Seminarium 7. Elektroforeza białek
ELEKTROFOREZA
ruch fazy rozproszonej względem fazy rozpraszającej wywołany przyło\
oną
zewnętrznie ró\
nicą potencjałów elektrycznych (metoda chromatograficzna)
technika
- analityczna (jakościowa i ilościowa)
- preparatywna (izolacja)
Fazą rozproszona są cząsteczki naładowane, a fazą rozpraszająca jest roztwór lub nośnik.
Cząsteczki biologiczne: aminokwasy, peptydy, białka, nukleotydy i kwasy nukleinowe,
posiadają grupy ulegające jonizacji, nadające cząsteczce wypadkowy ładunek + (kationy) lub
wypadkowy ładunek  (aniony). W zale\
ności od znaku ładunku wypadkowego, cząsteczki
migrują do katody (kataforeza) lub anody (anaforeza). Elektroforeza prowadzona w roztworze
to elektroforeza swobodna. Elektroforeza prowadzona w nośniku to elektroforeza pasmowa
Jako nośnik stosuje się bibułę (wysokonapięciowa elektroforeza bibułowa) lub \
ele (np.
krzemionkowy, dekstranowy, agarowy, skrobiowy, agarozowy, poliakrylamidowy)
ISTOTA ELEKTROFOREZY
- w czasie wędrówki, cząsteczki podlegają rozdzieleniu na skutek ró\
nicy szybkości
ich wędrowania
- szybkość migracji zale\
y od: właściwości cząsteczki (rozmiar, kształt, wielkość
ładunku); właściwości buforu (siła jonowa, skład jonowy); wielkości przyło\
onego
pola elektrycznego; innych czynników (temperatury, dyfuzji, elektroosmozy)
Właściwości cząsteczki białka
- Wypadkowy ładunek białka zale\
y od jego składu aminokwasowego i pH buforu fazy
rozpraszającej
- Prędkość wędrówki białka zale\
y od : siły elektrycznej cząsteczki (suma ładunków); siły
tarcia cząsteczki (wielkości i kształt)
- Prędkość wędrowania  odwrotnie proporcjonalna do kwadratu promienia cząsteczki. Białka
o wydłu\
onym kształcie wędrują wolniej, ni\
to wynika z ich ładunku elektrycznego
Właściwości buforu
Białka jako jony obojnacze przyjmują ładunek + lub  w zale\
ności od swojego pI i pH
środowiska. Białka o pI ni\
szym ni\
pH środowiska są anionami i wędrują do anody. Białka o
pI wy\
szym ni\
pH środowiska są kationami i wędrują do katody. Większość białek ma pI w
zakresie pH 4  7, bufory stosowane mają pH w granicach 8 - 9 jednostek. Zatem większość
białek jest anionami i wędruje do anody.
Siła jonowa buforu
- pochodna stę\
enia i wartościowości jonów buforu.
Zwrost siły jonowej  zwiększenie ostrości rozdziału oraz zmniejszenie ruchliwości
cząsteczek w polu elektrycznym. Optymalna ruchliwość jonów w buforach o sile jonowej
0.05  0.2.
Pole elektryczne
- stosuje się prąd stały i napięcie w granicach 100  300 V.
Wzrost napięcia  wzrost szybkości wędrówki jonów oraz wydzielenie du\
ej ilości ciepła
1
Zbyt niskie napięcie - zwiększenie czasu elektroforezy, zwiększenie dyfuzji (zły rozdział)
Elektroforeza w \
elu
śel stabilizuje środowisko, w którym zachodzi rozdział elektroforetyczny. Środowisko
\
elowe (porowate) ma większą zdolność rozdzielczą ni\
sam roztwór, poniewa\
cząsteczki
rozdzielane są w wyniku ró\
nic w ich ruchliwości oraz w wyniku  przesiewania
molekularnego przez pory \
elu. Wędrujące białka tworzą strefy odpowiadające ich
ruchliwościom. Po wyłączeniu pola elektrycznego białka, pozostają w miejscu, do którego
dotarły.
