Mikrobiologia Ćw.8
Identyfikacja bakterii metodami serologicznymi
(immunofluorescencja, immunoperoksydazowy, seroneutralizacji, OWD, ELISA)
Lizotypia. Badania biologiczne na zwierzętach.
Odczyn seroneutralizacji (SN) - zobojętniania:
- zobojętnianie czynnika chorobotwórczego (antygenu) przez dodanie do niego przeciwciała (surowica
diagnostyczna)
- odczyn przebiegający w dwu fazach: in vitro i in vivo.
- zobojętnianie wykonane in vitro wyrażające się utratą patogenności, sprawdzamy in vivo na zwierzętach
doświadczalnych (lub innych wrażliwych obiektach biologicznych - test zastosowany w wirusologii)
- w bakteriologii stworzony najczęściej do wykrywania i identyfikacji toksyn bakteryjnych
Odczyn wskaźnika dopełniacza (OWD):
- używany np. do rozpoznawania pałeczek Brucella tzw. odczyn Holta
Odczyn immunofluorescencji (IF):
- reakcja nieznanego antygenu z koniugatem - przeciwciałem znakowanym barwnikiem fluoryzującym
(fluorochromem) np. izocyjaninem fluoresceiny, rodaniną, oranżem akrydyny
- można wykrywać antygeny w tkankach, wydzielinach, wydalinach itp.
FITC - izocyjanin fluorosceiny, po wzbudzeniu emituje kolor zielony
TRITC - izocyjanin tetrametylorodaniny, po wzbudzeniu emituje kolor czerwony
Metoda bezpośrednia:
- badany materiał ( np. rozmaz) nawarstwiamy surowicą diagnostyczną znakowaną fluorochromem, płuczemy w celu
usunięcia przeciwciał niezwiązanych z antygenem i oglądamy w mikroskopie fluorescencyjnym. Koniugat związany z
antygenem świeci zwykle zielonkawym lub żółto-czerwonym światłem.
Metoda pośrednia:
- badany materiał pokrywamy najpierw surowicą diagnostyczną nieznakowaną i po spłukaniu nawarstwia się po raz
drugi znakowanymi przeciwciałami dla białka surowicy diagnostycznej (np. jeśli surowica nieznakowana była
pochodzenia króliczego, koniugatem będzie przeciwciało dla białka królika - antyglobulina)
- metoda pośrednia jest tańsza niż bezpośrednia - pozwala wykrywać jedną antyglobuliną znakowaną wiele
antygenów
- metoda bezpośrednia wymaga znakowanych surowic diagnostycznych dla każdego z poszukiwanych antygenów
Odczyn immunoenzymatyczny (IE) (np. immunoperoksydazowy - IP):
- oparty na tej samej zasadzie co odczyn IF, z tą różnicą, że przeciwciało znakowane jest enzymem (np. peroksydazą
chrzanową, alkaliczną fosfatazą) powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się za pomocą substratu dla
enzymu - chromogenu (np. odczynnik benzydynowy, którego utlenione złogi są widoczne w preparacie w postaci
niebieskobrunatnych plam.
- odczyn ten pozwala na wykazanie antygenu przy użyciu zwykłego mikroskopu
Odczyn ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay):
- odczyn zaliczany do immunoenzymatycznych, różni się od testu peroksydazowego tym, że przeciwciało (lub
antygen - w badaniach serologicznych) jest trwale zaadsorbowany na odpowiednim nośniku (polistyrenie,
polichlorku winylu itp.)
- metoda wysoce czuła, łatwa w wykonaniu, znajduje coraz szersze zastosowanie w mikrobiologii, a zwłaszcza w
badaniach wirusologicznych i immunologicznych
Metoda testem ELISA w kierunku wykrywania np. toksyn bakteryjnych:
- adsorpcja swoistej surowicy antytoksycznej - antytoksyny (przeciwciała przeciwko toksynie) na nośniku
- wypłukanie niezaadsorbowanych przeciwciał
- wprowadzenie materiału badanego na obecność toksyn. W razie ich obecności powstają kompleksy przeciwciało
(antytoksyna) - antygen (toksyna)
- usunięcie niezwiązanego antygenu
- dodanie koniugatu (przeciwciało znakowane enzymem), skierowanego przeciwko powstałemu kompleksowi
- wykrycie powstałego kompleksu - dodanie substratu odpowiedniego dla enzymu i pomiar, np.
