Emisja promieniowania
Luminescencja:
Inkadescencja
FLUORYMETRIA
( b d i t i )
(wzbudzenie termiczne)
radioluminescencja
I SPEKTROFLUORYMETRIA
chemoluminescencja
triboluminescencja
bioluminescencja
fotoluminescencja:
fluorescencja, fosforescencja
Luminescencja
Fotoluminescencja
fluorescencja, fosforescencja
Fotoluminescencja:
Podstawy teoretyczne
fluorescencja, fosforescencja
Fluorymetria jest metodą polegającą na pomiarze natężenia
światła emitowanego przez wzbudzone światłem cząsteczki.
Spektrofluorymetria polega na pomiarze widm emisyjnych i
wzbudzeniowych czÄ…steczek
wzbudzeniowych czÄ…steczek.
1
Diagram przejść elektronowych Diagram przejść elektronowych
Na poziomach wyższych niż S1 cząsteczka może wytracić energię:
- promieniście na drodze fluorescencji rezonansowej,
VR
- bezpromieniście, na drodze tzw. przekształcenia wewnętrznego
S3
poziomy
(internal convertion - IC),
oscylacyjne
A
S
2
IC
S2
Na poziomie S1 cząsteczka możewytracić energię:
poziomy
oscylacyjne
-bezpromieniście, na drodze przekształcenia wewnętrznego,
A
15
10 s
10-15
s
S
S1
poziomy
-bezpromieniście, przechodząc do tripletu, na drodze tzw.
ISC
oscylacyjne
S1
przejścia międzysystemowego (intersystem crossing - ISC),
T
-promieniście, na drodze fluorescencji.
F10-9
- 10-6
s
IC P10-4
s
ISC
Na poziomie T cząsteczka możewytracić energię:
- bezpromieniście (IC),
rotacyjne
S0
- promieniście, na drodze fosforescencji
- w reakcjach chemicznych,
- na drodze wygaszania.
Fluorescencja, fosforescencja Fluorescencja, fosforescencja
VR
S3
poziomy
oscylacyjne
A
S2
IC
S2
poziomy
oscylacyjne
A
10-15
s S1
poziomy
ISC
oscylacyjne
S1
T
F10-9
- 10-6
s
IC P10-4
s
ISC
rotacyjne
S0
Fluorescencja - zachodzi
bez zmiany multipletowości
Fosforescencja - zachodzi
Fluorescencja Fosforescencja
ze zmianą multipletowości
10-5 to 10-8 s 10-4 to 10 s
Fluorescencja przedłużona
VR
S3
poziomy
oscylacyjne
A
S2
S2 IC
poziomy
oscylacyjne
A
10-15
s S1
poziomy
ISC
oscylacyjne
S1
T
F10 9 - 10-6
F10-9 6
10 s
IC P10-4
s
ISC
rotacyjne
S0
Typu E (eozyna) Typu P (pyren)
0 sec
1 sec 640 sec
1 3 1 3
X* X X* X
3 1 1
PrzykÅ‚ad fosforescencji X + h½ X* 2(3X) (3X)2 X* + 1X
1 1 1
X* X + h½ + X* X + h½ + ciepÅ‚o
ciepło
2
Widma wzbudzenia i emisji fluorescencji
Widmo emisji
Widma emisji fluorescencji
0.8
= f ( )
I 
F EM
0.4
= const

EX
0.0
300 400 500 600 700
 / nm
 / nm
Widma wzbudzenia fluorescencji
Widmo wzbudzenia
0.8
Aleksander Jabłoński
= f ( )
I 
F EX
0.4
1898-1980
= const

EM
0.0
300 400 500 600 700
 / nm
Widma pozorne i widma rzeczywiste
0,4 1,5
Widmo emisji
Współczynniki korekcyjne
lampy ksenonowej
dla widma wzbudzenia
1,4
0,3
1,3
0,2
1,2
1,1
0,1
1,0
0,0
200 400 600 800 300 400 500 600
200 400 600 800 300 400 500 600
 / nm  / nm
Widma wzbudzenia
750
1,0
Współczynniki korekcyjne
dla widma emisji
600
0,8
450
0,6
300 0,4
widmo pozorne
widmo skorygowane
0,2
150
0,0
0
300 350 400 450
300 400 500 600 700 800
 / nm
 / nm
Widma emisji
S 3
Reguła Stokesa
S 2
Widmo fluorescencji jest przesunięte
długofalowo stosunku do widma
absorpcji
S 1
abs. em.
Widmo fluorescencji jest
Sir George Gabriel Stokes
odbiciem ostatniego długo-
falowego pasma absorpcji.
1818-1903
0-3 0-0 0-3
½
3
F
I / jednostki umowne
F
I / jednostki umowne
F
F
I / j.u.
