MECHANIZMY SWOISTE I NIESWOISTE
Metody oceny chemotaksji,
ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ
fagocytozy.
mgr Magdalena Kujawiak
Zakład Laboratoryjnej
Immunologii Medycznej
Procesy wewnątrzkomórkowe
Utrzymywanie stałego składu środowiska wewnętrznego, pobieranie i
wydalanie substancji. Fagocytoza (gr. phagein - jeść, kytos - komórka)
Typy endocytozy:
Fagocytoza - transport bez ubytków błony,  komórka je
Pinocytoza  transport z ubytkami błony biologicznej,  picie komórkowe"
1) Chemotaksja
F
2) Rozpoznanie i związanie przez komórkę żerną cząsteczki / komórki
a
g
3) Utworzenia fagosomu wewnątrz komórki żernej
o
4) Fuzja fagosomu z lizosomem = fagolizosom
c
y
5) Wewnątrzkomórkowe zabijanie i trawienie obcych cząsteczek
t
o
z
a
Ad1) Chemotaksja cd.
Ad1) Chemotaksja
Chemotaksja  ukierunkowany ruch komórek indukowany gradientem substancji
chemicznej (chemoatraktant, chemotaksyna)
Cz. chemotaktyczne  przyciągają komórki żerne do miejsca reakcji zapalnej
Poprzez receptory w błonie komórkowej czynnik chemotaktyczny powoduje
przemieszczenie się komórki w kierunki wzrastającego stężenia
Główne czynniki chemotaktyczne działające na granulocyty (gł. Neutrofile i
monocyty):
Endogenne: Egzogenne:
" fragmenty C5a i C3a
" formylowane peptydy
" defensyny wytwarzane przez komórki
uwalniane przez bakterie (np.
nabłonkowe i neutrofile
FMLP)
" IL-1, TNF, TGF  ß, IL-8 leukotrien LTB4
" PAF, czÄ…steczki zwiÄ…zane z koagulacjÄ…
(fibrynogen, płytkowy czynnik IV)
" białko C-reaktywne
1
Aktywacja leukocytów Ad2) Rozpoznanie i związanie przez komórkę żerną cząsteczki / komórki
" Komórka żerna przez odpowiednie receptory może rozpoznawać
Aktywacja leukocytów  gdy na powierzchni naczynia krwionośnego pojawią się
substancje aktywujące bezpośrednio określone struktury w ścianie komórkowej bakterii, lub
pośrednio pewne czynniki opłaszczające komórkę bakteryjną i
- najważniejsze z nich to chemokiny
ułatwiające fagocytozę.
Chemokiny
" Proces ułatwienia fagocytozy
mogą być aktywnie transportowane przez światło komórek śródłbonka
nazywamy opsonizacją (gr. ópson-
wiążą się z glikoproteinami które są umieszczane na powierzchni kom. środbłonka
gotowy do spożycia), a czynniki
ułatwiające i wzmagające
toczący się leukocyt tocząc się po kom. śródbłonka  wyczuwa
fagocytozÄ™  opsoninami.
najmniejsze zmiany świadczące o procesie zapalnym
-Leukocyt po rozpoznaniu chemokin ulega aktywacji
- zmiany właściwości integryn: z cząsteczek o małym powinowactwie do
ligandów w cząsteczki mogące silnie wiązać z ligandami " Immunofagocytoza  fagocytoza
" Immunofagocytoza
indukowana przez opsoniny
Ad2) Rozpoznanie i związanie przez komórkę żerną cząsteczki / komórki Ad2) Rozpoznanie i związanie przez komórkę żerną cząsteczki / komórki
Ligandy bakteryjne: PAMP (LPS, polisacharyd, Ag X)
Fagocytoza niezależna od opsonin:
Opsoniny (zmieniają napięcie powierzchniowe błony bakteryjnej, ułatwiają
Fagocyt:
pochłanianie bakterii):
" receptory dla ligandów występujących na powierzchni komórek bakteryjnych
" immunoglobuliny IgG anty-X
" białko C-reaktywne
Fagocytoza zachodzi jednak szybciej jeżeli cząstka (bakteria) opłaszczona jest przez
" kolektyny: białko wiążące mannozę (MBL) LEKTYNOFAGOCYTOZA
białka zwane opsoninami   przeznaczona jest do pożarcia .
