjnej dodawać wedÅ‚ug kolejnoÅ›ci przedstawionej w poniższej tabeli (w µl):
Probówka nr
Składniki mieszaniny reakcyjnej 1 2
H2O uzupeÅ‚nić do objÄ™toÅ›ci 50 µl
Bufor T  10x stężony 5 5
BSA  6 mg/ml 5 5
HCl  1 mM 5 -
Trypsyna  40 µg/ml - 5
Preparat kinazy A 20 20
InkubacjÄ™ prowadzić 15 min. w temp. 300C, po czym dodać 5 µl sojowego inhibitora
trypsyny w celu zatrzymania reakcji. Następnie w obu preparatach enzymatycznych
sprawdzić aktywność kinazy A wobec protaminy jako substratu w obecności cAMP i bez
cAMP według schematu podanego dla ustalenia optymalnej ilości enzymu.
Interpretacja wyników
1. Określić jakie substraty są fosforylowane przez kinazę A.
2. Wymienić sposoby aktywacji kinazy A.
45
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych
Proteazy (proteinazy, peptydazy) to duża grupa enzymów należących do klasy hydrolaz,
przeprowadzających hydrolizę wiązań peptydowych. Ze względu na mechanizm katalizy
proteazy podzielone zostały na następujące grupy:
" proteazy serynowe,
" proteazy treoninowe,
" proteazy cysteinowe,
" proteazy aspartylowe
" metaloproteazy
" proteazy glutamylowe
Niektóre proteazy odcinają końcowe aminokwasy od łańcucha peptydowego
(egzopeptydazy, np. aminopeptydaza N, karboksypeptydaza A), a inne hydrolizujÄ…
wewnętrzne wiązania peptydowe (endopeptydazy, np. trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna,
trombina). Proteazy występują w komórkach wszystkich organizmów. Aktywność proteaz jest
hamowana przez specyficzne inhibitory.
Ponad jedną trzecią wszystkich znanych enzymów proteolitycznych stanowią proteazy
serynowe. Są one zaangażowane w różnorodne reakcje w organizmie poczynając od prostego
trawienia białek w przewodzie pokarmowym po precyzyjnie regulowane kaskady np. kaskada
krzepnięcia krwi. Centrum aktywne wszystkich proteaz serynowych zawiera trzy, położone
blisko siebie, reszty aminokwasowe: histydynÄ™, serynÄ™ i kwas aspartylowy, tworzÄ…ce tzw.
triadę katalityczną biorącą bezpośredni udział w hydrolizie wiązania peptydowego.
Trombina ( EC 3.4.21.5) to enzym osocza należący do proteaz serynowych. Produkowana
jest z protrombiny osocza pod wpływem tromboplastyny i aktywatorów. Trombina umożliwia
powstanie nierozpuszczalnej fibryny z rozpuszczalnego fibrynogenu umożliwiając
krzepnięcie krwi. Trombina rozpoznaje sekwencję Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser i przecina
wiązanie peptydowe pomiędzy resztami Arg i Gly. Enzym wykazuje aktywność w pH 5,0-
10,0 (optimum to pH 8,3) i nie wymaga obecności dwuwartościowych jonów metali ani
kofaktorów.
W ćwiczeniu badane białko, zawierające sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez
trombinę, jest inkubowane z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz. Po zakończeniu
inkubacji przeprowadza się elektroforezę badanego białka w żelu poliakrylamidowym
w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w celu identyfikacji inhibitorów hamujących
aktywność proteolityczną trombiny.
46
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Materiały i odczynniki
1. Roztwór badanego białka w PBS (wg zaleceń prowadzącego ćwiczenia)
2. Trombina (2U/źl  bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć 50-krotnie w PBS)
3. EDTA (80 mM roztwór w H2O pH 8,0)
4. PMSF (16 mM roztwór w etanolu)
5. Pepstatyna A (16 źM roztwór w metanolu)
6. Bufor PBS:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4 pH 7,5
7. Odczynnik Bradford
8. Termoblok
9. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz strona 74)
Wykonanie ćwiczenia
1. Oznaczyć stężenie badanego białka metodą Bradford (przepis strona 80).
2. Badane białko poddać inkubacji z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz
według poniższego schematu (na podstawie podanych stężeń substancji używanych
w doświadczeniu, należy samodzielnie obliczyć objętość tych substancji, którą trzeba
dodać do probówki):
Uwaga! Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać wg przedstawionej kolejności
Składniki mieszaniny Probówka nr
reakcyjnej 1 2 3 4 5 6 7
PBS uzupełnić do objętości 40 źl
Trombina (0,04 U/ źl) 0,4 U - 0,08U 0,4 U 0,4 U 0,4 U 0,4 U
EDTA 80 mM - - - - 10 mM - -
PMSF 16 mM - - - - - 2 mM -
Pepstatyna A 16 źM - - - - - - 2 źM
Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować 10 min. w temperaturze pokojowej,
a następnie dodać badane białko
Badane białko - 10 źg 10 źg 10 źg 10 źg 10 źg 10 źg
47
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
3. Mieszaninę inkubować 30 min. w temp. 370C, po czym dodać 15 źl buforu
próbkowego do elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
w celu zatrzymania reakcji (jeśli zachodzi taka potrzeba, próbki można pozostawić do
kolejnych ćwiczeń w temperaturze -200C).
4. Przygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS-PAGE) według przepisu na stronie 74.
5. Próbki zawieszone w buforze próbkowym ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze
900C. Bezpośrednio po ogrzaniu nanosić na żel po 30 źl przygotowanych próbek.
Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca
żelu separującego. Po rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz strona
76).
Interpretacja wyników
Określić, które z badanych inhibitorów hamują aktywność proteolityczną trombiny.
48
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Identyfikacja inhibitora trypsyny metodÄ… elektroforezy
w warunkach niedenaturujÄ…cych
Elektroforeza w warunkach niedenaturujÄ…cych (PAGE) pozwala na analizÄ™
elektroforetyczną białek w formie natywnej i umożliwia identyfikację aktywności
badanych enzymów bądz
ich inhibitorów.
Celem ćwiczenia jest wykrycie specyficznego inhibitora trypsyny pochodzącego
z nasion soi. Trypsyna (EC 3.4.21.4) to enzym soku trzustkowego należący do grupy
proteaz serynowych. Trypsyna syntetyzowana jest w postaci nieaktywnego prekursora
(zymogenu) trypsynogenu. W dwunastnicy pod wpływem niewielkich nawet ilości innego
enzymu - enterokinazy dochodzi do aktywacji trypsynogenu. Dzięki autokatalitycznej
zdolności trypsyny szybko dochodzi do pełnego uczynnienia wydzielonego trypsynogenu.
Enzym ten hydrolizuje wiązania peptydowe, w których uczestniczą grupy karboksylowe
należące do lizyny lub argininy. W wyniku działania trypsyny powstają peptydy
zawierające na C-końcu resztę lizyny lub argininy. Optymalne pH dla aktywności
trypsyny wynosi 8,0. Aby zapobiec autolizie trypsynę należy przechowywać
w temperaturze poniżej -200C lub w pH równym 3,0. Aktywność trypsyny może zostać
zahamowana przez związanie specyficznego inhibitora. W poniższym ćwiczeniu inhibitor
trypsyny poddaje się elektroforezie w natywnym żelu poliakrylamidowym (PAGE)
zawierającym edestynę (białko z nasion konopi) będącą substratem dla trypsyny. Edestyna
nadaje żelowi mleczne zabarwienie. Po zakończeniu elektroforezy, żel inkubuje się
z roztworem trypsyny. W wyniku hydrolizy edestyny przez trypsynę w żelu powstają
przejaśnienia. Jedynie strefy żelu, w których zlokalizowany jest inhibitor trypsyny
pozostajÄ… mleczne.
Materiały i odczynniki
1. Edestyna (1 % roztwór w 0,05 M kwasie octowym)
2. Trypsyna ( 20 - 100 źg/ml w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0  przygotować bezpośrednio
przed użyciem)
3. Inhibitor trypsyny (0,25 mg/ml w H2O)
4. 30% sacharoza
5. 1% błękit bromofenolowy
6. 5% roztwór TCA
49
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
7. Odczynniki i zestaw do elektroforezy PAGE (patrz strona 72)
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
niedenaturujących (PAGE) zawierający edestynę, według przepisu na stronie 72.
2. Przygotować próbki zawierające różne ilości inhibitora trypsyny: 1,25 źg; 2,5 źg; 5 źg
i 7,5źg w objętości 30 źl.
3. Do każdej probówki zawierającej inhibitor trypsyny dodać po 10 źl 30% sacharozy
i 1 źl 1% błękitu bromofenolowego. Dokładnie wymieszać i nanieść do studzienek
w żelu zagęszczającym.
4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 120 V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego.
5. Po zakończeniu elektroforezy żel inkubować w temperaturze 370C w roztworze
trypsyny o stężeniu 20 - 100 źg/ml w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 do momentu
zaobserwowania przejaśnień w żelu. Reakcję hydrolizy edestyny w żelu zatrzymać
przez dodanie 5% roztworu TCA.
50
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
na przykładzie inwertazy
Badanie aktywności enzymów w żelu poliakrylamidowym jest często skuteczną
metodą identyfikacji enzymów w nieoczyszczonych preparatach białkowych. Badanie
aktywności enzymatycznej można przeprowadzać zarówno po rozdziale białek w żelu
poliakrylamidowym w warunkach denaturujÄ…cych jak i po elektroforezie w warunkach
natywnych. Wybór metody zależy w dużej mierze od wrażliwości badanego enzymu na
obecność SDS. W przypadku niektórych białek, które nie zachowują aktywności
enzymatycznej w obecności SDS, można przeprowadzić ich renaturację poprzez usunięcie
SDS (np. płucząc żel w roztworze 2,5% tritonu X-100). Jednakże nie ma jednej
uniwersalnej, efektywnej metody renaturacji enzymów, toteż aktywność enzymatyczną
niektórych białek bada się po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach natywnych.