I / j.u.
F
I / j.u.
F
I / j.u.
Rozsuwanie przejść 0 - 0
Stan FC
Stan
zrelaksowany
Absorpcja 0-0 wymaga nieco
wyższej energii niż emisja 0-0
h ½ h ½'
Czynniki wpływające na wydajność
Wydajność kwantowa fluorescencji
kwantowÄ… fluorescencji
Czynnikiem decydującym o wysokiej wydajności kwantowej
sÄ…:
wysokie wartoÅ›ci molowego współczynnika absorpcji, µ, w
szczególności w przypadku fluorescencji z poziomów Ą,Ą*, (głównie w
liczba kwantów emitowanych
liczba kwantów emitowanych
przypadku związków o wielokrotnych skoniugowanych wiązaniach
przypadku związków o wielokrotnych skoniugowanych wiązaniach
Åš =
podwójnych) i CT (silna fluorescencja w ciele stałym); słaba
liczba kwantów absorbowanych
fluorescencja z poziomów n,Ä„*, brak fluorescencji z poziomów Ã*;
sztywność cząsteczki (związki planarne);
stabilizacja rezonansem (podstawniki)
Przykłady związków fluoryzujących
Przykłady związków fluoryzujących
Przykłady związków
Przykłady związków
fluoryzujÄ…cych
fluoryzujÄ…cych
H2
C
H
N
N
Chinolina Indol Fluoren
4
Czynniki wpływające na wydajność
kwantowÄ… fluorescencji
Wydajność kwantowa fluorescencji jest wielkością charakterystyczną dla
zwiÄ…zku:
Ć
Antracen w EtOH 0.27
Chlorofil a w EtOH 0.23
Chl fil b EtOH 0 10
Chlorofil b w EtOH 0.10
Eozyna w H2O0.16
Fluoresceina w H20/NaOH 0.85 (zielona)
Siarczan chininy w H20/1N H2SO4 0.55 (niebieska)
Rodamina B w EtOH 0.97 (czerwona)
Witamina B2 wH2O0.26
Czynniki wpływające na wydajność
kwantową fluorescencji - przykłady
- -
O O O
O O
C
COO-
COO-
Fluoresceina (sztywna) Fenoloftaleina (giętka)
Fluoresceina (sztywna) Fenoloftaleina (giętka)
H
H H
+ H H H H
+
+
N
N N H N H
: -
..
-
Anilina Jon anilinowy
Czynniki wpływające na wydajność Czynniki wpływające na wydajność
kwantową fluorescencji - przykłady kwantową fluorescencji - przykłady
Podstawniki elektronodonorowe zwiększają wydajność kwantową
fluorescencji
 OH
 NH2
2
 OCH3
Podstawniki elektronoakceptorowe zmniejszają wydajność kwantową
fluorescencji
 COOH
 NO2
5
Czynniki wpływające na wydajność kwantową
Czas życia fluorescencji
fluorescencji
o C
20
-t
Ä
I =
o C
25 I e
0
Temperatura
oC
31
Rozpuszczalnik
o
35 C
pH
wartość 1/e z I 0
I
Ä =
Åš Ä
Wygaszacze (O2, ) 0 0
yg ( , Cl i in.)
oC
40oC
2 40
oC
43
Ä 1 Ä 2 Ä 3 czas w ns
I0 - intensywność fluorescencji w czasie wzbudzenia,
nm
I  intensywność fluorescencencji po czasie t,
Ä - Å›redni (mierzony) czas życia stanu wzbudzonego
Rodamina B w 0.1 N HCl
Ä0  naturalny (rzeczywisty) czas życia fluorescencji
Zależność intensywności fluorescencji od
Intensywność fluorescencji
stężenia cząsteczek emitujących
Dla roztworów rozcieÅ„czonych, (µbc<0.05):
If
10-3 -10-6M
= KÅš µbc
I I
F 0 10-5 -10-4M vit.B2
= KÅš µbc
I I
F 0
10-3 -10-2M
C
C
K  stała proporcjonalności zależna od układu
Równanie sprawdza się wyłącznie dla roztworów, których
pomiarowego,
rozcieńczenia są rzędu ppm (part per million) czyli A = abC <
Ś- wydajność kwantowa fluorescencji,
0.05. W przypadku wyższych stężeń występuje:
I0  intensywność promieniowania wzbudzającego,
a) efekt filtru wewnętrznego b) samowygaszanie
µ- molowy współczynnik absorpcji,
B  długość drogi optycznej,
C - stężenie
Zależność intensywności fluorescencji od
Widma absorpcji, wzbudzenia i emisji
stężenia cząsteczek emitujących
Efekt filtru wewnętrznego
Widma absorpcji i emisji
= KÅš µbc
I I
F 0
Widmo wzbudzenia Widmo emisji
0.8
H" × µ
I I
F 0
0.4
Samowygaszanie
Widma absorpcji i wzbudzenia
0.0
300 400 500 600 700
Widmo wzbudzenia
Widmo emisji
 / nm
Widmo wzbudzenia
0.8 1.2 1.2
Widmo absorpcji
0.8 0.8
0.4
0.4 0.4
0.0
300 400 500 600
0.0 0.0
300 400 500 600 700
 / nm
 / nm
6
s
względna intensywność fluorescencji
d
F
I / jednostki umowne
Absorbancja
F
I / jednostki umowne
F
I / jednostki umowne
Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii
Badania ilościowe i jakościowe Selektywność metod fluorescencyjnych
Zastosowania podobne jak spektrofotometria UV VIS ale metody
fluorescencyjne są bardziej czułe, specyficzne i selektywne.
