Metody biologii molekularnej
w diagnostyce medycznej
Mgr inż. Kamila Gala
Klinika Immunologii, Transplantologii
i Chorób Wewnętrznych
Biologia
molekularna
Definicja
Nauka, która stara się wyjaśnić zależności między
Nauka, która stara sięwyjaśnićzależności między
strukturą i funkcją biologicznych cząsteczek oraz
sposobów wpływu tych zależności na przebieg
i regulację procesów biochemicznych
Przedmiot zainteresowania
Makrocząsteczki: DNA, RNA i białka
Procesy: replikacja, transkrypcja, translacja
DNA-
kwas deoksyrybonukleinowy
Jest nośnikiem informacji genetycznej
Liczba kopii genu w genomowym DNA jest stała
Sekwencja DNA to kolejność występowania zasad azotowych: A, G, C i T
w cząsteczce DNA
Wyróżniamy sekwencje kodujące  eksony i nie kodujące-introny
W sekwencjach zawarta jest informacja genetyczna
Rys.1. Elementy DNA wchodzące w skład genu
Dwuniciowa helisa DNA
4 rodzaje zasad azotowych: adenina-A,
guanina-G, tymina-T i cytozyna-C
Nukleozyd: zasada azotowa + cukier
(deoksyryboza)
Nukleotyd: zasada azotowa + cukier +
fosforan
W 1953 r. Watson i Crick opracowali
trójwymiarowy model struktury DNA tzw.
trójwymiarowy model struktury DNA tzw.
helisy:
Zasady są skierowane do wnętrza
Rdzeń cukrowo-fosforanowy jest na zewnątrz
Nici utrzymywane są przez wiązania
wodorowe, A:T, G:C
A
ączenie się zasad w pary to tworzenie
komplementarnych par zasad
Dwie nici DNA są owinięte wokół siebie
Rys.2. Model helisy DNA
RNA
kwas rybonukleinowy
Jest polimerem złożonym z
rybonukleotydów połączonych
wiązaniami fosfodiestrowymi
4 rodzaje zasad azotowych:
adenina-A, uracyl-U, guanina-G
adenina-A, uracyl-U, guanina-G
i cytozyna-C
Cukier to ryboza
Cząsteczki RNA są jednoniciowe,
Tylko na pewnych odcinkach
tworzone są wewnątrzcząsteczkowe
regiony dwuniciowe
Rys. 3. Struktura RNA
RNA
Cząsteczki mRNA reprezentują geny, które
są aktywne w komórce
Poszczególne tkanki i komórki różnią się
jakościowym i ilościowym składem puli
cząsteczek mRNA
cząsteczek mRNA
Liczba kopii genu przepisanego na mRNA
zależy od aktywności tego genu w komórce
Dojrzałe cząsteczki mRNA zawierają ciągłą
sekwencję kodującą
Cząsteczki mRNA są nietrwałe
Co to jest ekspresja genu?