Inwertaza, albo sacharaza (EC 3.2.1.26) katalizuje hydrolizę sacharozy będącej
disacharydem zÅ‚ożonym z czÄ…steczki Ä…-D-glukozy i czÄ…steczki ²-D-fruktozy poÅ‚Ä…czonych
wiÄ…zaniem Ä…1-²2 glikozydowym. Po rozerwaniu wiÄ…zania powstaje równomolarna
mieszanina czÄ…steczek glukozy i fruktozy. Inwertaza jest syntetyzowana przez wiele
szczepów drożdży i bakterii. Ilość enzymu produkowana przez mikroorganizm waha się
znacznie w zależności od gatunku, szczepu, czy dostępnego z
ródła węgla. Drożdże
Saccharomyces cerevisiae wytwarzają zarówno wewnątrz- jak i zewnątrzkomórkową
inwertazę. Zewnątrzkomórkowa inwertaza występuje w formie wysoce glikozylowanego
homodimeru wydzielanego do przestrzeni periplazmatycznej. Wewnątrzkomórkowa
inwertaza również tworzy homodimer ale nie ulega glikozylacji. Inwertaza jest
powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym do produkcji fruktozy czy
w biosensorach do stałego monitorowania poziomu sacharozy.
Celem ćwiczenia jest identyfikacja aktywności enzymatycznej inwertazy z drożdży
S. cerevisiae po rozdziale w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.
Materiały i odczynniki
1. 20-godzinna hodowla drożdży S cerevisiae, szczep W303 (50 ml na zespół studentów)
2. (NH4)SO4 cz. d. a. w postaci stałej
3. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0
4. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu
51
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
5. 10 mM bufor fosforanowy pH 5,8
6. 0,1 M r-r sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8 (przygotować
bezpośrednio przed użyciem)
7. Chlorek tetrazolu w postaci stałej (chronić przed światłem!!!)
8. 1M NaOH
9. Inwertaza - preparat handlowy (1 mg/ml w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8) 
przygotować w dniu poprzedzającym ćwiczenia, przechowywać w temp. 40C.
10. Celulozowe  węże do dializy
11. Papierki wskaz
nikowe pH 5,4  7,0
12. 10% roztwór kwasu octowego
13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy białek SDS/PAGE
Wykonanie ćwiczenia
Wysalanie i dializa białek z płynu pohodowlanego
1. Po ok. 20 godzinach hodowli, gdy OD600 równa się ok. 9-10 (faza stacjonarna)
odwirować komórki przy 3000 rpm przez 10 min.
2. Płyn pohodowlany zlać do cylindra (z
ródło inwertazy) a osad komórek odrzucić.
3. Zmierzyć objętość płynu pohodowlanego, przelać go do zlewki i pozostawić w lodzie
na mieszadle magnetycznym.
4. Białka wytrącać stałym siarczanem amonu przy wysyceniu 0-90% (tabela
frakcjonowania siarczanem amonu  strona 86). Siarczan amonu dodawać stopniowo
mieszając przez 1 godz. w temp. 40 C. Następnie zawiesinę odwirować przy 10000
rpm przez 20 min.
5. Osad wytrÄ…conych biaÅ‚ek rozpuÅ›cić w 200-300 µl 10 mM buforu fosforanowego, pH
7,0 i poddać dializie (przepis  strona 84) wobec 10 mM buforu fosforanowego, pH
7,0 z dodatkiem 30% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór białek przechowywać
w temp.  200 C.
Oznaczanie aktywności inwertazy w żelu
1. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis  strona 80).
2. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS/PAGE) według przepisu na stronie 74.
52
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
3. Przygotować próbki zawierajÄ…ce 200 µg biaÅ‚ka w objÄ™toÅ›ci 30 µl i dodać do nich po
10 µl buforu próbkowego do elektroforezy biaÅ‚ek w warunkach denaturujÄ…cych
(bezpośrednio przed naniesieniem na żel). Jako wzorzec przygotować próbkę
zawierajÄ…cÄ… 10 µg inwertazy handlowej w objÄ™toÅ›ci 30 µl i dodać do niej 10 µl buforu
próbkowego. Dokładnie wymieszać (uwaga! nie ogrzewać próbek w temperaturze
900C) i nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym.
4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 150 V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego.
5. Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść do małego pojemnika, przepłukać 30 ml
wody destylowanej, a następnie 30 ml 10 mM buforu fosforanowego pH 5,8.
6. Następnie żel zalać 30 ml 0,1 M roztworu sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym
pH 5,8 i inkubować w łaz
ni wodnej w temp. 450C przez 45 min. Uwaga! Podczas
inkubacji należy kontrolować, za pomocą papierków wskaz
nikowych, pH r-ru
(pH r-ru wzrasta, zwłaszcza w ciągu pierwszych 15 min. inkubacji). W przypadku
zmiany pH, zlać roztwór sacharozy i zalać żel kolejną porcją.
7. Po zakończeniu inkubacji, zlać roztwór sacharozy, a żel przepłukać trzy razy wodą
destylowanÄ….
8. Ok. 10 min przed zakończeniem inkubacji przygotować wrzącą łaz
niÄ™ wodnÄ….
Naważyć 50 mg chlorku tetrazolu i rozpuścić w 50 ml 1M NaOH. Roztwór barwnika
umieścić w szklanym naczyniu na wrzącej łaz
ni wodnej.
9. Gdy roztwór chlorku tetrazolu zaczyna zmieniać barwę (z bezbarwnej na różową),
przenieść żel do roztworu barwnika umieszczonego na wrzącej łaz
ni wodnej.
10. Żel barwić do pojawienia się czerwonych prążków białkowych.
11. Reakcję przerwać przez przeniesienie żelu do roztworu 10 % kwasu octowego.
53
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae
Komórki drożdży mogą występować w dwóch formach: haploidalnej i diploidalnej.
Zarówno forma haploidalna jak i diploidalna może się rozmnażać na drodze podziałów
wegetatywnych (pączkowanie) i stabilnie rosnąć w hodowlach. Haploidalne komórki
drożdżowe mogą występować w dwóch typach płciowych  a i ą. Poprzez zlanie się dwóch
haploidalnych komórek o przeciwnych typach płciowych (koniugacja) powstaje komórka
diploidalna a/ą. Komórka w fazie diploidalnej może przechodzić normalne wegetatywne
podziały, lecz nie może się krzyżować z innymi komórkami. W niekorzystnych warunkach
środowiskowych komórka diploidalna może wejść na szlak sporulacji, wytwarzając po
podziałach mejotycznych, worek z czterema haploidalnymi zarodnikami (askosporami):
dwoma typu a i dwoma Ä… .
Cykl życiowy drożdży S. cerevisiae przedstawiono schematycznie na poniższym rysunku.
54
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Koniugacja drożdży S. cerevisiae
Techniki koniugacji i sporulacji od lat sÄ… wykorzystywane w laboratoriach
zajmujących się drożdżami, gdyż pozwalają na połączenie haploidalnych klonów o
odmiennych cechach genetycznych. Po wytworzeniu zarodników przez pokolenie diploidalne
możliwa jest izolacja klonów pochodzących z jednego zarodnika o pożądanych cechach
genetycznych wprowadzonych przez oba szczepy haploidalne użyte do koniugacji. Aby
ułatwić takie manipulacje utworzono na drodze mutagenezy liczne tandemy szczepów
haploidalnych a i ą różniące się posiadanymi markerami auksotroficznymi, co pozwala na
swobodne krzyżowanie i łatwą selekcję pokolenia diploidalnego. Przykładem, który to
ilustruje jest często wykorzystywany tandem szczepów drożdżowych BY4741 i BY4742
o cechach genotypowych ujętych w tabeli:
Nazwa Typ markery auksotroficzne
szczepu płciowy
BY4741 a his3"1; leu2"0; ura3"0; met15"0
BY4742 Ä… his3"1; leu2"0; ura3"0; lys2"0
W obu szczepach obecne sÄ… delecje inaktywujÄ…ce geny zwiÄ…zane z biosyntezÄ…
histydyny, leucyny i uracylu, co pozwala na dowolne wprowadzanie: (1) mutacji kierowanych
(ang. site directed) na chromosomie za pomocą aktywnych kopii genów (HIS3, LEU2
i URA3), (2) plazmidów posiadających wymienione geny w celu selekcji. Pozostałe markery
służą do przeprowadzenia procesu koniugacji pomiędzy tymi szczepami. Po zmieszaniu
hodowli obu szczepów haploidalnych i przeniesieniu mieszaniny na podłoże pozbawione
metioniny i lizyny, nie zaobserwujemy wzrostu haploidalnych pokoleń rodzicielskich a i ą,
natomiast uzyskamy wzrost szczepu diploidalnego, powstałego w wyniku koniugacji obu
szczepów haploidalnych, który będzie zawierał zarówno po nieaktywnej kopii genów
met15"0 i lys2"0 jak i ich aktywne kopie wprowadzone przez przeciwny typ płciowy.
Materiały i odczynniki
1. Nocna hodowla wzorcowych szczepów drożdży BY4741(a) i BY4742(ą)  po 5 ml
2. Nocna hodowla badanych szczepów drożdży (wybranych przez prowadzącego
ćwiczenia  po 5 ml, oznaczonych jako x i y)
3. Podłoże SD z 3% agarem -50 ml
55
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
4. 40% glukoza
5. Mieszanina aminokwasów pozbawiona metioniny i lizyny (10 x stężona)
6. Jałowa woda dejonizowana
7. Jałowe płytki Petriego
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml i końcówki do pipet
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
1. Na dwie jałowe płytki Petriego wylać po 20 ml podłoża SD z agarem dodając do
niego, bezpośrednio przed wylaniem, 1/5 objętości 40% glukozy, i 1/10 objętości
roztworu aminokwasów pozbawionych lizyny i metioniny.
2. Pozostawić uchylone płytki do osuszenia przez 15 minut.
3. Odwirować przy 10000 rpm przez 1 min. po 200 µl caÅ‚onocnych hodowli szczepów
wzorcowych i szczepów badanych.
4. Osad komórek zawiesić w 1000 µl jaÅ‚owej wody i ponownie odwirować w celu
usunięcia resztek podłoża.
