Ćwiczenie nr 6
PUNKT IZOELEKTRYCZNY AMFOLITÓW
1.Zestaw przyrządów i odczynników:
spektrofotometr octan sodowy 1 mol/dcm3
łaz
nia wodna kwas octowy 1 "
kazeina " 0,1 "
kolba miarowa na 50 ml " 0,01 "
probówki, pipety.
Ogólny wygląd spektrofotometru z oznaczeniem elementów przedstawiono na osobnej tablicy.
2. Podstawy teoretyczne.
Amfolitami nazywamy substancje wykazujące zarówno właściwości zasadowe jak i kwasowe. Typo-
wymi przedstawicielami tych związków są aminokwasy i białka. Na skutek jednoczesnej obecności
grup zasadowych oraz kwasowych, związki te mogą dysocjować jako kwasy i jako zasady. W roztwo-
rach silnie kwaśnych istnieją pod postacią kationów np. +NH3RCOOH a w roztworach zasadowych ja-
ko aniony, np. NH2-R-COO-. Przy pośrednich wartościach pH dominującą formą jonową w roztworze
są amfijony, czyli jony dwubiegunowe, np. +NH3-R-COO-. Cząsteczka białka zawiera wiele grup kwa-
sowych i zasadowych, których jonizacja (a tym samym również całkowity ładunek cząsteczki), zmie-
nia się wraz ze zmianą pH środowiska. Przy określonej wartości pH sumaryczny ładunek cząsteczki
amfijonu może wynosić zero, dzięki równej liczbie zjonizowanych grup kwasowych i zasadowych.
Wartość pH odpowiadającą temu stanowi amfijonu nazywamy jego punktem izoelektrycznym. Jedno-
cześnie jest to takie pH roztworu, przy którym stężenie molowe formy kationowej jest równe stężeniu
molowemu formy anionowej. Roztwór kazeiny, tak jak roztwory innych białek jest trwały tylko wtedy,
kiedy cząsteczki koloidu mają ładunek elektryczny różny od zera. W pobliżu punktu izoelektrycznego
jego zmętnienie silnie wzrasta na skutek występowania koagulacji spowodowanej utratą ładunku czą-
steczek koloidalnych oraz obecnością soli. W punkcie izoelektrycznym koagulacja osiąga swoje mak-
simum. Opisana niżej metoda wyznaczania punktu izoelektrycznego oparta jest na pomiarze zmętnie-
nia roztworów kazeiny w buforze octanowym o różnym pH.
UWAGA! kazeinę należy rozpuścić w zlewce (u nas 25 ml) lub probówce chemicznej, ale nigdy w kol-
bie miarowej.
3. Przebieg ćwiczenia:
a) do probówki wlać 5 ml 1M octanu sodowego, następnie przesypać 0,1g kazeiny, wymieszać i
ogrzać na łaz
ni wodnej (temperatura ok. 500C) do rozpuszczenia osadu. Roztwór wlać do kolby
miarowej na 50 ml i uzupełnić do kreski wodą destylowaną. W ten sposób uzyskujemy 0,2% roz-
twór kazeiny w 0,1 M octanie sodowym.
b) przygotowanie roztworów do pomiarów zmętnienia. Do ponumerowanych probówek wlewamy za
pomocą pipet wodę destylowaną i kwas octowy w ilościach podanych w tabelce, a następnie do
każdej probówki po 1 ml uprzednio przygotowanego roztworu kazeiny w 0,1 M octanie sodowym.
Roztwór mieszamy i po 5 min. mierzymy jego zmętnienie. Wartości pH roztworów w poszczegól-
nych probówkach podano w tabelce.
Nr probówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9
woda dest. [ml] 8.4 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
kwas octowy 0.01M 0.6 1.25 - - - - - - -
kwas octowy 0.1 M - - 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
kwas octowy 1.0 M - - - - - - - - 1.6
kazeina 0.1 M w 1 1 1 1 1 1 1 1 1
octanie sodowym
pH roztworu 5.9 5.6 5.3 5.0 4.7 4.4 4.1 3.8 3.5
UWAGA! kuwety należy ujmować wyłącznie za boczne (matowe) ścianki.
c) pomiar zmętnienia.
I. Wstawić do karetki spektrofotometru kuwetę napełnioną wodą destylowaną i kuwetę napełnioną
roztworem kazeiny o różnym pH (kuwety napełnić do około 3/4 ich objętości). Przesłonę (1) nasta-
wić w pozycję "0" i włączyć przyrząd do sieci. Za pomocą bębna monochromatora ustawić długość
fali na 500 nm.
II. Po upływie 5 min. nastawić pokrętłem (5) wskazówkę miernika (4) w położenie zerowe. Wpro-
wadzić w bieg promieni kuwetę z wodą destylowaną i otworzyć przesłonę "1", obracając gałkę (6)
sprowadzić wskazówkę miernika na koniec skali. Zamknąć przesłonę.
III. Wprowadzić w bieg promieni kuwetę z roztworem kazeiny, otworzyć przesłonę i odczytać war-
tość zmętnienia z górnej skali miernika. Powtórzyć czynności z punktów I. i II. kolejno dla wszyst-
kich roztworów kazeiny (probówki od 1 do 9).
d) Przedstawienie wyników - stężenia kwasu octowego, octanu sodu i kazeiny oraz odczytane warto-
ści zmętnienia i odpowiadające im wartości pH przedstawiamy w tabelce według wzoru zamiesz-
czonego w sprawozdaniu. Sporządzamy wykres zależności zmętnienia od pH i z wykresu tego od-
czytujemy wartość pH odpowiadającą punktowi izoelektrycznemu.
Wymagane wiadomości:
1. Elektrolity amfoteryczne i ich dysocjacja.
2. Własności elektryczne roztworów koloidalnych. Własności optyczne koloidów.
3. Koagulacja koloidów pod wpływem elektrolitów.
4. Zasada działania spektrofotometru.
5. pH i wpływ kwasowości na dysocjację.
PROPONOWANA LITERATURA:
1. l.Sobczyk, A.Kisza, Chemia fizyczna dla przyrodników.
2. E.Szyszko, Instrumentalne metody analityczne.
3. S.Przestalski, Wstęp do biofizyki.
 Ćwiczenie 6
Akademia Medyczna we Wrocławiu
Katedra Biofizyki Wyznaczanie punktu izoelektrycznego
amfolitów
..................................................................
..................................................................
Imiona i nazwiska studentów Podpis prowadzącego ćwiczenia
Wydział: Data:
Grupa studencka:
Numer zespołu: Ocena:
1. Wypełnić tabelę:
Numer pro- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
bówki
Stężenie
kazeiny w
% wago-
wych
Stężenie
kwasu
octowego
mol/dm3
Stężenie
octanu so-
du
mol/dm3
pH roztwo- 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5
ru
Zmętnienie
2. Sporządzić na papierze milimetrowym wykres zależności zmętnienia od pH roztworu.
3. Z wykresu odczytać wartość punktu izoelektrycznego
pHizo =