śel poliakrylamidowy
" posiada wysoką zdolność rozdzielczą
" odporny na działanie czynników chemicznych
" przezroczysty, bezbarwny, sprę\
ysty
" zapewnia powtarzalność rozdziałów
" polimer akrylamidu i bisakrylamidu (czynnik sieciujący)
" polimeryzacja inicjowana APS i katalizowana przez TEMED
" szybkość polimeryzacji zale\
y od stę\
enie monomerów, wolnych rodników i
temperatury
" szybkość polimeryzacji spada w pH poni\
ej 6
" obecność tlenu uniemo\
liwia polimeryzację  odgazowanie
" wielkości charakteryzujące \
el:
"' %T (procent w/o obu monomerów)
"' %C (procent czynnika sieciującego w całości monomerów)
" wielkość porów \
elu uwarunkowana proporcjami monomerów (stę\
enie \
elu)
" ró\
ne stę\
enia procentowe do rozdziału cząsteczek o ró\
nej wielkości  efekt sita
molekularnego
" stosuje się określone stę\
enie lub gradient stę\
enia. Gradient zapewnia ciągłe
zmniejszenie rozmiaru porów (od góry do dołu \
elu) co pozwala na otrzymanie
cienkich prą\
ków.
ELEKTROFOREZA W ELEKTROLITACH ZBUFOROWANYCH
" podczas elektroforezy cząsteczki wody ulegają elektrolizie i powstają protony (jony H
+) na anodzie oraz jony hydroksylowe (OH ) na katodzie.
" jony H+ i OH i wędrują do przeciwnie naładowanych elektrod pH \
elu zmienia się,
rozdzielane cząsteczki przyłączają przeciwnie naładowane jony i stają się obojętne -
nie migrują
" następuje zmiana pH na ka\
dej z elektrod w miarę jak przybywają jony H+ i OH . Na
ujemnej katodzie pH spada, a na dodatnej anodzie pH rośnie
Stosując bufory, pH \
elu jest stabilne i rozdzielane cząsteczki nie tracą swojego ładunku
 podlegają działaniu pola elektrycznego.
Bufor elektrodowy
" dwa układy buforów:

ciągły - do naczyń i do \
elu bufor o takim samym pH

nieciągły (wielofazowy)  bufory do naczyń i do \
elu ró\
ne
Jony pochodzące z \
elu wędrują jako pierwsze, następnie porusza się próbka i na końcu jony
z buforu do naczyń elektrodowych.
2
Elektroforeza natywna - Metoda Ornstein a  Davis a
' układ nieciągły, niedenaturujący
' ruchliwość białka zale\
y od jego ładunku, wielkości i kształtu cząsteczki
' pH buforu zapewniające stabilność cząsteczki
' pH buforu ró\
ne od wartości pI cząsteczki
' siła jonowa buforu do próbki stanowi 1/2 - 1/5 siły jonowej buforu elektrodowego
' stosuje się \
el H" 7.5%
Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) - Metoda Laemmli ego
' do wyznaczania względnych mas cząsteczkowych
' nieciągły gradient stę\
enia \
elu
- \
el zagęszczający  4.5%
- \
el rozdzielający  8.0%
' nieciągły gradient buforów
- bufor do próbki  Tris-HCl, pH 6.8, SDS, EDTA, 2-merkaptoetanol, glicerol, błękit
bromofenolowy
- bufor do \
elu zagęszczającego - Tris-HCl, pH 6.8, SDS
- bufor do \
elu rozdzielającego - Tris-HCl, pH 8.8, SDS
- bufor elektrodowy  glicyna / Tris, pH 8.3, SDS
Po usunięciu SDS-u białka powracają do swej natywnej struktury
Siarczan dodecylu sodu (SDS)
�ć detergent anionowy - ujemny ładunek w szerokim zakresie pH
�ć ujemny ładunek SDS rozbija białka kompleksowe na podjednostki
�ć łańcuch polipeptydowy białka wią\
e SDS porcjonalnie do swej względnej masy
cząsteczkowej (1.4g SDS na 1g polipeptydu)
�ć polipeptyd uzyskuje silny ładunek ujemny
�ć polipeptydy przyjmują formę pręta opłaszczonego cząsteczkami SDS
�ć polipeptydy wędrują do anody
�ć ruchliwość zale\
y tylko od względnej masy cząsteczkowej polipeptydów
2  merkaptoetanol lub ditiotreitol (DTT)
- cysteina zawiera grupę tiolową (-SH) która spontanicznie tworzy mostki disiarczkowe
(-S-S-) z inną grupą tiolową. Wiązanie disiarczkowe jest wiązaniem kowalencyjnym i nie
jest rozrywane przez SDS
- 2-merkaptoetanol i DTT są silnymi reduktorami - rozrywają wiązania disiarczkowe.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)
�ć działa ochronnie (konserwant); chelatuje dwuwartościowe kationy, co redukuje
aktywność enzymów proteolitycznych, dla których jony wapnia i magnezu są
kofaktorami
Glicerol
- słu\
y do zagęszczania próbki, co zapobiega dyfuzji próbki w czasie nakładania do
studzienek
Błekit bromofenolowy
3
- pomocny przy nakładaniu próbki (widać próbkę w czasie nakładania) i w śledzeniu
rozdziału elektroforetycznego (wędruje wraz z czołem elektroforezy)
GRANICA śELI I BUFORÓW
Gradientowi skokowemu gęstości \
eli, pH i składu buforów towarzyszy zjawisko odmiennej
ruchliwości jonów chlorkowych i glicynianowych w \
elu zagęszczającym i rozdzielającym.