5. Osad komórek zawiesić w 500 µl jaÅ‚owej wody.
6. Wykonać koniugację badanych szczepów z wzorcami typu płciowego a i ą
wg zaÅ‚Ä…czonego schematu, nanoszÄ…c na pÅ‚ytkÄ™ z podÅ‚ożem po 8 µl zawiesiny komórek
(górny panel w schemacie to testowa koniugacja szczepów wzorcowych wykonywana
w celu sprawdzenia poprawności procedury)
7. Płytki inkubować w temp. 300C do pojawienia się wzrostu koniugantów (3-4 dni.
a a+Ä… Ä…
Schemat wykonania koniugacji
dla szczepu x
a a+x x
x x+ Ä… Ä…
Interpretacja wyników
Określić typ płciowy badanych szczepów drożdży.
56
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Sporulacja drożdży S. cerevisiae
Wytworzenie zarodników (spor) poprzedzone podziałem mejotycznym jest jedną
ze strategii przetrwania komórek drożdży w czasie pogorszenia się warunków wzrostu
w środowisku. Spory ze względu na odmienną budowę ścian komórkowych i kondensację
cytoplazmy są bardziej odporne niż komórki wegetatywne na szkodliwe czynniki takie jak
wysuszenie czy wysoka temperatura.
W warunkach laboratoryjnych proces wytwarzania zarodników możemy indukować
dobierając odpowiednio podłoża. W pierwszym pasażu komórki drożdżowe hoduje się na
podłożu stałym bogatym w z
ródła azotu i aminokwasy (pepton, ekstrakt drożdżowy) oraz
w obecności niefermentowalnych z
ródeł węgla takich jak etanol czy gliceryna, w czasie
wzrostu metabolizm drożdży przestawiony zostaje na oddychanie tlenowe. Z takiego podłoża
komórki drożdży przenosi się na podłoże minimalne pozbawione z
ródeł azotu oraz
z ograniczonym dostępem do substancji mogących stanowić z
ródła energii. Standardowo
wykorzystujemy w tym celu podłoże agarowe zawierające jedynie octan potasu. Gwałtowne
pogorszenie warunków wzrostu, połączone z obniżeniem temperatury inkubacji z 300C do
250C, indukuje procesy prowadzące do podziału mejotycznego i wytworzenia zarodników.
Materiały i odczynniki
1. Płytka Petriego z podłożem presporulacyjnym YPGlic (2% pepton, 1% ekstrakt
drożdżowy, 2% glicerol, 2% agar) z rosnącymi komórkami drożdży pokolenia
diploidalnego  przygotować trzy dni przed zajęciami
2. Podłoże sporulacyjne (1% octan potasu, 2 % agar)
3. Jałowe płytki Petriego
4. Eza
5. Parafilm
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
1. Przygotować jałowe płytki Petriego z podłożem sporulacyjnym.
2. Za pomocą ezy przenieść komórki drożdży z podłoża presporulacyjnego na podłoże
sporulacyjne rozprowadzając je grubą warstwą w postaci kwadratów o powierzchni
1 cm kw.
3. Płytki Petriego szczelnie zabezpieczyć parafilmem przed wysychaniem.
57
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
4. Inkubować płytki Petriego w temp. 250C lub w temp. pokojowej do następnych
ćwiczeń (min. 7 dni).
Otrzymanie pokolenia haploidalnego drożdży po sporulacji
Poprawa warunków środowiska prowadzi do kiełkowania zarodników. Pokolenie
haploidalne najczęściej jeszcze w zarodni wchodzi w proces koniugacji prowadzący do
odtworzenia pokolenia diploidalnego. W warunkach laboratoryjnych istotne jest oddzielenie
zarodników od komórek wegetatywnych oraz rozbicie zarodni (worków) celem separacji
zarodników, aby nie dopuścić do przypadkowych koniugacji.
W tym celu najczęściej dokonujemy mechanicznego rozerwania ścian zarodni poprzez
np. wytrzÄ…sanie z kulkami szklanymi, bÄ…dz
prowadzimy enzymatyczną degradację ściany za
pomocÄ… enzymów rozkÅ‚adajÄ…cych wiÄ…zanie ²(1-3) glikozydowe, np. zymoliazy (Å›ciana
zarodnika, ze względu na odmienną budowę, jest na trawienie takimi enzymami odporna). Po
uwolnieniu zarodników przeprowadzamy ich izolację wykorzystując różnice w masie
zarodników i komórek wegetatywnych lub doprowadzamy do zabicia komórek
wegetatywnych działając na nie wysoką temperaturą.
Materiały i odczynniki
1. Podłoże sporulacyjne z komórkami drożdży przygotowanymi na poprzednich
zajęciach
2. Nocna hodowla drożdży BY 4741 na płynnym podłożu YPD  5 ml
3. Podłoże YPD (2% pepton, 1% ekstrakt drożdżowy 2% glukoza, 2% agar)  200 ml
4. Jałowy bufor PBS
5. Jałowe płytki Petriego
6. Eza
7. GÅ‚aszczka
8. Jałowe probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml oraz końcówki do pipet
9. Termoblok
10. Mikroskop świetlny oraz szkiełka podstawowe i nakrywkowe
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych.
58
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
1. Przygotować 8 płytek Petriego z podłożem YPD z 2% agarem.
2. Za pomocą ezy pobrać komórki z płytek z podłożem sporulacyjnym i zawiesić je
w 1 ml buforu PBS, utrzymując komórki w lodzie.
3. Zwirować 1 ml komórek nocnej hodowli drożdży i osad zawiesić w 1 ml buforu PBS.
4. Zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny komórek pobranych z podłoża sporulacyjnego
oraz zawiesiny komórek pobranych z nocnej hodowli drożdży przy długości fali 600
nm (OD600). Zachować zawiesiny drożdży do przygotowania preparatów
mikroskopowych na póz
niejszym etapie ćwiczeń.
5. Dla obu próbek przygotować, w probówkach Eppendorfa o poj. 1,5 ml, po 1 ml
rozcieńczonej zawiesiny komórek o gęstości OD600 = 0,1 w buforze PBS.
6. Pobrać do osobnych probówek Eppendorfa po 0,1 ml zawiesiny (czas 0)
7. Pozostałą część zawiesiny umieścić w termobloku w temperaturze 500C i pobierać po
0,1 ml zawiesiny w odstępach 15 minutowych (czas 15, 30 i 45 min). Ze względu na
szybką sedymentację komórek drożdży, przed pobraniem zawartość probówek
wymieszać.
8. W czasie inkubacji przygotować preparaty mikroskopowe komórek drożdży z płytek
z podłożem sporulacyjnym i nocnej hodowli drożdży, nanosząc na szkiełko
podstawowe po 5 µl zawiesiny drożdży. Zanotować różnice w wyglÄ…dzie komórek
zwracając uwagę na: liczbę pączkujących komórek, ich wielkość oraz obecność tetrad
zarodników.
9. Pobrane w czasie 0, 15, 30 i 45 min. zawiesiny komórek rozprowadzić głaszczką na
płytkach Petriego z podłożem YPD z 2% agarem.
10. Płytki Petriego szczelnie zabezpieczyć parafilmem przed wysychaniem.
11. Inkubować w temperaturze 300C do czasu pojawienia się kolonii drożdży (3-5 dni).
12. Policzyć ilość kolonii na każdej płytce i zanotować wynik.
59
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Transfer genów do komórek ssaczych  transfekcja
Wykorzystanie hodowli komórkowych w badaniach naukowych umożliwiło poznanie
licznych szlaków metabolicznych, a możliwość ekspresji genów w komórkach ssaczych
stwarza obecnie szansÄ™ na uzyskanie odpowiedzi na kluczowe problemy biologii. JednÄ… z
metod wykorzystywanych podczas analizy wielu istotnych procesów zachodzących w żywych
komórkach jest transfekcja, która umożliwia wprowadzenie genów (głównie DNA, ale
również RNA, a nawet białek) do komórek ssaczych.
Prowadzenie hodowli komórkowych
Hodowla komórek jest metodą umożliwiającą utrzymywanie poza organizmem, czyli in
vitro, żywych komórek, fragmentów tkanek lub narządów. Jest to termin o szerokim
wachlarzu znaczeń, obejmujący hodowle wycinków tkankowych, hodowle narządowe,
hodowle komórkowe pierwotne i hodowle linii oraz szczepów komórkowych, jak również
kokultury organotypowe i hodowle przestrzenne. Pod pojęciem  hodowle komórek należy
rozumieć hodowle zdyspergowanych komórek w hodowlach pierwotnych i w hodowlach
komórek linii komórkowych, rosnące w systemie jednowarstwowym (hodowle adherentne)
lub w zawiesinie (hodowle zawiesinowe). Hodowla pierwotna jest zakładana z materiału
pobranego bezpośrednio z organizmu. Wyprowadza się ją z eksplantów tkanki/narządu lub z
zawiesiny powstałej po ich enzymatycznym rozproszeniu. Linia komórkowa jest populacją
komórek powstającą z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. Pasażowaniem nazywa się
przeniesienie komórek ze starego naczynia hodowlanego do nowych naczyń, zawierających
świeżą pożywkę. Pasażowaniu poddaje się komórki przed osiągnięciem konfluencji czyli
stanu, kiedy komórki w hodowli pokrywają ścisłą warstwą całą powierzchnię dna naczynia
hodowlanego. Podczas pasażowania komórki rozcieńcza się w odpowiednim stosunku i
przenosi do nowych naczyń, namnażając w ten sposób populację komórek i zapewniając
jednocześnie ciągłość jednolitego materiału do badań.
Hodowla komórek in vitro wymaga zachowania sterylnych warunków, zapewnienia
środowiska wzrostu o optymalnej temperaturze i wilgotności oraz dostarczenia komórkom
wszystkich niezbędnych do życia i proliferacji składników odżywczych i wzrostowych.
W laboratoriach, w których prowadzi się badania w układach komórkowych in vitro,
zachodzi potrzeba ograniczenia ilości pasaży hodowli oraz ilości hodowli komórkowych
 znajdujących się w danym momencie w hodowli . Dodatkowo, niektóre linie komórkowe
60
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
charakteryzuje ograniczona liczba podziałów i czas w jakim mogą być utrzymywane w
hodowli. Między innymi z tego powodu powszechnie praktykowane jest zamrażanie linii
komórkowych i przechowywanie zamrożonych komórek w tzw. bankach komórek.