białka surfaktantu płucnego A i B
Pochłanianie zależne od opsonin: " niektóre białka dopełniacza oraz ich fragmenty powstające w wyniku
Na błonie komórkowej fagocyta występuje receptor dla opsonin opsonina łączy się proteolitycznej degradacji: C3b, iC3b, C4b
ze swoistym receptorem na fagocycie zmiany w cytoszkielecie komórki oblanie
" wiele białek surowiczych (fibronektyna)
bakterii przez cytoplazmę komórki fagocytującej fagocytoza
opsoniny
zopsonizowane
(Ab)
Fagocyt:
bakterie
Ag
" receptory dla białek dopełniacza (CR1, CR3)
" receptor dla fragmentu Fc immunoglobuliny G, głównie dla Fc IgG1 i IgG3
" receptory typu zmiatacze oraz integryny np.. Mac-1 (CD11b/CD18)
CzÄ…steczki PAMP TLR (Toll-like receptors)
TLR Rozpoznawane struktury
wykryte pierwszy raz u muszki owocówki,
najbardziej charakterystyczne struktury drobnoustrojów, selektywnie rozpoznawane
TLR2 peptydoglikan, LPS, LAM,
przez komórki odpowiedzi nieswoistej jako niezbędne do ich rozwoju
występują u ssaków
określane są jako wzorce molekularne związane z patogenami  PAMP (pathogen TLR3 dsRNA
w części cytoplazmatycznej podobne do
associated molecular patterns)
TLR4 LPS, kw. lipotejchojowy
receptora dla IL-1
m.in.: mannany, formylowane peptydy bakteryjne, TLR5 flagellina rzęsek bakterii
w części zewnątrzkomórkowej występują
składniki ściany komórkowej bakterii, DNA bakteryjne
TLR9 niemetylowane oligonukleotydy CpG
domeny bogate w leucynÄ™
zawierajÄ…ce niemetylowane sekwencje CpG, dsRNA
do dziś zidentyfikowano 10 receptorów TLR
wirusów
większość z nich występuje na powierzchni
typowe dla całych grup drobnoustrojów
komórek, ale np. TLR9 występuje w błonie
pęcherzyków cytoplazmatycznych, ulegającej
fuzji z fagolizosomem
rozpoznają różne struktury drobnoustrojów
Receptory PRR
receptory rozpoznające cząsteczki PAMP określane są jako receptory rozpoznające
wzorce - PRR (pattern recognition receptors)
należą tu receptory:
1. wydzielnicze (gł. opsoniny, które po połączeniu z patogenem ułatwiają fagocytozę)
2. powierzchniowe uczestniczące w fagocytozie (na komórkach APC, bezpośrednio wiążą się
z antygenem drobnoustroju, np. receptory zmiatacze, mannozowe)
3. aktywujące komórki (najpowszechniejsze)
2
Ad3) Utworzenie fagosomu wewnątrz komórki żernej
Ad 4) Utworzenie fagolizosomu
" pobieranie cząstek wielkości do ok.300nm
" mogą to być całe komórki
" fagosomy wraz z pochłoniętymi drobnoustrojami
Proces tworzenia fagosomu:
ulegajÄ… fuzji z lizosomem
1. rozpoznanie i związanie przez komórkę
żerną cząsteczki / komórki
" połączenie to wymaga wzrostu [Ca2+]
zewnątrzkomórkowego lub redystrybucja jonów z
2. zmiany w cytoszkielecie fagocyta
magazynów wewnątrzkomórkowych
3. fagocyt otacza obiekt wypustkami
(pseudopodia = nibynóżki)
" w obrębie fagolizosomu panuje odczyn kwaśny 
niezbędny do aktywności enzymów obecnych w
4. po zamknięciu pseudopodiów powstaje
pęcherzyk fagosomalny (= fagosom)
lizosomach np. kwaśnych peptydaz, laktoferyny
5. połączenie fagosomu przez fuzję z
" w fagolizosomie następuje zabicie i strawienie
lizosomami, polimeryzacja aktyny,
przemieszczanie ziarnistości
pochłoniętych mikroorganizmów
wewnątrzkomórkowych
6. następuje uruchomienie procesu trawienia
Mechanizmy tlenowe
Ad 5) Wewnątrzkomórkowe zabijanie
Mechanizmy tlenowe Mechanizmy niezależne od tlenu
Wybuch tlenowy
zależny od
mieloperoksydazy
niezależny od
mieloperoksydazy
(szlak częsty w
MØ)
Aktywne formy tlenu:
Mechanizmy tlenowe
.