Wszystkie geny w komórce zapisane są
w postaci DNA
Aktywne geny zostają przepisane
z DNA na mRNA (transkrypcja)
Informacja zawarta w mRNA zostaje
odkodowana i na tej podstawie zostaje
utworzony łańcuch polipeptydowy >>> białko
(translacja)
DNA transkrypcja mRNA translacja Białko
y
ródłem kwasów nukleinowych mogą być
komórki prawie wszystkich tkanek:
Krew obwodowa:
zabieg pobrania jest mało inwazyjny,
z leukocytów uzyskuje się dużo DNA/RNA
Wymaz z jamy ustnej:
do prostych testów genetycznych
Wycinek skóry i założenie hodowli fibroblastów:
dla szczegółowych i długotrwałych badań
Złuszczone komórki płodu pobierane podczas amniocentezy:
Złuszczone komórki płodu pobierane podczas amniocentezy:
do badań prenatalnych
Komórki guza, szpik kostny:
do badań onkologicznych
Płyn ustrojowy, surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, plwocina,
popłuczyny oskrzelowe, bioptaty tkankowe:
do wykrywania czynników zakaz
nych
Nasienie:
kryminalistyka, ustalanie ojcostwa
Izolacja DNA
przygotowanie materiału biologicznego
dezintegracja i liza komórek
inaktywacja nukleaz komórkowych, za pomocą
np. proteinazy K
oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych
komponentów komórkowych
zagęszczenie preparatu DNA
usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych
Rys.4.Schemat izolacji DNA
Obecnie stosuje się wiele metod
izolacji, w tym także izolacje
automatyczne
Rys.5. EasyMAG aparat do automatycznej izolacji
kwasów nukleinowych
Metody biologii molekularnej
Reakcja łańcuchowej polimerazy- PCR
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Sekwencjonowanie
Mikromacierze
A
ańcuchowa reakcja polimerazy -PCR
Umożliwia uzyskanie dużej
liczby kopii danej sekwencji
DNA
Konieczna jest znajomość
sekwencji krótkich odcinków
DNA po każdej stronie
sekwencji przeznaczonej do
powielenia>>> startery
powielenia>>> startery
Etapy cyklu reakcji PCR:
denaturacja, hybrydyzacja i
elongacja
Liczba cykli jest uzależniona
od wymaganej krotności
powielenia wyjściowego DNA
Rys.6. Schemat zasady PCR
RT-PCR
reakcja odwrotnej transkrypcji
RNA nie można bezpośrednio powielać metodą PCR
Cząsteczki RNA przepisywane są na DNA w reakcji
katalizowanej przez enzym-odwrotną transkryptazę
katalizowanej przez enzym-odwrotną transkryptazę
W wyniku reakcji powstają cząsteczki DNA, tzw.
cDNA, które mogą być użyte w reakcji PCR
Wykorzystywanie: badanie ekspresji genów
Ocena wyników PCR na żelu
agarozowym
W reakcji PCR powielane są krótkie odcinki
DNA
Po jej zakończeniu należy sprawdzić czy
powstał produkt o przewidywanej długości
Do oceny wyników stosuje się elektroforezę
na żelu agarozowym
Rys.7.Aparat do elektroforezy
DNA jest ujemnie naładowane
DNA jest ujemnie naładowane
i wędruje w żelu od ujemnej do dodatniej
M 1 2 3
elektrody
Szybkość przemieszczania się DNA zależy
od długości powielonych odcinków
Żel agarozowy zawiera substancję, która
wbudowuje się w DNA i fluoryzuje
w świetle UV
Cząsteczki DNA widoczne są jako świecące
prążki
Rys.8.Zdjęcie żelu agarozowego po
rozdziale elektroforetycznym
Analiza za pomocą reakcji PCR
1. Izolacja materiału, np. DNA z krwi
2. Sporządzenie mieszaniny reakcyjnej, np.
MasterMix+ startery specyficzne dla
fragmentu szukanego genu +DNA badane
Rys. 9. Schemat izolacji DNA z krwi
4. Rozdział produktu reakcji PCR 3. Reakcja PCR w termocyklerze z
na żelu agarozowym i wizualizacja określoną ilością cykli
w świetle UV
Rys.11. Wynik rozdziału elektroforetycznego
Rys.10.Zdjęcie termocyklera
produktu PCR
Metody hybrydyzacji
Wykorzystują zdolność łączenia się
jednoniciowych cząsteczek kwasów
nukleinowych o całkowicie lub
częściowo komplementarnej sekwencji
w struktury dwuniciowe
Jedna z nici reprezentuje badany kwas
nukleinowy, a druga pełni funkcje
znakowanej sondy
znakowanej sondy
Hybrydyzacja Southerna
Wykrywanie swoistego fragmentu DNA
przez sondę DNA znakowaną izotopem
promieniotwórczym lub barwnikiem
fluorescencencyjnym
Hybrydyzację Notherna
Rozdział cząsteczek mRNA i badanie
ekspresji genów
Rys.12. Schemat metody Southern blot
Sekwencjonowanie
Pozwala ustalić dokładną sekwencję
nukleotydów w badanym DNA i wykryć