Podstawową zasadą tej praktyki jest powolne zamrażanie i szybkie rozmrażanie komórek.
Przyjmuje się, że w czasie zamrażania komórek temperatura powinna spadać z szybkością
1  3 °C/min., natomiast rozmrażanie należy prowadzić przez 3 - 5 min. w temperaturze
37 °C. Ponadto, podczas zamrażania komórek należy postÄ™pować wg Å›ciÅ›le okreÅ›lonych
reguł. Procedurę należy rozpocząć od makroskopowej i mikroskopowej analizy stanu
hodowli. Komórki w hodowli powinny być w dobrej kondycji, bez mikrobiologicznych
zakażeń oraz znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu. Proces zamrażania może być
zabójczy dla komórek ze względu na towarzyszące mu efekty uboczne tj.: uszkodzenia
wywołane powstającymi w komórce kryształkami lodu, zmiany stężenia elektrolitów,
dehydratację czy zmiany pH, dlatego żeby zminimalizować ich negatywny wpływ stosuje się
określone środki ostrożności. Przede wszystkim do pożywki dodaje się tzw. związki
krioprotekcyjne (najczęściej DMSO lub glicerol) obniżające punkt zamarzania. Ponadto,
zwiększa się zawartość surowicy w pożywce do zamrażania komórek w stosunku do pożywki
wzrostowej używanej standardowo do hodowli tych samych komórek (zazwyczaj powyżej
20%, wyjątkowo nawet 90%). Zamrożone komórki przechowuje się w temperaturze poniżej -
135°C, w ciekÅ‚ym azocie (-196ºC) lub w jego oparach (-178ºC).
Celem ćwiczenia jest pasaż linii komórkowej HeLa, zaszczepienie jej do naczyń
hodowlanych oraz zamrożenie komórek w celu dalszego ich przechowywania.
Materiały i odczynniki:
1. Hodowle komórkowe (adherentne) w naczyniach hodowlanych
2. Podłoże hodowlane MEM (MEM, 10% płodowa surowica bydlęca, 2 mM glutamina,
0,1 mM aminokwasy wzbogacajÄ…ce, antybiotyki: penicylina (100 U/ml)
i streptomycyna (100 źg/ml))
3. Roztwór 0,25% trypsyny z EDTA
4. PBS
5. Pożywka do zamrażania hodowli komórkowych
6. Naczynia hodowlane (płaskodenne butelki hodowlane/płytki Petriego)
7. Jałowe pipety pasteurowskie
8. Pipety serologiczne
61
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
9. Probówki wirówkowe o pojemności 15 ml
10. Probówki do zamrażania hodowli komórkowych
11. Jałowe końcówki do pipet
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych,
odpowiednich do pracy z hodowlami komórkowymi.
Pasażowanie adherentnej linii komórkowej
Przed przystąpieniem do pasażowania, należy przeprowadzić obserwację mikroskopową
hodowli komórkowej w celu sprawdzenia właściwego wzrostu hodowli oraz skontrolowania
prawidłowej morfologii komórek. W momencie, gdy hodowla wykazuje prawidłowy wzrost,
posiada określoną gęstość i nie jest zainfekowana przez drobnoustroje (wykluczenie
kontaminacji bakteryjnej i drożdżowej) można przystąpić do pasażowania. W tym celu
należy:
1. Usunąć pożywkę znad hodowli komórkowej za pomocą ssawki i jałowej pipety
pasterowskiej.
2. Przepłukać hodowlę 1 ml buforu PBS.
3. Nanieść na powierzchnię hodowli i dokładnie rozprowadzić 1 ml roztworu 0,25%
trypsyny z EDTA. Naczynie z hodowlÄ… inkubować w 37 ºC do momentu
enzymatycznego odklejenia się komórek (tzw. trypsynizacja). Stopień odklejenia się
komórek można monitorować pod mikroskopem.
4. Odklejone komórki (zaokrąglone i swobodnie pływające w pożywce) zebrać do
jałowej probówki wirówkowej, wykorzystując 3 ml hodowlanego podłoża
wzrostowego MEM i wirować 5 minut przy 1000 x g w 20 ºC.
5. Supernatant usunąć, komórki zawiesić w 3 ml podłoża wzrostowego MEM i wirować
jw.
6. Supernatant ponownie odrzucić, a pelet komórek ponownie zawiesić w medium
wzrostowym MEM i przenieść w równych ilościach na 3 płytki Petriego.
7. Do każdej płytki dodać po 9 ml świeżego podłoża wzrostowego MEM, a komórki
równomiernie rozprowadzić w naczyniu hodowlanym poprzez delikatne mieszanie.
o
8. Hodowle komórkowe inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 C w
atmosferze 5% CO2.
62
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Po kilku, kilkunastu godzinach (w zależności od typu komórek) komórki zaczynają przyklejać
siÄ™ do powierzchni naczynia hodowlanego, a po kilku dniach tworzÄ… jednorodnÄ… warstwÄ™
komórek (tzw. z ang. monolayer). Wzrost komórek monitoruje się przy pomocy
odwróconego mikroskopu świetlnego.
Zamrażanie hodowli komórkowych
1. Komórki na trzech płytkach hodowlanych trypsynizować tj. opisano w ćw. 1.
2. Zwirowane po trypsynizacji komórki zawiesić w 1 ml podłoża wzrostowego MEM,
i policzyć w hemocytometrze wg metody opisanej na str& .
3. Ponownie zwirować komórki, odrzucić supernatant, a pelet zawiesić w 1 ml pożywki
do zamrażania.
4. Następnie zwirować komórki, zawiesić w pożywce do zamrażania, tak aby otrzymać
106-107 kom/ml.
5. Zawiesinę komórek rozpipetować po 0,5 ml do probówek do zamrażania i schładzać
w kolejnych etapach: 30 minut w 4ºC, przez noc w -80ºC, a nastÄ™pnie przenieść do
ciekłego azotu.
Rozmrażanie hodowli komórkowych
1. Wyciągnięte z ciekłego azotu komórki przenieść do łaz
ni wodnej o temperaturze
37 ºC, w jak najkrótszym czasie i rozmrażać przez Å‚agodne mieszanie.
2. Zaraz po rozmrożeniu, zawiesinę komórek przenieść kroplami do naczynia
hodowlanego z ogrzanym do temperatury pokojowej podłożem wzrostowym i
delikatnie wymieszać.
3. Hodowlę inkubować 24 godziny w temperaturze 37 oC, w atmosferze 5% CO2.
4. Podłoże hodowlane wymienić na świeże, celem pozbycia się DMSO i zapewnienia
hodowli optymalnych warunków do wzrostu.
Transfekcja
Badanie funkcji pojedynczych genów jest związane z klonowaniem odpowiedniej
sekwencji DNA, a następnie wprowadzeniem jej różnymi technikami do komórek, w których
może podlegać ekspresji. Wprowadzając do komórek DNA w postaci wektora plazmidowego
63
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
(konstruktu genetycznego) służącego ekspresji zawartych w nim genów kodujących
konkretne białka, można w tych komórkach uzyskać nadekspresję pożądanego genu, a w
konsekwencji natywne białko o modyfikacjach posttranslacyjnych typu ssaczego. Taki układ
eksperymentalny umożliwia przyżyciową analizę wielu procesów komórkowych w tym np.
monitorowanie regulacji transkrypcji genu, określenie subkomórkowej lokalizacji
eksprymowanego białka bądz
ustalanie interakcji między biomolekułami.
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie do komórek ssaczych HeLa konstruktu
genetycznego kodującego białko hMrt4 w fuzji z markerem fluorescencyjnym DsRed
(DsRed-hMrt4) i analiza jego subkomórkowej lokalizacji w warunkach fizjologicznych oraz
w obecności aktynomycyny D i leptomycyny B. Ludzkie białko hMrt4 jest jednym z tzw.
czynników wspomagających proces biogenezy rybosomów. Aktynomycyna D to antybiotyk
peptydowy, który specyficznie wiąże się do DNA i hamuje proces transkrypcji. Jednym
z efektów jego działania na komórkę jest stres jąderkowy. Niskie dawki ActD (50 ng/ml)
selektywnie hamują tylko polimerazę RNA I, odpowiedzialną za transkrypcję genów dla 18S,
5,8S oraz 25/28S rRNA, podczas gdy wyższe jej stężenia hamują zarówno polimerazę RNA I,
jak również polimerazę RNA II i III, ale już w sposób niespecyficzny. Leptomycyna B, to
wysoce specyficzny inhibitor eksportyny Crm1, odgrywajÄ…cej kluczowÄ… rolÄ™ w eksporcie
jądrowym, a w szczególności w transporcie dojrzewających podjednostek rybosomalnych
z jÄ…dra do cytoplazmy. Aktynomycyna D hamuje zatem dojrzewanie podjednostek
rybosomalnych już na bardzo wczesnych etapach biogenezy, podczas gdy leptomycyna B
działa dużo póz
niej, dopiero na końcowym etapie jądrowego dojrzewania pre-rybosomów.
Materiały i odczynniki:
1. Linia komórkowa HeLa o odpowiedniej gęstości
2. Podłoże hodowlane MEM (MEM, 10% płodowa surowica bydlęca, 2 mM glutamina,
0,1 mM aminokwasy wzbogacajÄ…ce, antybiotyki: penicylina (100 U/ml)
i streptomycyna (100 źg/ml))
3. PBS
4. Odczynnik do transfekcji
5. 150 mM NaCl
6. Konstrukt genetyczny o znanym stężeniu DNA (np. pDsRedC2-hMrt4)
7. Aktynomycyna D (10 źg/ml w etanolu)
8. Leptomycyna B (2,5 źM w 70% metanolu)
9. PÅ‚ytki Petriego 35 x 10
64
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
10. Odpowiednio wytrawione, jałowe szkiełka nakrywkowe 18 x 18 mm
11. Jałowe probówki Eppendorfa
12. Jałowe końcówki do pipet
Wykonanie ćwiczenia:
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków jałowych,
odpowiednich do pracy z hodowlami komórkowymi.
Przygotowanie komórek do transfekcji
Postępować według procedury do pasażu hodowli komórkowych.