Rodnik hydroksylowy - OH
Powstaje w wyniku rozpadu wiązania O-O w cząsteczce H2O2. Rozpad ten może nastąpić pod
wpływem wysokiej temperatury, promieniowania jonizującego lub w reakcjach H2O2 z metalami
przejściowymi np. żelazem reakcja Fentona
" Najaktywniejsze formy tlenu to rodnik hydroksylowy
i tlen singletowy. Rodniki hydroksylowe są również produkowane w reakcjach O2- i H2O2 :
O2- + H2O2 O2+ . OH + OH-
" Nadtlenek wodoru jest mniej reaktywny
Reakcja ta jest katalizowana jonami żelazawymi Fe3+.
i szybko unieczynniany.
Rodnik hydroksylowy jest jednym z najgroz
niejszych dla komórki czynników utleniających.
Reaguje w wysokim stopniu prawie ze wszystkimi organellami i czÄ…steczkami.
" Eozynofile katalizujÄ… powstawanie kwasu
.
Rodnik ponadtlenkowy - O2-
podbromawego (HOBr) z jonów bromkowych (Br-) o właściwościach bakteriobójczych, może
Rodnik mającym jeden niesparowany elektron. Głównym jego z
ródłem w komórkach jest wyciek
elektronów z łańcucha oddechowego. .O2- jest toksyczny dla komórkowych organelli.
też reagować z aminami wytwarzając toksyczne bromaminy. Ponadto reaguje z nadtlenkiem
wodoru, co prowadzi do powstania tlenu singletowego. Sam HOBr także ma
Tlen singletowy - O21
Jest jedną z głównych toksycznych form tlenu w żywych organizmach.
" W reakcji zainicjowanej przez syntetazÄ™ tlenku azotu (NOS) z L-argininy, tlenu i NADPH
Nadtlenek wodoru - H2O2
powstaje NO. Sam NO jest mało aktywny bakteriobójczo, ale reagując z tlenem tworzy
.
W obecności dysmutazy ponadtlenkowej rodniki ponadtlenkowe O2- stają się z
ródłem H2O2.
dwutlenek azotu, a wraz z O2- tworzy peroksyazotyny (ONOO-) 2.O2- + 2H+ H2O2 + O2
.
H2O2 jest głównym substratem reakcji produkujących silnie toksyczny rodnik hydroksylowy - OH.
3
Mechanizmy niezależne od tlenu
Inhibitory szkodliwego działania tlenu:
Wolne rodniki tlenowe i reaktywne formy tlenu mogą reagować z różnymi strukturami
Komórki żerne syntetyzują również wiele białek zdolnych do zabicia mikroorganizmów.
komórkowymi powodując konwersję białek, peroksydację lipidową czy uszkodzenie struktury
kwasów nukleinowych. W organizmach żywych występują mechanizmy obronne przeciw Większość z nich jest magazynowana w ziarnach, ale niektóre są wydzielane również do
toksycznym formom tlenu. SÄ… nimi specyficzne enzymy takie jak:
środowiska. Mechanizmy te umożliwiają kom. żernym zabicie tych mikroorganizmów, których
dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) - ta nazwa określa się grupę enzymów prowadzących do fagocytoza nie stymuluje syntezy reaktywnych form tlenu.
usuwania rodnika ponadtlenkowego O2- .