mutacje punktowe
Na podstawie sekwencji istnieje możliwość
przewidzenia kolejności aminokwasów
przewidzenia kolejności aminokwasów
w białku, które jest kodowane przez dany gen
Dwie metody: chemiczna
enzymatyczna
Obecnie DNA jest sekwencjonowany
automatycznie
Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA
Starter komplementarny do matrycy DNA
GCCTAGGGTTTGCGCTAC
5 3
5
3
CGGATCCCAAACGCGATGCAGGCATGCAATGACC
ddATP
dATP
+
ddGTP
dGTP
ddTTP
dTTP
ddCTP
dCTP
Terminatory znakowane
fluorescencyjnie
Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA
Elektroforeza na żelu
Rozdział produktów reakcji w automatycznym
sekwenatorze
GTCCGTACGTTACTGddG
GTCCGTACGTTACTddG
GTCCGTACGTTACddT
GTCCGTACGTTAddC
GTCCGTACGTTddA
GTCCGTACGTddT

GTCCGTACGddT
GTCCGTACddG
GTCCGTAddC
GTCCGTddA
GTCCGddT
GTCCddG
GTCddC
GTddC
GddT
ddG
Mikromacierze
Niewielkie szklane lub plastikowe płytki
Na płytki nanoszone są sondy (kilka tysięcy)
Każda sonda jest specyficzna tylko dla
jednego genu
Rys.13. Płytki do mikromacierzy
Na płytki nanoszone jest badane cDNA
lub mRNA wyznakowane np.
fluorescencyjnie
fluorescencyjnie
Następuje wiązanie badanego cDNA lub
mRNA do komplementarnych sond
Analiza wyników za pomocą
odpowiedniego czytnika i komputera
Możliwa jest analiza praktycznie całego
genomu badanego organizmu
Rys.14. Wynik analizy
za pomocą mikromacierzy
Zastosowanie mikromacierzy
w medycynie:
Poznawanie mechanizmów chorobotwórczych, np. wykorzystując
mikromacierze wykryto m.in. geny związane ze stwardnieniem rozsianym, ciężką dziecięcą
dystrofią siatkówki
Identyfikacja wskaz
ników pozwalających na ocenę ryzyka rozwoju chorób
Określenie nowych obiektów, na których powinno koncentrować się
Określenie nowych obiektów, na których powinno koncentrować się
działanie leków
działanie leków
Postawienie dokładniejszej diagnozy i dostosowanie leczenia do
indywidualnego przypadku pacjenta
Diagnostyka chorób zakaz
nych, np. detekcja i identyfikacja rodzaju wirusa,
wykrywanie genów odporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych
Onkologia, np. odróżnienie łagodnej formy raka prostaty od formy
złośliwej
Diagnostyka
mikrobiologiczna
i wirusologiczna
Wykrywanie DNA lub RNA czynników zakaz
nych:
drobnoustrojów, które wolno rosną lub nie rozwijają się
w hodowli, np. Mycobacterium tuberculosis
w hodowli, np. Mycobacterium tuberculosis
zakażeń wirusami, np. HBV, HCV, CMV, HIV
zakażeń bakteryjnych, np. Helicobacter pylori
Identyfikacja podtypów drobnoustroju/wirusa
genotypowanie wirusa HCV
Ocena masywności zakażenia
oznaczenie poziomu wiremii przy zakażeniu wirusowym
i monitorowanie efektywności leczenia
Diagnostyka onkologiczna
Wykrywanie swoistych dla danego nowotworu
zmian genetycznych
Typ zaburzeń genetycznych w komórkach nowotworu ważnym
czynnikiem prognostycznym >>> wybór schematu leczenia
PCR pozwala wykryć komórki nowotworowe nie zniszczone w
trakcie leczenia
trakcie leczenia
Ocena właściwości komórek nowotworowych
Badanie ekspresji genów przez komórki nowotworowe,
np. nowotwory w których dochodzi do ekspresji genów MRP mają
zdolność usuwania leków przeciwnowotworowych
Badanie predyspozycji genetycznej do
zachorowania na chorobę genetyczną
Diagnostyka genetyczna
Diagnostyka genetyczna
Wykrywanie wrodzonych mutacji u chorych
podejrzanych o chorobę uwarunkowaną genetycznie
Wywiad chorobowy i rodzinny
Badanie kliniczne
Badania dodatkowe, np. aktywność enzymów lizosomalnych
Ustalenie genu lub genów, które mogą być zmutowane u chorego
Badanie najczęstszych i dobrze scharakteryzowanych mutacji za
pomocą prostych testów diagnostycznych, a jeśli wynik negatywny:
Sekwencjonowanie całego genu w poszukiwaniu rzadszych mutacji
Potwierdzenie chorobotwórcze charakteru wykrytej mutacji
Ustalenie heterozygotyczności
i poradnictwo genetyczne dla zdrowych
członków rodziny
Wykonywanie badań u zdrowych osób, które
są zagrożone rozwojem jakiejś choroby ze względu na
obciążający wywiad rodzinny mają sens tylko wtedy,
obciążający wywiad rodzinny mają sens tylko wtedy,
gdy otrzymanie dodatniego wyniku pozwala podjąć
skuteczne działania zapobiegające wystąpieniu
choroby, np.