Glicyna w pH poni\
ej 9 jest słabo zdysocjowana i równowaga reakcji dysocjacji:
+
H2NCH2COO H2NCH2COO + H+
przesunięta jest w lewo. Zatem w \
elu zagęszczającym o pH 6.8 równowaga reakcji
dysocjacji glicyny przesunięta jest w stronę jonu obojnaczego (mała ruchliwość glicyny w
polu elektrycznym). Jon Cl  obecny w \
elach ma znacznie większą ruchliwość ni\
glicyna.
Polipeptydy, błękit bromofenolowy mają większą ruchliwość ni\
glicyna, ale mniejszą ni\

jony Cl  . Niskie stę\
enie \
elu zagęszczającego nie stanowi przeszkody sterycznej dla białek.
Pod wpływem przyło\
onego pola elektrycznego wszystkie jony zaczynają się poruszać w
kierunku anody, najszybciej jon Cl  i bardzo wolno glicyna. Tworzy się gradient stę\
enia
jonów i spadek przewodnictwa \
elu zagęszczającego. Powstaje gradient potencjału w \
elu i
wolniejsze jony są przyspieszane - próbka ulega zagęszczeniu do bardzo wąskiej strefy. Kiedy
czoło rozdziału osiąga \
el rozdzielający (pH 8.8) jony glicynianowe przybierają ładunek
ujemny i wyprzedzają białka. Większe stę\
enie procentowe \
elu rozdzielającego działa na
zasadzie sita molekularnego - białka wędrują zgodnie z masą cząsteczkową.
Etapy elektroforezy SDS-PAGE
1. Nało\
enie próbki do studzienki w \
el zagęszczającym
2. Podłączeniu pola elektrycznego
3. Rozdzielanie cząsteczek według wielkości względnych mas cząsteczkowych
4. Wyłączenie zasilania
5. Wyjęcie \
elu z kasety
6. Wybarwieniu \
elu
Barwienie \
eli kumazyną
" Czułość detekcji: 1 0.5 �g białka
" Kumazyna (Coomassie Brilliant Blue R250) wią\
e się niespecyficznie z białkami.
Wiązanie jest prawie stechiometryczne
" Metoda mniej czuła ni\
barwienie srebrem
" Szeroko stosowana ze względu na szybkość i łatwość barwienia. śel zanurza się w
roztworze barwnika (25% MeOH, 10% CH3COOH, 0.1% CBB). Barwnik
niezwiązany z białkiem usuwa się w etapie odbarwiania \
elu. Białka dają niebieskie
prą\
ki na bezbarwnym tle.
" aby uniknąć pęknięcia \
elu w czasie suszenia, do ostatniego płukania dodać 1%
glicerol.
" Wybarwianiu peptydów (Mr <10 000), \
el najpierw utrwala się w roztworze
zawierającym glutaraldehyd, aby uniemo\
liwić dyfucję peptydów i ich wypłukowanie
w czasie dalszych etapów barwienia.
Barwienie \
eli srebrem
- czułość metody: 1 5 ng białka
- czułość (poziom detekcji) zale\
y od: jakości u\
ywanych odczynników, czystości u\
ywanych
naczyń, trzymania się przepisu barwienia
4
- barwienie polega na nasyceniu \
elu jonami srebra i wywołaniu obrazu przez działanie
formaldehydem, który redukuje jony srebra do srebra metalicznego dając nierozpuszczalny
brazowy precypitat.
Analiza \
eli
" jakościowa (wzór elektroforegramu, względne masy cząsteczkowe)
" ilościowa (natę\
enie barwy poszczególnych prą\
ków - denzytometria)
5