Najbogatszy zestaw ziaren majÄ… neutrofile: ziarna azurofilne (pierwotne)
katalaza jest enzymem, którego rola polega na rozkładaniu toksycznych nadtlenków wodoru
ziarna swoiste (wtórne)
(H2O2) powstających w procesach utleniania biologicznego. Proces, w którym to zachodzi
przedstawiono poniżej.
ziarna trzeciorzędowe
H2O2 + H2O2 2 H2O + O2
ziarna wydzielnicze
Aktywność katalazy w organizmie obniża się podczas chorób nowotworowych.
Ziarna azurofilne Ziarna swoiste Ziarna Ziarna wydzielnicze
peroksydaza glutationowa enzym usuwajÄ…cy H2O2
trzeciorzędowe
Azurocydyna Kolagenaza Acetylotransferaza Fosfataza zasadowa
BPI Żelatynaza Żelatynaza Białka osocza np.
W działalności obronnej biorą także udział małe cząsteczki o charakterze Defensyny Histaminaza Lizozym albumina
W działalności obronnej biorą także udział małe cząsteczki o charakterze
Katepsyny Lizozym ß2-mikroglobulina
antyutleniaczy:
antyutleniaczy:
Lizozym ß2-mikroglobulina
tokoferol (witamina E)
tokoferol (witamina E)
Elastaza Laktoferyna
Mieloperoksydaza Aktywator
kwas askorbinowy (witamina C)
kwas askorbinowy (witamina C)
Proteaza 3 plazminogenu
witamina A
witamina A
Białko wiążące Białko wiążące wit.B12
heparynÄ™
Defekty chemotaksji/fagocytozy:
- złe gromadzenie mikrotubul
- upośledzona adherencja komórek
- upośledzone poruszanie komórek
- upośledzona degranulacja lizosomów
- fizjologicznie obniżona aktywność chemotaktyczna
u noworodków i niemowląt do 1rż.
Zaburzenia funkcji granulocytów:
Defekty chemotaksji / fagocytozy
Objawy dysfunkcji granulocytów mogą być związane ze zmniejszeniem ich ilości do
fagocytozy i zabijania wewnątrzkomórkowego. Niezależnie od przyczyny najczęstszym
objawem ich dysfunkcji sÄ… nawracajÄ…ce i z
le leczące się zakażenia bakteryjne.
Przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD  chronic granulomatous disease)
" Przyczyną choroby jest defekt enzymatyczny w cyklu oddechowym (defekt genów dla
składowych oksydazy NADPH) nie dochodzi do wytwarzania O2- i H2O2.
" Na kompleks oksydazy NADPH składa się cytochrom b558 (zbudowany z dwóch łańcuchów
gp91 i p22) umiejscowiony w bł. komórkowej, białka cytoplazmatyczne  p47 i p67 oraz
flawoproteiny i pewne składniki cytosolu. Aktywacja fagocytów powoduje przemieszczenie
składowych oksydazy do bł. komórkowej, gdzie łączą się z cytochromem b i aktywują go przez
zmiany konformacyjne.
Zaburzenia funkcji granulocytów:
Zaburzenia funkcji granulocytów:
Przewlekła choroba ziarniniakowa (CGD  chronic granulomatous disease) c.d.
Niedobór mieloperoksydazy (MPO)
" Brak MPO powoduje upośledzenie wytwarzania HOCl. Choroba jest uwarunkowana
" Objawy pojawiają się już po zakończeniu 1rż. Zwykle są to przewlekłe ropne zakażenia
genetycznie.
skóry (tzw. zimne ropnie), węzłów chłonnych, szpiku, kości i narządów wew., stany zapalne
skóry, zapalenia płuc.
