BIBLIOTEKI DNA
I. Biblioteka genomowa jest zbiorem różnych fragmentów genomowego DNA danego organizmu, wklonowanych do cząsteczek
wybranego wektora genetycznego. Reprezentatywna biblioteka zawiera fragmenty, które łącznie obejmują cały genom organizmu.
Przygotowanie biblioteki obejmuje następujące etapy:
1. Izolacja DNA. W zależności od typu biblioteki, którą pragniemy uzyskać izolujemy całkowity DNA lub DNA z danego typu organelli,
np. jąder, mitochondriów.
2. Fragmentacja DNA. DNA poddajemy fragmentacji z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych lub metod fizycznych takich jak np.
sonikacja. Trawienie restrykcyjne (częściowe) wykonuje się na ogół w taki sposób, by uzyskać fragmenty dłuższe niż wynikałoby to z
rozmieszczenia miejsc restrykcyjnych. Dzięki klonowaniu dłuższych fragmentów można uzyskać reprezentatywną bibliotekę
obejmującą mniejszą liczbę klonów. W przypadku zastosowania sonikacji należy uwzględnić fakt, że powoduje ona powstanie
fragmentów zawierających jednoniciowe końcówki. Dlatego przed ligacją z wektorem należy wykonać dodatkowy zabieg, celem
którego będzie uzyskanie końcówek dwuniciowych.
3. Ligacja z wektorem. Każdy fragment DNA, który ma być stabilnie utrzymywany w bibliotece, musi zostać połączony z cząsteczką
DNA wektora genetycznego. Ze względu na znaczną długość klonowanych fragmentów genomowego DNA do tego celu
wykorzystujemy wektory konstruowane na bazie faga  lub kosmidy.
4. Transformacja. DNA biblioteki należy umieścić w komórkach E.coli lub drożdży, które następnie rozsiewane są na szalki selekcyjne
w celu uzyskania pojedynczych klonów, z których każdy zawiera inny fragment genomu. Biblioteka na tym etapie może zostać poddana
przeglądowi, np. z wykorzystaniem testu hybrydyzacji kolonijnej, celem którego jest identyfikacja klonów zawierających określoną,
poszukiwaną sekwencję.
II. Biblioteka cDNA jest zbiorem cząsteczek reprezentujących sekwencje ulegające transkrypcji w danym organizmie. Przygotowanie
biblioteki cDNA obejmuje następujące etapy:
1. Izolacja RNA. Zdecydowana większość cząsteczek RNA izolowanych z komórek reprezentuje dojrzałe transkrypty genów. Jeżeli
chcemy uzyskać bibliotekę zawierającą wyłącznie klony kodujące białka, należy oddzielić mRNA od pozostałych typów RNA tj. rRNA,
tRNA, snRNA.
2. Synteza cDNA. Syntezę cDNA wykonuje się z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy oraz dwóch typów starterów. Startery z
sekwencją poli(T) przyłączają się do sekwencji pola(A), obecnych na 3 końcach dojrzałych cząsteczek mRNA. Od tego miejsca
odwrotna transkryptaza rozpoczyna syntezę pierwszej nici cDNA. Do uzyskania biblioteki cDNA stosować można również krótkie
startery o przypadkowej sekwencji (ang. random primer). Oligonukleotydy te przyłaczają się do różnych obszarów sekwencji RNA co
ułatwia syntezę dłuższych cząsteczek cDNA niż w przypadku użycia wyłącznie starterów poli(T).
3. Ligacja z wektorem. Do klonowania sekwencji cDNA używane są zazwyczaj wektory genetyczne, które oprócz klonowania
umożliwiające również nadekspresję wklonowanych fragmentów.
4. Transformacja. Wybór organizmu gospodarza, do którego wprowadzamy bibliotekę cDNA zależy od sposobu, w jaki będziemy
przeprowadzać identyfikację poszczególnych klonów, np. E.coli - w przypadku hybrydyzacji kolonijnej, Saccharomyces - w przypadku
drożdżowego systemu dwuhybrydowego.
III. Zastosowanie bibliotek DNA. Zarówno biblioteki genomowe jak i cDNA wykorzystywane są do identyfikacji i charakterystyki
nowych genów. Identyfikację konkretnych klonów danego genu wykonuje się zazwyczaj z wykorzystaniem testu hybrydyzacji, czyli
oddziaływań pomiędzy sekwencją DNA klonu a sekwencją odpowiedniej sondy. Ponadto do identyfikacji klonów cDNA wykorzystuje się
również fakt, że w komórkach gospodarza, np. w bakteriach lub drożdżach, można uzyskać ekspresję kodowanych przez nie białek.
Identyfikacja danego klonu odbywa się wówczas na drodze oddziaływań białka danego klonu ze znanym białkiem (test dwuhybrydowy) lub
z przeciwciałem.
Wybór biblioteki do identyfikacji danego genu zależy od tego, jakie informacje na jego temat chcemy uzyskać. Biblioteki genomowe
umożliwiają poznanie kompletnej sekwencje danego genu, tzn. egzony, introny, promotory i inne sekwencje regulatorowe (enhancery i
silencery), sekwencje międzygenowe, powtórzone itd. Klony genomowe umożliwiają również określenie położenia poszczególnych genów
względem siebie. Biblioteki cDNA zawierają natomiast niemal wyłącznie sekwencje odpowiadające dojrzałym cząsteczkom RNA, w tym
również modyfikacje powstające w wyniku dojrzewania RNA, np. sekwencje poli(A) na 3 końcu lub zmiany dokonane w wyniku
redagowania RNA (ang. editing). Jedną z zaletą klonów bibliotek cDNA jest możliwość poznania na ich podstawie pełnych sekwencji
aminokwasowych kodowanych przez nie białek. Ponadto klony cDNA można bezpośrednio wykorzystać do syntezy mRNA i białek in vitro.
Uzyskanie pełnej informacji na temat struktury danego genu możliwe jest w wyniku porównania jego sekwencji genomowej z
sekwencją cDNA. W ten sposób można zidentyfikować pozycje intronów i eksonów, oraz ich organizację w różnych wariantach
alternatywnego splicingu. Miejsce w sekwencji genomowej, odpowiadające pozycji poli(A) w sekwencji w cDNA, oznacza pozycję w której
kończy się transkrypcji danego genu.
1
 2