1. Strypsynizowane komórki zwirować, supernatant odrzucić, a pelet zawiesić w 1ml
podłoża wzrostowego MEM.
2. Policzyć komórki w hemocytometrze wg metody opisanej na str& .
3. Do 6-ciu płytek Petriego 35 x 10, pojedynczo przenieść jałowe, wcześniej wytrawione
szkiełka nakrywkowe i 2 ml podłoża wzrostowego. Szkiełka nakrywkowe dobrze
przycisnąć do płytki, żeby komórki mogły przykleić się tylko do górnej strony
szkiełka.
4. Do płytek z podłożem wprowadzić 5 x 104 komórek i delikatnie mieszając
równomiernie rozprowadzić w obrębie naczynia.
5. Hodowle komórkowe inkubować ok. 24 godzin w temperaturze 37 oC, w atmosferze
5% CO2, do momentu osiągnięcia 60%-70% konfluencji.
Transfekcja konstruktu genetycznego pDsRedC2-hMrt4
do komórek ssaczych HeLa
Dla pięciu płytek z hodowlą komórkową o odpowiedniej gęstości przygotować
kompleksy DNA : odczynnik do transfekcji i przeprowadzić transfekcję wg poniższej
procedury:
1. Do dwóch probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml wprowadzić po 100 źl 150 mM
NaCl.
2. Do jednej z nich dodać 3 źg DNA (konstrukt genetyczny pDsRedC2-hMrt4) i
delikatnie wymieszać, stukając palcem w dno probówki.
3. Do drugiej probówki, bezpośrednio do roztworu NaCl, wprowadzić 6 ul odczynnika
do transfekcji i całość delikatnie wymieszać.
65
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
4. Roztwór zawierający odczynnik do transfekcji przenieść do probówki z roztworem
DNA i bardzo dokładnie wymieszać. W ten sposób powstaną kompleksy odczynnika
do transfekcji i DNA. Całość inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Mieszaninę po inkubacji dodawać do 24-godzinnej hodowli komórkowej kroplami.
6. HodowlÄ™ inkubować 24 godziny w 37 ºC, w atmosferze 5% CO2.
7. Subkomórkową lokalizację białka fuzyjnego obserwować w mikroskopie, po
wzbudzeniu fluorescencji białka DsRed falą o długości =588 nm.
Badanie wpływu aktynomycyny D i Leptomycyny B na subkomórkową
lokalizację białka fuzyjnego DsRed-hMrt4
1. 24 godziny po transfekcji komórek konstruktem genetycznym do hodowli rosnących
na płytkach od 1-5 dodać kolejno:
" Płytka 1: aktynomycynę D: stężenie końcowe 50 ng/ml (określenie wpływu
ActD);
" Płytka 2: leptomycynę B: stężenie końcowe 2,5 nM (określenie wpływu
LMB);
" Płytka 3: rozpuszczalnik dla ActD, w objętości równej objętości dodanej
aktynomycyny (etanol, kontrola dla ActD);
" Płytka 4: rozpuszczalnik dla LMB, w objętości równej objętości dodanej
leptomycyny B (metanol, kontrola dla LMB);
" Płytka 5: nic nie dodawać (kontrola);
Płytka nr 6 stanowi kontrolę wzrostu tkanki w warunkach fizjologicznych bez obecności
jakichkolwiek efektorów.
2. Hodowle inkubować 24 godziny w 37 ºC, w atmosferze 5% CO2, a nastÄ™pnie
prowadzić mikroskopową obserwację subkomórkowej lokalizacji białek fuzyjnych
(wzbudzenie fluorescencji falą o długości =588 nm).
66
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Interpretacja wyników:
1. Określić subkomórkową lokalizację białek fuzyjnych ulegających ekspresji w hodowli
komórek ssaczych HeLa, w warunkach fizjologicznych oraz w obecności inhibitorów
biogenezy rybosomów.
1. Wyjaśnić różnice między lokalizacją poszczególnych białek fuzyjnych w hodowlach
komórkowych prowadzonych w obecności ActD i LMB i w hodowlach bez dodatku tych
antybiotyków.
67
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Załącznik do ćwiczeń
ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAA
DNA W ŻELU AGAROZOWYM
Agaroza to polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany
przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Agaroza jest Å‚atwo rozpuszczalna w wodzie, w
temperaturze pokojowej odwracalnie tworzy żel. Temperatura przejścia żelu w zol (potocznie
topnienie agarozy) jest wyższa od temperatury zestalania.
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą
rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty DNA. Do zalet tej metody należy zaliczyć
jej prostotę a także możliwość bezpośredniej lokalizacji fragmentów DNA w żelu przy
pomocy barwnika interkalujÄ…cego  bromku etydyny
Czynniki wpływające na tempo migracji DNA w żelu agarozowym.
Masa czÄ…steczkowa DNA:
Większe cząsteczki DNA migrują wolniej niż cząsteczki małe ze względu na większe
opory ruchu oraz większe trudności w penetrowaniu porów żelu będącego rodzajem sita
molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesiętnego
ilości par zasad.
Stężenie agarozy:
Zwiększając stężenie agarozy zwalnia się tempo migracji DNA w żelu. Na podstawie
prac doświadczalnych ustalono optymalne stężenie agarozy do rozdziałów fragmentów DNA
o określonej wielkości. Dane te przedstawiono w tabeli:
Optymalne stężenie agarowy
Wielkość cząsteczki DNA (kb) Stężenie agarozy (%w/v)
5 - 60 0,3
1 - 20 0,6
0,8 - 10 0,7
0,5 - 7 0,9
0,4 - 6 1,2
0,2 - 3 1,5
0,1 - 2 2,0
68
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Stosowane napięcie prądu podczas elektroforezy:
Przy niskich napięciach tempo migracji liniowych cząsteczek kwasów nukleinowych
jest wprost proporcjonalne do napięcia. Zależność ta przestaje obowiązywać dla dużych
cząsteczek DNA rozdzielanych przy zastosowaniu wysokich napięć, dlatego też w czasie
rozdziału cząsteczek większych niż 2000 pz (2 kb) nie należy stosować napięcia większego
niż 5 V/cm.
Temperatura rozdziału:
Temperatura w jakiej dokonuje siÄ™ rozdziaÅ‚u w zakresie od 4°C do temperatury
pokojowej nie wpływa w istotnym stopniu na elektroforetyczne właściwości DNA. Ma
jednakże wpływ na bierną dyfuzję kwasów nukleinowych w żelu, co może mieć wpływ
(szczególnie w przypadku wyższych temperatur a także mniejszych fragmentów DNA) na
ostrość prążków. Obniżenie temperatury podczas rozdziału powoduje wyostrzenie
poszczególnych prążków. W celu przeprowadzenia elektroforezy w obniżonej temperaturze
należy zastosować aparat z wymiennikiem ciepła.
Bromek etydyny:
Obecność bromku etydyny w buforze do elektroforezy (i żelu) lub w barwniku do
próbek zwalnia tempo przemieszczania się cząsteczek o ok. 15%.
Skład i siła jonowa buforu:
W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza siÄ™ bardzo wolno. W wypadku
stosowania buforu o dużej sile jonowej wydzielana jest duża ilość ciepła, które może
spowodować roztopienie agarozy i denaturację DNA. Najpowszechniej stosowany jest bufor
TAE.
Elektroforezę natywnego RNA przeprowadza się według tych samych zasad co
elektroforezę DNA. Jednakże większość cząsteczek RNA tworzy złożone struktury
drugorzędowe co powoduje, że szybkość migracji takich cząsteczek RNA nie jest
proporcjonalna do ich wielkości. Ponadto, cząsteczki takie mogą tworzyć kilka form
widocznych na żelu w postaci oddzielnych prążków. Toteż, próbki RNA przed elektroforezą
często poddaje się denaturacji i elektroforezę przeprowadza się w warunkach denaturujących.
69
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Materiały i odczynniki
1. Bufor próbkowy do elektroforezy RNA 2x stężony:
95% formamid
0,025 % SDS
0,025% błękit bromofenolowy
0,025% bromek etydyny
0,5 mM EDTA, w wodzie
2. Bufor próbkowy do elektroforezy DNA:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
30 % glicerol
0,04% błękit bromofenolowy
3. Bufor TAE 50 x stężony:
242 g Tris
57,1 ml kw. octowy lodowaty
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
dopełnić H2O do 1000 ml
4. Agaroza
5. Bromek etydyny 10 mg/ml
6. Markery do elektroforezy kwasów nukleinowych
7. Zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Pracę z bromkiem etydyny wykonywać w rękawicach ochronnych.
Zgodnie z zaleceniami prowadzącego ćwiczenia, przygotować 100 ml 0,7% lub 1%
roztworu agarozy w buforze TAE. W tym celu odpowiednio 0,7 g lub 1 g agarozy rozpuścić
w 100 ml buforu TAE ( 2 ml 50x stężonego buforu TAE + 98 ml H2O). Agarozę gotować
przez ok. 2 minuty w celu dobrego rozpuszczenia. Następnie roztwór agarozy schłodzić do
temp. 60-700C i dodać 5 źl roztworu bromku etydyny. Dokładnie wymieszać, wylać na płytkę
i pozostawić do zastygnięcia.
Badane próbki DNA lub RNA zawiesić w buforze próbkowym do elektroforezy,
odpowiednio, DNA lub RNA. Płytkę z zastygniętym żelem agarozowym umieścić w aparacie
do elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym (1x stężony TAE). Na żel nanosić
po 5-30 źl próbek kwasów nukleinowych. Rozdział prowadzić przy napięciu 100V dopóki
70
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej elektroforezie obserwować
rozdzielone kwasy nukleinowe pod lampÄ… UV.
ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAA
BIAA
EK W ŻELU
POLIAKRYLAMIDOWYM
Żel poliakrylamidowy posiada następujące cechy: jest bezbarwny, pozbawiony
ładunków, odznacza się dużą wytrzymałością mechaniczną, łatwy w przygotowaniu
i formowaniu w odpowiednich naczyniach. Żel poliakrylamidowy to łańcuchy akrylamidu
(H2C=CH-CO-NH2) połączone wiązaniami poprzecznymi za pomocą N,N -metyleno-bis-
akrylamidu (H2C=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2). W ten sposób tworzy się sieć, przez

 oczka której migrują rozdzielane cząsteczki. Wielkość  oczek sieci żelu zależy od
stężenia akrylamidu oraz bisakrylamidu. Polimeryzacja żelu odbywa się w obecności
nadsiarczanu amonu (APS) oraz N,N,N ,N -tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) umożliwia rozdział cząsteczek
białkowych różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym. Rozdział ten można
prowadzić w warunkach niedenaturujących oraz w warunkach denaturujących. Elektroforeza
białek w warunkach denaturujących określana skrótem SDS-PAGE odbywa się w obecności
soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jest detergentem jonowym. SDS łącząc się
z grupami hydrofobowymi aminokwasów nadaje białkom ładunek ujemny. Sprawia to, że
migrują one w kierunku dodatniej anody. Ilość związanego SDS jest proporcjonalna do
wielkości cząsteczek białkowych. Dzięki temu rozdzielają się one w żelu pod względem masy
cząsteczkowej. Polipeptydy o niższej masie cząsteczkowej migrują szybciej, zaś większe
wolniej. Metoda SDS-PAGE stosowana jest między innymi do: identyfikacji i monitorowania
składu mieszaniny białek, sprawdzania jednorodności (homogenności) białek, oznaczania
masy cząsteczkowej białek, analizy struktury podjednostkowej aktywnych biologicznie
kompleksów białkowych.
71
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Elektroforeza w warunkach niedenaturujÄ…cych (PAGE)
Materiały i odczynniki
1. 30% roztwór akrylamidu + 0,8% roztwór bisakrylamidu
2. 1,5M roztwór Tris-HCl pH 8,8
3. 0,5M roztwór Tris-HCl pH 6,8
4. 10% roztwór APS (nadsiarczanu amonu)
5. TEMED
6. 1% roztwór błękitu bromofenolowego
7. 30% roztwór sacharozy
8. Bufor elektrodowy:
Glicyna 14,4 g
Tris 3,0 g
uzupełnić wodą do1000 ml
9. Wzorce białkowe
10. Zestaw do elektroforezy białek
Przygotowanie żelu i próbek białkowych
Umyte i odtłuszczone specjalne płytki szklane do elektroforezy, złożyć zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia. Przygotować 2 rodzaje żeli poliakrylamidowych
według przepisu:
Uwaga! Roztwory dodawać wg przedstawionej kolejności.
TEMED  inicjator polimeryzacji, dodawać jako ostatni składnik, bezpośrednio przed
wylaniem mieszaniny między płytki !
72
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Żel separujący
ODCZYNNIK Żel 10% Żel 10% Żel 12% Żel 13,8% Żel 15%
(8 ml) (8 ml) z (8 ml) (8 ml) (8 ml)
edestynÄ…
H2O 3,1 ml 2,3 ml 2,6 ml 2,2 ml 1,8 ml
30% akrylamid + 1% bisakrylamid 2,7 ml 2,7 ml 3,2 ml 3,6 ml 4,0 ml
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml
10% APS 80 źl 80 źl 80 źl 80 źl 80 źl
1% edestyna - 0,8 ml - - -
TEMED 8 źl 8 źl 8 źl 8 źl 8 źl
Żel zagęszczający
ODCZYNNIK na 2,5 ml żelu na 5,0 ml żelu
H2O 1,3 ml 2,6 ml
30% akrylamid + 1% bisakrylamid 0,5 ml 1,0 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 0,625 ml 1,25 ml
10% APS 25 źl 50 źl
TEMED 2,5 źl 5 źl
Polimeryzację żelu wykonać między przygotowanymi płytkami szklanymi, zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia.
Próbki do analizy przygotować w następujący sposób: do każdej probówki
zawierającej analizowane białka lub wzorce białkowe (1 20źg białka w objętości 30źl) dodać
po 10źl 30% sacharozy i 1źl 1% błękitu bromofenolowego. Dokładnie wymieszać i bez
ogrzewania używać do doświadczeń..
Płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakrylamidowym umieścić w aparacie do
elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym. Przygotowane próbki ostrożnie
nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym. Podłączyć elektrody do zasilacza. Rozdział
elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 120 V tak długo, aż barwnik przesunie się do
73
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
końca żelu separującego. Wyłączyć zasilacz, wyjąć płytki z żelem, a następnie przeprowadzić
kolejno barwienie i odbarwianie żelu.
Elektroforeza w warunkach denaturujÄ…cych (SDS-PAGE)
Materiały i odczynniki
1. 30% roztwór akrylamidu + 0,8% roztwór bisakrylamidu
2. 1,5M roztwór Tris - HCl pH 8,8
3. 0,5M roztwór Tris - HCl pH 6,8
4. 10% roztwór SDS
5. 10% roztwór APS
6. TEMED
7. Bufor próbkowy (4x stężony) :
1,25M roztwór Tris-HCl pH 6,8 0,5ml
Glicerol 1,0ml
10% roztwór SDS 2,0ml
DTT 154mg
H2O 1,3ml
1% roztwór błękitu bromofenolowego 200źl
8. Bufor elektrodowy:
Glicyna 14,4g
Tris 3,0g
SDS 1,0g
uzupełnić wodą do 1000ml
9. Wzorce białkowe
10. Zestaw do elektroforezy białek
Przygotowanie żelu i próbek białkowych
Umyte i odtłuszczone specjalne płytki szklane do elektroforezy złożyć zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia. Przygotować żel poliakrylamidowy według
przepisu:
Uwaga! Roztwory dodawać wg przedstawionej kolejności.
74
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
TEMED  inicjator polimeryzacji, dodawać jako ostatni składnik, bezpośrednio przed
wylaniem mieszaniny między płytki !
Żel separujący
ODCZYNNIK Żel 10% Żel 12% Żel 13,8% Żel 15%
(8 ml) (8 ml) (8 ml) (8 ml)
H2O 3,1 ml 2,6 ml 2,2 ml 1,8 ml
30% akrylamid + 1%bisakrylamid 2,7 ml 3,2 ml 3,6 ml 4,0 ml
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml
10% SDS 80 źl 80 źl 80 źl 80 źl
10% APS 80 źl 80 źl 80 źl 80 źl
TEMED 8 źl 8 źl 8 źl 8 źl
Żel zagęszczający
ODCZYNNIK na 2,5 ml żelu na 5,0 ml żelu
H2O 1,3 ml 2,6 ml
30% akrylamid + 1%bisakrylamid 0,5 ml 1,0 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 0,625 ml 1,25 ml
10% SDS 25 źl 50 źl
10% APS 25 źl 50 źl
TEMED 2,5 źl 5 źl
Polimeryzację żelu wykonać między przygotowanymi płytkami szklanymi, zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia .
Próbki do analizy przygotować w następujący sposób: do każdej probówki
zawierającej analizowane białka lub wzorce białkowe (1-30 źg białka w objętości 30 źl)
dodać po 10 źl buforu próbkowego i wymieszać. Następnie, próbki ogrzewać przez 3 min.
w temp. 900C. Bufor próbkowy zawierający SDS i DTT niszczy strukturę natywną białek
w podwyższonej temperaturze.
75
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakrylamidowym umieścić w aparacie do
elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym. Przygotowane próbki białkowe
ostrożnie nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym. Rozdział prowadzić pod napięciem
150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Wyłączyć zasilacz,
wyjąć płytki z żelem do wybarwienia .
Barwienie białek po elektroforezie
Celem uwidocznienia oraz identyfikacji rozdzielonych prążków białkowych, żel
poliakrylamidowy po elektroforezie poddaje się barwieniu. Najczęściej stosuje się tu roztwór
barwnika Coomassie lub barwienie metodÄ… srebrowÄ… .
A. Barwienie błękitem Coomassie
Odczynniki
Mieszanina barwiÄ…ca:
Metanol 400 ml
Kwas octowy 100 ml
H2O 500 ml
Błękit Coomassie 2,5 g
Odbarwiacz:
Metanol 400 ml
Kwas octowy 100 ml
H2O 500 ml
Wykonanie ćwiczenia
Wyjęty żel poliakrylamidowy umieścić w roztworze barwnika na okres około
15-30 min. Po tym czasie, zlać barwnik, żel przepłukać wodą a następnie odbarwiać go
roztworem odbarwiającym tak długo, aż widoczne staną się rozdzielone prążki białka. Po
wybarwieniu żel wysuszyć. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków
białkowych zawierających około 0,1 źg białka.
76
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
B. Barwienie srebrem
Jest to metoda 10-100 razy czulsza od metody barwienia białek błękitem Coomassie.
W metodzie srebrowej większość białek ulega zabarwieniu na kolor czarny lub brązowy.
Lipoproteiny wybarwiajÄ… siÄ™ na niebiesko, a glikoproteiny na brÄ…zowo lub czerwono.
METODA I
Odczynniki
Nr 1. 10% roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA)
Nr 2. 2% roztwór błękitu Coomassie G - 250
Nr 3. Roztwór do barwienia koloidalnego:
(NH4)2SO4 70 g
85% H3PO4 23,6 ml
Metanol 200 ml
uzupełnić wodą do 950 ml
Nr 4. 0,2 mM roztwór DTT: 10 źl 2M DTT w 100 ml H2O
Nr 5. 0,1% roztwór AgNO3: 50 mg AgNO3 w 50 ml H2O
Nr 6. 3% roztwór Na2CO3 + 0,018% HCHO: 7,5 g Na2CO3
125 źl 37% HCHO w 250 ml H2O
Nr 7. 20% kwas cytrynowy: 5 g kw. cytrynowego w 25 ml H2O
Uwaga! Odczynniki nr 4, 5, 6 przygotować bezpośrednio przed użyciem. Barwienie
wykonywać w kuwecie przeznaczonej wyłącznie do tego celu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie utrwalać przez 1 godz. w 50ml 10% TCA .
2. Płukać 3 x 5 min w 100 ml wody destylowanej.
3.Barwić żel przez 1godz. w 50 ml roztworu do barwienia koloidalnego, zawierającego
2,5 ml 2% błękitu Coomassie.