" Diagnostyka: wszystkie parametry odp. komórkowej i humoralnej są prawidłowe. Diagnostyka
polega na stwierdzeniu niedoboru MPO metodÄ… immunocytochemicznÄ… lub
" Diagnostyka: oparta jest o wykazanie braku zwiększonej aktywności cyklu oddychania
cytofluorymetrycznie.
tlenowego po stymulacji granulocytów cząsteczkami lateksu lub zymosanu. Najczęsciej
stosowanym i prostym testem jest test redukcji barwinika NBT (błękit nitrotetrazolowy).
Często stosowanym badaniem do oceny wytwarzania jest test chemiluminescencji (pomiar
Niedobór cząsteczek adhezyjnych (LAD  leukocyte adhesion defects)
wzmacnianej luminolem emisji fotonów za pomocą chemiluminometru).
" Dochodzi do zaburzenia ruchliwości leukocytów, ponieważ pozbawione integryn
(CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18) nie mogą migrować poza układ naczyniowy do
miejsca wniknięcia mikroorganizmu.
Niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6-PD) w neutrofilach
" Ciężka postać choroby prowadzi do zgonu z powodu trudnych do opanowania zakażeń.
" Przyczyną choroby jest zmniejszona zdolność wew.kom. zabijania mikroorganizmów,
Charakterystyczne są nawracające zakażenia i utrudnione gojenie się ran. Występuje bardzo
ponieważ enzym ten jest istotny w aktywacji oksydazy NADPH.
wysoka granulocytoza.
" Obraz kliniczny przypomina CGD, ale pierwsze objawy występują zwykle póz
niej.
" Diagnostyka polega na ocenie braku lub obniżonej ekspresji integryn.
" Diagnostyka jak w CGD.
4
Ocena funkcji granulocytów i monocytów:
1) Ocena zdolności komórek do chemotaksji:
Metody obeserwacyjno-mikroskopowe
Metoda okienek skórnych Rebucka
Metoda  agarozowa
Metoda Boydena
2) Badanie zdolności fagocytarnych:
Metoda probówkowa
Ocena funkcji granulocytów i monocytów: Metoda jednowarstwowa (monolayer)
Metoda cytometryczna BURSTTest, FAGOBURST
3) Badanie wewnątrzkomórkowego zabijania (killing)
Metoda biologiczna
Metoda izotopowa
Metody z zastosowaniem barwienia oranżem akrydyny
4) Badanie wewnątrzkómórkowego metabolizmu fagocytów
Test pochłaniania i redukcji NBT
Test spontaniczny
Test pobudzony
Ocena funkcji granulocytów i monocytów:
Ad c) Metoda agarozowa
Ad1) Ocena zdolności komórek do chemotaksji:
Ad a) Metody obeserwacyjno-mikroskopowe
" bezpośrednia obserwacji pod mikroskopem ruchu określonych komórek
" dodatkowe techniki rejestrowania drogi pokonywanej przez komórki
" nie stosowane w diagnostyce
Ad b) Metoda okienek skórnych Rebucka
" ocena wł. chemotaktycznych in vitro
" nałożenie szkiełka nakrywkowego, pokrytego cz. chemotakt., na skaryfikowaną
skórę badanego
" ocena liczby komórek przytwierdzonych do szkiełka
Ad c) Metoda agarozowa
" wylanie podłoża z dodatkiem 0,75% agarozy -> po zestaleniu podłoża wycina
się serię potrójnych studzienek
http://www.umed.lodz.pl/KatedraImmunologii/UPLOAD/matpom3WL.pdf
Ocena funkcji granulocytów i monocytów:
Ad d) Metoda Boydena
1) Ocena zdolności komórek do chemotaksji:
Metody obeserwacyjno-mikroskopowe
Metoda okienek skórnych Rebucka
Metoda  agarozowa
Metoda Boydena
2) Badanie zdolności fagocytarnych:
Metoda probówkowa
Metoda jednowarstwowa (monolayer)
Metoda cytometryczna BURSTTest, FAGOBURST