niewskazane jest wykonywanie badań w rodzinie
chorego na chorobę Huntingtona
Wykrywanie mutacji chorobotwórczych
w okresie przedobjawowym
Stwierdzenie mutacji u zdrowej osoby
z obciążającym wywiadem rodzinnym, np.
w kierunku raka sutka i raka jajnika
w kierunku raka sutka i raka jajnika
pozwala zaplanować wcześniejsze
i częstsze badania przesiewowe lub
wdrożyć farmakologiczne lub chirurgiczne
leczenie
Badania prenatalne umożliwiają wczesne wykrycie
chorób płodu uwarunkowanych genetycznie:
MUKOWISCYDOZA
Choroba metaboliczna,
Uszkodzony chromosom 7
FENYLOKETONURIA
Dziedziczna choroba przemiany materii
Rozwój choroby udało się zahamować-noworodki są rutynowo badane
Wczesne wykrycie umożliwia wprowadzenie specjalnej diety, co minimalizuje skutki
choroby
HEMOFILIA
Niedostateczna krzepliwość krwi
Choroba sprzężona z płcią
DYSTROFIA MI
ŚNIOWA DUCHENNE'A
Postępujący zanik mięśni. Zapadają na nią jedynie mężczyz
ni
Odpowiedzialny za tę chorobę jest gen umieszczony w chromosomie X
Choroba występuje w 1 przypadku na 300 żywych urodzeń
ZESPÓA
DOWNA
Choroba genetyczna zbadana do tej pory najlepiej zbadana.
Przyczyną jest nadmiar chromosomów, tzw. trisomia chromosomu 21
Częściej występuje u dzieci kobiet, które rodzą po 35 roku życia
Wykrywanie często występujących polimorfizmów
związanych ze zwiększonym ryzykiem zachorowania
na niektóre choroby
Polimorfizmy nie przesądzają o
rozwoju określonej jednostki
chorobowej, ale modyfikują ryzyko jej
wystąpienia
Np. allele E2, E3, E4 genu APOE
Np. allele E2, E3, E4 genu APOE
Allel E4 genu APOE wiąże się ze
zwiększonym ryzykiem przedwczesnej
choroby wieńcowej, ale na ujawnienie
Rys.15. Blaszka
choroby mają wpływ także inne czynniki miażdżycowa
genetyczne i środowiskowe
Badania genetyczne pomagają wykryć
osoby podatne i rozpocząć działania
profilaktyczne
Podsumowanie
Biologia molekularna jest najprężniej
rozwijającą się dziedziną nauk
biologicznych wywierających wpływ na
inne dziedziny nauki
inne dziedziny nauki
Postępy uzyskiwane w biotechnologii
i biologii molekularnej mogą zatem
posłużyć w celu jak najwcześniejszej
diagnostyki chorób, co jest głównym
wyzwaniem współczesnej medycyny
Dziękuję za uwagę :&
Dziękuję za uwagę:&