15.04.2005 - Ćwiczenia 8
TEMAT: APOPTOZA
Apoptoza - programowana śmierć komórki, przebiega zarówno w procesach fizjologicznych jak i patologicznych, jest wynikiem ekspresji określonych genów i zachodzi w wyniku określonych zmian biochemicznych. Odgrywa zasadniczą rolę w homeostazie organizmu zarówno w trakcie procesów rozwojowych jak i w rozwoju postembrionalnym. Komórki ogona kijanki, przewody Mullera u samców, mezenchyma między palcami kręgowców - giną w wyniku apoptozy. Apoptoza dotyczy także złuszczania się nabłonków (np. macicy), inwolucji narządów, oraz wielu chorób tj. AD, usuwane są także zbędne i szkodliwe komórki.
Nekroza - śmierć komórki pod wpływem czynników uszkadzających
NEKROZA
Niespecyficzna degradacja DNA
Wzrost objętości i pęcznienie komórki
Uszkodzenie organelli komórkowych
Obrzęk mitochondriów
Przenikanie składników organelli do cytoplazmy
Uszkodzenie chromatyny
Liza komórki i jej organelli
Destrukcja organelli komórkowych i chromatyny
Fagocytoza przez kmórki układu immunologicznego z wywołaniem stanu zapalnego
Niezależna od ATP
APOPTOZA
Precyzyjna i charakterystyczna degradacja DNA
Zmniejszenie objętości komórki
Nieuszkodzone organella komórkowe zachowują integralność
Grube ziarna chromatyny powstałe pod wpływem endonukleaz gromadzą się na obwodzie jądra komórkowego
Fragmentacja chromatyny
Rozpad komórki
Tworzenie się i uwalnianie ciałek apoptotycznych
Nienaruszona struktura organelli
Fagocytoza przez sąsiadujące komórki towarzyszące bez stanu zapalnego
Wymaga dopływu energii
Czynniki indukujące i hamujące apoptozę:
Biologiczne:
Hamujące
Czynniki wzrostu
Estrogeny, androgeny
Ligand CD-40
Białko BCL-2
Białka wirusowe
Chemiczne:
Inhibitory proteaz cysteinowych
Fenobarbital
Fizyczne:
Indukujące
Brak czynników wzrostu
Rodzina białek TNF
Neurotransmitery
Glukokortykoidy
Infekcje wirusowe
Onkogeny
Geny supresorowe nowotworów
Wolne rodniki
Cytotoksyczne limfocyty T
Etanol, aldehyd mrówkowy
Leki cytostatyczne
Wolne rodniki
Promieniowanie gamma, UV
Wysoka temperatura
Przebieg apoptozy:
Faza indukcji
Zadziałanie czynników spustowych - czynniki wzbudzające apoptozę
Przekazanie sygnału z układu receptorowego - następuje przez szereg cząsteczek pośredniczących tj. FADD, TRADD
Modulowanie sygnału - regulowany przez cząsteczki rodziny białek bcl-2
Faza wykonawcza - pobudzenie grupy kaspaz prowadzi do reakcji lawinowej i w rezultacie do cięcia innych substratów, jej wynikiem jest wejście w fazę zniszczenia
Faza zniszczenia - kończy się fagocytozą, przed nią komórka traci asymetrię części lipidowej błony komórkowej
Szlaki indukcyjne apoptozy:
Zewnętrzny (szlak błonowy) - zależny od układu receptor-ligand CD95/CD95L. Receptor CD95 jest zawieszony w błonie komórkowej i po związaniu się z ligandem CD95 następuje jego trimeryzacja. Po cytozolowej stronie receptor ten zawiera sekwencję DD (Death Domain) dzięki której dołącza się cząsteczka FADD ,bo zawiera także domenę DD na jednym z końców. Na drugim końcu FADD zawiera domenę DED (Death Efector Domain) która aktywuję kaspazę 8 i przez to wywołuje reakcję lawinową kaspaz
wewnętrzny (szlak mitochondrialny) - mitochondria posiadają cytochrom c. Na skutek jego uwalniania zachodzącego przy udziale białek BAX,BAD, BAK oraz białek z rodziny bcl-2 - są to wszystko białka kanałowe dla cytochromu c - tworzy on kompleks z białkiem APAF-1,DATP i prokaspazą 9 zwany apoptosomem. Apoptosom aktywuje łańcuchową reakcję kaspaz
pseudoreceptorowy
Białka trawione przez kaspazy:
białko PARP - bierze udział w rozpoznawaniu uszkodzeń DNA
białko ICAD - proteolina tego białka uruchamia CAD, które tnie DNA
białko Rb - reguluje przejście cyklu komórkowego
białko mdm2 - wiąże się z p53 i reguluje jego stabilność
aktyna
laminina
topoizomeraza I i II
acinus - odpowiedzialne za kondensację chromatyny jądrowej
Rodzaje kaspaz:
są to białka fazy wykonawczej apoptozy
enzymy działające na zasadzie proteazy cysteinowej
znane jest 14 kaspaz, są produkowane w postaci nieaktywnej jako prokaspazy
kaspazy wykonawcze : 3,6,7
kaspazy inicjujące: 8,9,10
kaspaza 3 - składa się z heterodimeru 17kD i 12kD
Nowotwór - nieprawidłowa tkanka, która rozrasta się nadmiernie i niezależnie od mechanizmów kontroli. Rozrost ten spowodowany jest nadmierną i niepohamowaną proliferacją komórek, która następuje nawet po wyeliminowaniu czynnika który ją wywołał - nieczuła na apoptozę.
Nowotwory mogą być: łagodne (nie dają przerzutów i nawrotów), złośliwe (dają przerzuty i nawroty, np. rak - tkanka nabłonkowa i mięsak - tkanka nienabłonkowa), miejscowo złośliwe (dają tylko nawroty a nie dają przerzutów np. rak podstawno-komórkowy)
Elementy obrony nowotworów przed apoptozą:
zwiększony poziom białek antyapoptotycznych bcl-2, bcl-x
inaktywacja białek proapoptotycznych BAX, BAK
wzrost inhibitorów apoptozy IAP(surwiwina), FLIP
białaczki, chłoniaki, glejaki - nadekspresja bcl-2
czerniaki - nadekspresja FLIP
nowotwory przewodu pokarmowego - nadekspresja surwiwiny
Wykrywanie apoptozy:
hemotoksylina Meyera
wybarwienie skondensowanej chromatyny
tworzenie się ciałek apoptotycznych
trawienie
użycie aneksyny U-Cy3 - transport fosfatydyloseryny z błony wewnętrznej na zewnętrzną, dołącza się tam aneksyna U i wykrywa się apoptozę bo z aneksyną idzie jodek propidyny
wykrywanie pociętego DNA - tzn drabinka DNA
metoda TUNEL - wykrywanie fragmentów 3'OH - tam dołączają się znakowane nukleotydy a następnie znakowane przeciwciała
metoda kometkowa - stosowana dla komórek z hodowli, na szkiełko dajemy agarozę, odwirowywujemy komórki i następuje ich liza, wykrywa się dwuniciowe pęknięcia DNA, które wędrują do bieguna +
1