3) Badanie wewnątrzkomórkowego zabijania (killing)
Metoda biologiczna
Metoda izotopowa
Metody z zastosowaniem barwienia oranżem akrydyny
4) Badanie wewnątrzkómórkowego metabolizmu fagocytów
Test pochłaniania i redukcji NBT
http://www.umed.lodz.pl/KatedraImmunologii/UPLOAD/matpom3WL.pdf Test spontaniczny
Test pobudzony
5
BURSTTest, FAGOBURST®
Ad a) Metoda probówkowa
" czasochłonne i wymagające dużej ilości materiału badanego metody
" opsonizacja bakterii inkubacja drobnoustrojów z normalną surowicą (30
mikroskopowe i spektrofluorymetryczne zastÄ…piono metodami wykorzystujÄ…cymi
min, 37ºC)
cytometrię przepływową
" dodanie drobnoustrojów do badanych fagocytów
" pomiar efektywnego metabolizmu tlenowego we wrodzonych i nabytych
" po inkubacji, przerywamy proces przez schłodzenie zaburzeniach funkcji fagocytów
" po odwirowaniu rozmaz z osadu komórek barwiony metodą Giemsy " ocena zdolności do wybuchu tlenowego i fagocytozy, wykorzystywana w badaniu
częstych i nawracających infekcji bakteryjnych
" ocena indeksu fagocytarnego
" pozwala określić równolegle aktywność neutrofili oraz monocytów w pełnej krwi lub
płynie stawowym
Fagocytoza:
- indukcja opsonizowanymi bakteriami E. coli  wskazuje na zdolności żerne
Ad b) Metoda jednowarstwowa
- do oceny fagocytozy stosuje się płyn barwiący DNA bakterii
" opłaszczenie badanymi komórkami powierzchni szkiełka podstawowego
" po odpłukaniu szkiełka przytwierdzone pozostają komórki żerne
Wybuch tlenowy:
" pokrywa się je zawiesiną opsonizowanych drobnoustrojów
- LPS, fMLP (formylo-metionylo-leucyno-fenyloalanina) sÄ… stymulatorami w
kontekście wybuchu tlenowego
" po inkubacji jak w metodzie probówkowej
- aby zbadać wybuch tlenowy wykorzystuje się fluorogeniczny substrat
dihydrorodaminę (DHR123), która po przeniknięciu przez błonę komórkową ulega
przemianie do fluorochromu emitującego sygnał fluorescencyjny (R123)
OCENA WYBUCHU TLENOWEGO I
WARTOÅšCI PRAWIDA
OWE W BURSTTEST i FAGOTEST
FAGOCYTOZY
PMA fMLP
Stymulant % komórek % komórek
wybuchajÄ…cych fagocytujÄ…cych
monocyty E.coli 70-100 65-95
PMA
granulocyty E. coli
96-99,5 84-99
fMLP
1-20
PMA
98-100
Ocena funkcji granulocytów i monocytów:
Ad a) Metoda biologiczna
1) Ocena zdolności komórek do chemotaksji:
" zasada zliczanie koloni wyrosłych z komórek bakteryjnych, które przeżyły proces fagocytozy
Metody obeserwacyjno-mikroskopowe
" inkubacja leukocytów z żywymi drobnoustrojami.
Metoda okienek skórnych Rebucka
" liza fagocytów (np. saponina, Triton X-100)
Metoda  agarozowa
" z fagocytów uwolnione zostają komórki które przeżyły wewnątrz fagocytów
Metoda Boydena
" posiew bakterii na podłoża hodowlane
2) Badanie zdolności fagocytarnych:
" po inkubacji zliczanie koloni na płytkach
Metoda probówkowa
" ocena % zabijania  porównanie wyjściowej liczby bakterii z liczbą bakterii wyrosłych na płytce
Metoda jednowarstwowa (monolayer)
Metoda cytometryczna BURSTTest, FAGOBURST
Ad b) Metoda izotopowa
3) Badanie wewnątrzkomórkowego zabijania (killing)
" test do oceny fagocytozy i wewnątrzkomórkowego zabijania
Metoda biologiczna
" zasada aktywne wiązanie tymidyny znakowanej trytem przez bakterie nie pochłonięte przez
Metoda izotopowa
fagocyty.