4. Płukać 3 x 5 min. w 100 ml wody destylowanej.
5. Płukać 10 min. w 50 ml wody destylowanej, w gorącej łaz
ni wodnej stale mieszajÄ…c.
6. Dodać 50 ml 0,2M DTT i mieszać przez następne10 min. w gorącej łaz
ni wodnej.
7. Przepłukać żel w 100 ml wody destylowanej.
8. Barwić w 50 ml 0,1% AgNO3 w gorącej łaz
ni wodnej przez 10 min. stale mieszajÄ…c.
9. Przepłukać żel 100 ml wody destylowanej.
77
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
10. Dodać 50ml roztworu wywoływacza barwy (odczynnik nr 6) na około 30 sek., następnie
zlać go i powtórnie dodać 50 ml świeżego wywoływacza. Całość dokładnie mieszać. Z chwilą
pojawienia się pierwszych prążków białkowych dodać pozostałą porcję wywoływacza i
całość mieszać do momentu pojawienia się wyraz
nych prążków białkowych.
11. Zatrzymać barwienie przez dodanie 25 ml 20% kw. cytrynowego (odczynnik nr 7).
METODA II
Odczynniki
1. Roztwór A (50% metanol, 10% kw. octowy)
2. 30% etanol
3. Roztwór B (20 mg tiosiarczanu sodu na 100 ml H2O)
4. Roztwór C ( 5 ml 25% glutaraldehydu + 95 ml H2O)
5. Roztwór D (200 mg AgNO3 + 75 źl 37% formaldehydu + 100 ml H2O)
6. Roztwór E (6g Na2CO3 + 50 źl 37% formaldehydu + 200 źl tiosiarczanu z wyjść. r-ru 20
mg na 10 ml H2O  dopełnić wodą do 100 ml)
Uwaga! Roztwory B, C, D i E przygotować bezpośrednio przed użyciem. Barwienie
wykonywać w kuwecie przeznaczonej wyłącznie do tego celu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie utrwalać przez 3 x 1 godz. lub przez noc w
100 ml roztworu A.
2. Dodać 100 ml 30% etanolu i mieszać przez 1 godz.
3. Dodać 100 ml roztworu B i mieszać przez 1 min.
4. Dodać 100 ml roztworu C i mieszać przez 30 min.
5. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.
6. Barwić w 100 ml roztworu D, stale mieszając przez 20 min.
7. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.
8. Dodać 100 ml roztworu E (wywoływacza barwy) i mieszać do momentu pojawienia
siÄ™ wyraz
nych prążków białkowych.
9. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.
10. Zatrzymać barwienie przez dodanie 100 ml roztworu A na 10 min.
11. Przepłukać żel wodą i wysuszyć.
78
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
ILOÅšCIOWE OZNACZANIE BIAA
KA
METODY SPEKTROFOTOMETRYCZNE
Białka charakteryzują się zdolnością absorpcji promieniowania ultrafioletowego,
której maksimum przypada na fale o długości 280nm oraz 235nm. Wiąże się to z obecnością
aminokwasów aromatycznych (tyrozyna, tryptofan) oraz wiązań peptydowych w łańcuchu
polipeptydowym. Na wartość absorpcji mogą wpływać zanieczyszczenia kwasami
nukleinowymi, dla których maksimum absorpcji promieni UV przypada na fale o długości
260nm.
Metoda Beavena i Holidaya
Zasada metody polega na spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o
długości 280 nm oraz 260 nm, przez jednocentymetrową warstwę badanego roztworu białka.
Uzyskane wartości podstawia się do wzoru i oblicza stężenie białka w mg/ml:
Cbiałka(mg/ml) = 1,55 A280 - 0,76 A260
Metoda ta obarczona jest pewnym błędem, wynikającym z różnej zawartości
aminokwasów aromatycznych w różnych białkach oraz zanieczyszczeń kwasami
nukleinowymi.
Metoda Whitakera i Granuma
Jest to metoda spektrofotometrycznego oznaczenia stężenia białka, w której wykonuje
się pomiar absorpcji promieni UV o długości fali 280 nm oraz 235 nm. Otrzymane wartości
absorpcji podstawia się do wzoru i oblicza stężenie białka w mg/ml.
A235-A280
C białka(mg/ml) =
2,51
W oznaczeniach stężenia białka tą metodą nie przeszkadza obecność kwasów
nukleinowych, dla których wartość absorpcji fal świetlnych o długości 235 nm i 280 nm jest
taka sama.
79
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Odczynniki
Roztwory badanych białek.
Wykonanie ćwiczenia
Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany
roztwór białka przy trzech długościach fal 235 nm, 260 nm oraz 280 nm. Pomiar wykonać
względem próby kontrolnej (bufor lub H2O dest. bez białka). Jeśli zaistnieje konieczność,
(tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę białka rozcieńczyć, a następnie
uwzględnić to przy obliczaniu jego stężenia. Znając wartość absorpcji (A) obliczyć stężenie
białka według podanych wyżej wzorów.
METODA KOLORYMETRYCZNA
Metoda Bradford
Metoda ta pozwala na szybkie oznaczenie stężenia białka w roztworze. W metodzie
Bradford wykorzystywana jest zdolność białka do tworzenia kompleksu z barwnikiem
zwanym błękitem Coomassie (Coomassie Brilliant Blue). Błękit Coomassie
w środowisku kwaśnym posiada zabarwienie brunatne, które zmienia się na błękitne w reakcji
z białkiem. Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia białka. Absorpcję powstałego
kompleksu barwnego odczytuje się w zakresie światła widzialnego przy długości fali 595 nm.
Odczynniki
1. Odczynnik Bradford (preparat handlowy)
2. Roztwór wzorcowy albuminy wołowej o stężeniu 100źg/ml
3. Roztwór badanego białka
Wykonanie ćwiczenia
a) wykreślenie krzywej wzorcowej
Przygotować 8 ponumerowanych probówek, do których odmierzyć (według tabeli)
następujące ilości roztworu białka wzorcowego i wody destylowanej:
80
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Nr probówki 1 2 3 4 5 6 7 8
20 40 80 100 120 160 200 0
Wzorzec albuminowy (źl)
780 760 720 700 680 640 600 800
Woda (źl)
2 4 8 10 12 16 20 0
Ilość białka w próbie (źg)
Do wszystkich probówek dodać po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokładnie wymieszać.
Po upływie 5 min, zmierzyć absorpcję w kolorymetrze przy długości fali 595nm.
Pomiarów dokonywać względem próby kontrolnej (nr 8). Wykreślić krzywą wzorcową
odkładając na osi odciętych (X) stężenia białka, a na osi rzędnych (Y) wartości absorpcji.
b) wykonanie pomiaru w badanej próbce białka.
Do dwóch probówek odmierzyć 2  20 źl badanego roztworu białka (zgodnie z zaleceniami
prowadzącego ćwiczenia) i uzupełnić wodą do objętości 0,8 ml. Do wszystkich probówek
dodać po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokładnie wymieszać. Po upływie 5 min, zmierzyć
absorpcję w kolorymetrze przy długości fali 595 nm.
Stężenie białka odczytać z przygotowanej krzywej wzorcowej.
ILOŚCIOWE OZNACZANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH
METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA
Kwasy nukleinowe charakteryzują się zdolnością absorpcji promieniowania
ultrafioletowego, której maksimum przypada na fale o długości 260 nm. Na wartość absorpcji
mogą wpływać zanieczyszczenia białkami, dla których maksimum absorpcji promieni UV
przypada na fale o długości 280 nm i 235 nm. Zasada metody polega na
spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o długości 260 nm, przez
jednocentymetrowÄ… warstwÄ™ badanego roztworu kwasu nukleinowego i obliczeniu jego
stężenia wiedząc że, absorpcja (A) o wartości A = 1 odpowiada około 50 źg/ml
dwuniciowego dsDNA, około 33 źg/ml jednoniciowego ssDNA oraz około 40 źg/ml
jednoniciowego ssRNA i 20 -30 źg/ml oligonukleotydów.
81
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Przykład oznaczenia stężenia RNA
Objętość próbki RNA: 100 źl
Rozcieńczenie: 10 źl próbki RNA + 490 źl dest. wody (rozcieńczenie 1/50)
A260 rozcieńczonej próbki = 0.55
Stężenie RNA = 40 źg/ml x A260 x rozcieńczenie
= 40 źg/ml x 0.55 x 50
= 1100 źg/ml
Całkowita ilość RNA = stężenie x objętość próbki w ml
= 1100 źg/ml x 0,1
= 110 źg RNA
Ponieważ tak roztwory DNA jak i RNA częściowo absorbują światło przy długości fali
280nm, a roztwory białek częściowo pochłaniają światło również przy długości fali 260 nm,
stosunek odczytu przy długości fali 260 nm i 280 nm (A260/A280) informuje o czystości
kwasów nukleinowych. W przypadku dobrej izolacji wartość A260/A280 dla DNA wynosi 1,8
 2,0, a dla RNA 1,9  2,1.
Odczynniki
Roztwory badanych kwasów nukleinowych.
Wykonanie ćwiczenia
Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany
roztwór kwasu nukleinowego przy dwóch długościach fal 260 nm oraz 280 nm. Pomiar
wykonać względem próby kontrolnej (bufor lub H2O). Jeśli zaistnieje konieczność (tzn.
wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę kwasu nukleinowego rozcieńczyć (najlepiej
wodą), a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jego stężenia. Znając wartość absorpcji (A)
obliczyć czystość i stężenie badanego kwasu nukleinowego.
82
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
ILOŚCIOWE OZNACZANIE RYBOSOMÓW
Stężenie rybosomów w zawiesinie oznacza się spektrofotometrycznie przez pomiar
absorpcji przy długości fali 260 nm. Otrzymaną wartość absorpcji podstawia się do wzoru i
oblicza stężenie rybosomów w mg/ml.
C rybosomów w mg/ml = ( A260 X rozcieńczenie ) : 11
Odczynniki
Roztwory badanych rybosomów
Wykonanie ćwiczenia
Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany
roztwór rybosomów przy długości fali 260 nm. Pomiar wykonać względem próby kontrolnej
(bufor lub H2O). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy
próbkę rybosomów rozcieńczyć (zwykle konieczne jest rozcieńczenie 1000 lub 2000-krotne).