Widma absorpcji Widma emisji
1.2 1.2
Zalety metod fluorescencyjnych
" Doskonała czułość oznaczeń  p p g 0.8 0.8
pomiar promieniowania emitowanego.
" Duża selektywność  nie wszystkie związki wykazują fluorescencję; możliwość
0.4 0.4
wyboru długości fali promieniowania wzbudzającego i emitowanego.
" Szeroki zakres liniowości oznaczeń.
300 400 500 600 700
 / nm
Ograniczenia metod fluorescencyjnych
" Reakcje fotochemiczne.
" Zależność intensywności fluorescencji od temperatury, pH, siły jonowej.
" Wygaszanie fluorescencji (tlen, temperatura, zanieczyszczenia, stężenie).
Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii
Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii
H2O OH2
Al3+
Analiza ilościowa OH HO O OH
Oznaczanie stężenia na podstawie pomiaru intensywności
N N SO3Na N N SO3Na
fluorescencji:
- związków naturalnie wykazujących fluorescencję (np. witamina E, B2,
i kó t l i k j h fl j ( it i E B
B6, chlorofil, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne
WWA)
Sól sodowa kwasu 2,2 -dihydroksy-1,1 -azanaftalen-3-sulfonowego
-przeprowadzonych we fluoryzujÄ…ce pochodne w wyniku reakcji
Pontachrome BBR
chemicznych, reakcji kompleksowania (np. kationy: magnez,
glin, selen, kadm, wapń; aniony: cyjanki, fluorki, jodki)
-metoda detekcji w chromatografii cieczowej
Sensory optyczne (fluorescencyjne)
Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii
Produkty spożywcze, chemia rolna:
Miniaturowe przenośne urządzenia do określonych celów
nieorganiczne (kationy: magnez, glin, selen, kadm,
analitycznych (organic light-emitting device (OLED) light
wapń; aniony: cyjanki, fluorki, jodki.);
source):
witaminy;
białka (mleko i produkty spożywcze);
monitorowanie stężenia gazów w środowisku (np, O2,
barwniki (chlorofil);
CO, CO2, amoniaku, hydrazyny), w wodzie,
, , , y y y), ,
2
P t d i i kt d ( li śl d )
Pestycydy i insektycydy (analiza śladowa).
zawartość związków i gazów we krwi (np, glukoza),
Zanieczyszczenie środowiska:
i organizmach żywych;
zanieczyszczenie wody, powietrza (WWA,
insektycydy, pestycydy)
zastosowania w badaniach podstawowych do badań
metale toksyczne (beryl, ołów, kadm)
procesów biologicznych, biochemicznych i chemicznych,
Medycyna, chemia kliniczna, biochemia:
in vitro and in vivo.
elektrolity (wapń, magnez, siarczany, fosforany),
lipidy, proteiny, aminokwasy, enzymy,leki, metabolity
(glukoza we krwi, ketony, porfiryny).
7
u
n
Absorbancja
F
I / jednostki umowne
Sensory do oznaczania tlenu
Sondy fluorescencyjne do wykrywania reaktywnych
Sensory fluorescencyjne do
form tlenu
pomiaru stężenia tlenu:
monitorowanie środowiska,
procesów przemysłowych
Próba ROS Wzbudzenia Emisja
Wygaszanie fluorescencji (np.
" DCFH-DA (H2O2) 488 525
dekacyklenu) przez tlen
" HE (O2-) 488 590
" DHR 123 (H2O2) 488 525
DCFH-DA: - octan dichlorofluoresceiny
HE: - hydroetydyna
DHR-123: - dihydrorodamina
FLUOROPROBE®
Monitorowanie wód oceanicznych
Fluorescencja minerałów
8
Fluorescencja minerałów
9