Metody z zastosowaniem barwienia oranżem akrydyny
" inkubacja opsonizowanych bakterii i fagocytów + kontrola (bakterie bez fagocytów)
" dodanie tymidyny znakowanej trytem (o określonej aktywności)
4) Badanie wewnątrzkómórkowego metabolizmu fagocytów
" ocena fagocytozy  dodanie podłoża, ocena killingu  roztwór detergentu
Test pochłaniania i redukcji NBT
" zawartość studzienek przenosi się na krążki filtrów szklanych ocena stopnia radioaktywności
Test spontaniczny
w liczniku scyntylacyjny
Test pobudzony
6
Ocena funkcji granulocytów i monocytów:
TEST POCHA
ANIANIA I REDUKCJI NBT
1) Ocena zdolności komórek do chemotaksji:
" Pozwala na ocenę stanu metabolicznego komórki
Metody obeserwacyjno-mikroskopowe
" W przebiegu fagocytozy dochodzi do aktywacji nukleotydów NADH i NADPH, które
Metoda okienek skórnych Rebucka mają zdolność do redukcji pochłoniętego przez komórki roztworu błękitu
nitrotetrazolowego do formazanu.
Metoda  agarozowa
" Formazany są nierozpuszczalne w wodzie i odkładają się w cytoplazmie komórek w
Metoda Boydena
postaci ciemnoniebieskich złogów.
2) Badanie zdolności fagocytarnych:
" Stwierdzenie zdolności komórek do redukcji NBT jest dowodem ich prawidłowej funkcji
Metoda probówkowa metabolicznej.
Metoda jednowarstwowa (monolayer)
Metoda cytometryczna BURSTTest, FAGOBURST
3) Badanie wewnątrzkomórkowego zabijania (killing)
Test spontaniczny
Metoda biologiczna
" Krew heparynizowaną zawiesza się w równej ilości roztworu NBT. Po 20min. inkubacji
Metoda izotopowa
w temp. 37°C wykonuje si Ä™ rozmazy na szkieÅ‚kach i po utrwaleniu wybarwia siÄ™ je
Metody z zastosowaniem barwienia oranżem akrydyny safranianą. Odsetek kom. NBT(+) oblicza się mikroskopowo pod powiększeniem 1000x.
" Wartości prawidłowe do 8% kom. NBT(+), >14% - imfekcja bakteryjna
4) Badanie wewnątrzkómórkowego metabolizmu fagocytów
" Wyniki ujemne  CGD, wrodzona agammagobulinemia, toczeń rumieniowaty układowy i
Test pochłaniania i redukcji NBT u pacjentów leczonych kortykosteroidami (wynik fałszywie ujemny)
Test spontaniczny " W przypadku bardzo niskich lub ujemnych wyników testu spontanicznego zaleca się
wykonanie testu pobudzonego.
Test pobudzony
Test pobudzony
" Fagocyty wstępnie pobudzone lateksem lub
endotoksynÄ… np. LPS bardzo intensywnie
pochłaniają i redukują NBT.
" Na szkiełko pokryte endotoskyną nanosi się
dużą kroplę pełnej krwi inkubacja w
komorze wilgotnej, 45min. temp. 37°C
skrzep delikatnie spłukujemy, granulocyty
pozostają na szkiełku nakrapla się roztwór
NBT inkubacja płukanie barwienie
safraninÄ….
" Wartości prawidłowe: 80% kom. NBT(+),
<40% - defekt metaboliczny np.
agranulocytoza, CGD lub obecność
zakażenia przebiegającego z uszkodzeniem
granulocytów.
" Test pobudzony nie może być stosowany
jako główny czy jedyny, ze względu na duży
margines błędów.
7