Znając wartość absorpcji (A) obliczyć stężenie rybosomów według podanego wyżej wzoru.
WYSALANIE BIAA
EK
Dzięki obecności grup polarnych w białkach, następuje wiązanie cząsteczek wody,
które wytwarzają tzw. płaszcz hydratacyjny. Dodanie niektórych soli (np. siarczanu amonu
bÄ…dz
siarczanu magnezu) do roztworu białka, powoduje jego odwodnienie, co prowadzi do
wytrącenia białka z roztworu. Proces ten nosi nazwę wysalania. Wysolone białko można
ponownie rozpuścić w wodzie lub w odpowiednim buforze bez straty jego właściwości
biologicznych. Dzięki temu wysalanie białek stosuje się często w praktyce jako jeden
z etapów ich łagodnego wydzielania z roztworu. Aby uzyskać określony stopień nasycenia
siarczanem amonu, należy dokładnie znać objętość badanego roztworu i na podstawie
załączonej tabeli (patrz strona 54) odważyć potrzebną ilość gramów soli. Podczas procedury
wysalania białek ważna jest znajomość temperatury roztworu. Wytrącone białka obserwuje
się jako bezpostaciowe lub kłaczkowate osady zawierające pewną ilość soli, która wpływa
ujemnie na pomiar stężenia białka. Usunięcie soli z roztworu białka możliwe jest poprzez
dializÄ™.
83
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
DIALIZA BIAA
EK
Metoda dializy pozwala m.in. na usunięcie soli i innych związków
niskocząsteczkowych z roztworu białka oraz zmianę buforu w którym białko jest zawieszone.
Materiały i odczynniki
2% roztwór węglanu sodu
0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0
Rozwór badanego białka
Roztwór dializacyjny (zgodnie z zaleceniami prowadzącego)
Celulozowe  węże do dializy
Zaciski do  węży dializacyjnych
Wykonanie ćwiczenia
1. Uciąć potrzebną długość  węża dializacyjnego i gotować przez 10 minut w 200 ml
2% roztworu węglanu sodu z dodatkiem 1 mM EDTA w celu usunięcia metali
ciężkich i siarczków. Długość  węża obliczyć następująco:
- długość dializowana (mm) = [poj.(w źl) x 3,2] / [szer.  węża 2 (w mm2)]
- dodać 10 % długości dializowanej
- dodać 4 cm na zaciski
2. Po oziębieniu, dokładnie przepłukać  węże wodą destylowaną (tak przygotowane
 węże można przechowywać w wodzie z dodatkiem substancji konserwujących, np.
NaN3 w 40C).
3. Jeden koniec przygotowanego  węża zamknąć zaciskiem tak, aby wystawał on co
najmniej na 1 cm. Otrzymany woreczek wypełnić wodą destylowaną w celu
sprawdzenia jego szczelności.
4. Po wylaniu wody, napełnić woreczek roztworem białka przygotowanym do dializy.
Z niewypełnionej części woreczka usunąć powietrze ściskając delikatnie woreczek
nad płynem.
5. Zamknąć zaciskiem drugi koniec  węża i umieścić woreczek w roztworze
dializacyjnym. Dializę należy prowadzić, przy stałym mieszaniu, w temperaturze 40C.
6. Roztwór dializacyjny powinien być zmieniany co najmniej 3 razy w trakcie trwania
dializy. Zaleca się wymianę po upływie 2-4 godzin, 6-8 godzin i 10-14 godzin.
84
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Całkowita objętość roztworu powinna być ok. 100 razy większa niż objętość próbki
białkowej.
7. Po zakończeniu dializy, zdjąć jeden zacisk, otworzyć woreczek i usunąć roztwór
za pomocÄ… pipety.
85
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
TABELA WYSYCEC
(NH4)2SO4 (temp. pokojowa)
Końcowe nasycenie siarczanem amonu w %
10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100
Nasycenie
poczÄ…tkowe
Ilość gramów siarczanu amonu, którą należy dodać do 1 dm3 roztworu
%
56 114 144 176 196 209 243 727 313 351 390 430 472 516 561 662 767
0
57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694
10
29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 619
20
30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583
25
19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546
30
12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522
33
31 63 94 129 164 200 238 278 319 411 506
35
31 63 97 132 168 205 245 285 375 469
40
32 65 99 134 171 210 250 339 431
45
33 66 101 137 176 214 302 392
50
33 67 103 141 179 264 353
55
34 69 105 143 227 314
60
34 70 107 190 275
65
35 72 153 237
70
36 115 198
75
77 157
80
90 79
Uwaga ! Przystępując do wysalania białek w temperaturze 40C należy pomnożyć
wyliczoną z Tabeli ilość gramów siarczanu amonu przez współczynnik 0,92, który
uwzględnia zmniejszoną rozpuszczalność tego związku w niższej temperaturze.
Przykład : Jeżeli procedurę wysalania białka (0% - 50% nasycenia) prowadzimy w temp. 40C,
wówczas na 1 dm3 roztworu biaÅ‚ka należy przygotować odważkÄ™ 288g (313 g × 0,92)
siarczanu amonu. By zwiększyć nasycenie siarczanem amonu od 50% do 100%, należy
odważyć dodatkowo 360g (392 g × 0,92) soli.
86
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
Tabela 1
Symbole wielokrotności i ułamków dziesiętnych
Symbol Określenie Przeliczenie
T Tera- 1012 1 000 000 000 000
G Giga- 109 1 000 000 000
M Mega- 106 1 000 000
k Kilo- 103 1 000
h Hekto- 102 100
dk Deka- 101 10
d Deci- 10-1 0,1
c Centi- 10-2 0,01
m Mili- 10-3 0,001
ź Mikro- 10-6 0,000 001
n Nano- 10-9 0,000 000 001
p Piko- 10-12 0,000 000 000 001
Tabela 2
Przybliżona molowość i ciężar właściwy stężonych kwasów
Związek Procent Molowość Otrzymanie Ciężąr
wagowy M molowego właściwy
roztworu (ml/l)
Kwas azotowy 70 15,7 64 1,42
Kwas fosforowy 85 14,8 68 1,70
Kwas nadchlorowy 60 9,2 109 1,54
Kwas nadchlorowy 70 11,6 86 1,67
Kwas octowy 99,5 17,4 58 1,05
Kwas siarkowy 96 18 56 1,84
Kwas solny 37 12 84 1,19
Tabela 3
Barwy promieniowania widzialnego
Przybliżony zakres Barwa Barwa
długości fali dopełniająca
(mź)
400-450 fioletowa żółtozielona
450-480 niebieska żółta
480-490 zielononiebieska pomarańczowa
490-500 niebieskozielona czerwona
500-560 zielona purpurowa
560-575 żółtozielona fioletowa
575-590 żółta niebieska
590-625 pomarańczowa zielononiebieska
625-750 czerwona niebieskozielona
87
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW
APS - nadsiarczan amonowy (ang. Ammonium Persulphate)
²-MET - ²-merkaptoetanol (ang. ²-Mercaptoethanol)
DEPC - pirowęglan dietylu (ang. Diethyl Pyrocarbonate)
DMEM - podłoże do hodowli komórkowych (ang. Dulbecco/Vogt modified Eagle s
Minimal Essential Medium)
dsDNA - dwuniciwy DNA (ang. double stranded DNA)
DTT - ditiotreitol (ang. Dithiothreitol)
EDTA - kwas etylenodwuaminoczterooctowy (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid)
HeLa - linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy Henrietty
Lacks (ang. Henrietta Lacks cell)
LB - podłoże do hodowli bakterii (ang. Luria-Bertani medium)
NIH 3T3 - linia komórkowa fibroblastów mysich (ang. National Institute of Health,
3-day Transfer, inoculum 3 x 105 cells)
PAGE - elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (ang. Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
PMSF - sulfofluorek fenylometanu (ang. Phenylmethylsulphonyl Fluoride)
RPMI - podłoże do hodowli komórkowych (ang. Roswell Park Memorial Institute
medium)
SD - podłoże do hodowli drożdży (ang. synthetic defined)
SDS - sól sodowa siarczanu dodecylu (ang. Sodium Dodecyl Sulphate)
SDS-PAGE - elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS (ang. Sodium
Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
ssDNA - jednoniciowy DNA (ang. single stranded DNA)
TAE - bufor do elektroforezy DNA/RNA (ang. Tris- Acetate-EDTA)
TCA - kwas trójchlorooctowy (ang. Trichloroacetic Acid)
TEMED - N,N,N ,N -czterometyletylenodiamina (ang. N,N,N ,N -
tetramethylethylenediamine)
Tris - trójhydroksymetyloaminometan; 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol
UV - promieniowanie ultrafioletowe (ang. Ultraviolet )
88
 Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2012
LITERATURA
1. Alberts B. i inni, Podstawy biologii komórki, PWN, Warszawa, 2005
2. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa, 2005
3. Brown T.A., Genomy, PWN, Warszawa, 2009
4. KÅ‚yszejko-Stefanowicz L., Cytobiochemia, PWN, Warszawa, 2002
5. Lewin B., Genes VII, Oxford University Press, 2000
6. Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001
7. Tuner P.C. i inni, Krótkie wykłady. Biologia molekularna, PWN, Warszawa, 2007
8. Węgleński P., Genetyka molekularna, PWN, Warszawa, 2006
9. Prace oryginalne i artykuły przeglądowe wskazane przez prowadzącego ćwiczenia.
89
Tematy ćwiczeń z Biologii Molekularnej
dla II roku Biologii
1. Charakterystyka chemiczna kwasów nukleinowych.
2. Izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae
3. Amplifikacja genów kodujących rybosomowe białka P1A i P1B
drożdży Saccharomyces cerevisiae
4. Transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych
i drożdżowych
5. Izolacja RNA z komórek drożdży
6. Elektroforetyczna analiza RNA
7. Badanie wpływu inhibitorów translacji na wzrost komórek drożdżowych.
8. Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych.
9. Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae (2 ćw.)
(koniugacja i sporulacja)
10. Identyfikacja inhibitora trypsyny metodÄ… elektroforezy w warunkach
niedenaturujÄ…cych.
11. Transfer genów do komórek ssaczych  transfekcja (2 ćw.)