spektrofotometryczny natężenia reakcji
Lizotypia:
- podstawa lizotypii - różnice wrażliwości określonych szczepów bakterii na zakażenie różnymi gatunkami
bakteriofagów
- bakteriofagi - wirusy, które namnażają się tylko na wrażliwych bakteriach, powodując ich rozpuszczanie (lizę) -
zmniejszenie zmętnienia hodowli płynnej lub powstanie na bardzo gęsto posianym podłożu stałym ubytków,
zwanych „łysinkami”
- jednym z głównych czynników decydujących o wrażliwości na dany bakteriofag jest antygenowa i chemiczna
budowa powierzchni komórki bakteryjnej
- w przyrodzie istnieją fagi o małej swoistości - atakują kilka gatunków bakterii oraz fagi o wysokiej swoistości -
powodują lizę ściśle określonych szczepów
- fagi o wysokiej swoistości pozwalają na podział jednolitych pod względem biochemicznym, a nawet serologicznym
gatunków na typy fagowe (np. Gronkowce, niektóre Salmonelle, Brucelle czy Klebsielle)
- lizotypia dzięki wysokiej czułości i swoistości znalazła zastosowanie w dochodzeniach epidemiologicznych i
epizootiologicznych (np. wybuch dwu epidemii w dwu różnych miastach - jeśli to samo źródło - bakterie izolowane
od chorych będą należeć do tego samego typu fagowego)
Wykonanie próby:
- bakterie do typowania muszą pochodzić z czystej hodowli
- próbę przeprowadzamy na podłożu stałym Harlteya
- na denku płytki Petriego z tym podłożem rysujemy dermatografem siatkę składającą się z określonej liczby
kwadratów
- podłoże zalewamy 4-5 godzinną hodowlą bulionową drobnoustrojów (4 skala McFarlanda)
- posianą płytkę suszymy z uchylonym wieczkiem przez 15-20 min. w cieplarce
- do poszczególnych kratek wkraplamy odpowiednio rozcieńczone (RTD- rutine test dilution) zestawy bakteriofagów
- po wyschnięciu kropel posiew płytki inkubuje się w 37°C przez 4-6h, a następnie przez noc w temperaturze
pokojowej
- w efekcie posiewu cała powierzchnia płytki pokrywa się zlewającymi się koloniami bakteryjnymi („gazon bakterii”),
a w poszczególnych kratkach pojawiają się w gazonie, różnej wielkości i liczby łysinki
Ocena wyników:
- zależy od stopnia lizy - np. przy typowaniu gronkowców - powstanie więcej niż 50 łysinek lub całkowita liza w
miejscu wkroplenia fagów oznacza silny odczyn - dodatni, mniej niż 50 łysinek to słaby odczyn - ujemny
- wszystkie fagi, które spowodowały silny odczyn, wyznaczają wzór fagowy danego szczepu, np. 7/47/53/54/75 (fagi
używane do typowania określone są zwykle odpowiednimi cyframi
Badanie biologiczne na zwierzętach:
Cel wykonywania:
- izolacja chorobotwórczych drobnoustrojów - z silnie zakażonego materiału w organizmie zwierzęcia
doświadczalnego następuje namnożenie tylko zarazków patogennych. Po jego śmierci z narządów wewnętrznych
można izolować czystą hodowlę
- badanie na obecność toksyn - np. na trzech parach myszek na obecność toksyny botulinowej; na kotach na
obecność enterotoksyny gronkowcowej itp.
- różnicowanie gatunków pokrewnych - np. włoskowca różycy i Listerii (pierwszy niechorobotwórczy dla świnki
morskiej, zjadliwy dla gołębia; drugi nie wywołuje choroby u gołębia, lecz jest patogenny dla świnki morskiej)
- wykazanie chorobotwórczości i zjadliwości - stopień zjadliwości określa się najmniejszą dawkę zarazka powodującą
u 50% zarażonych zwierząt choroby (ID50) lub śmierć (LD50)
Zwierzęta używane do prób biologicznych:
- tanie
- małe zwierzęta laboratoryjne (myszy, szczury, świnki morskie, króliki, wyjątkowo zwierzęta gospodarskie)
- zdrowe
- o wyrównanej kondycji i wieku
- dobrane pod względem wrażliwości na dany drobnoustrój
Badany materiał wprowadza się , zależnie od tropizmu zarazka (najczęściej podskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo, niekiedy przez skaryfikację skóry lub doustnie), określonej licznie osobników
W celu eliminacji wpływu zakażeń bezobjawowych lub nabytej odporności na wyniki badań, zamiast zwierząt konwencjonalnych używamy zwierząt gnotobiotycznych - wiadomo jaka flora (bakterie i wirusy) i fauna (pierwotniaki, pasożyty wyższe) je zasiedla.
Rodzaje zwierząt gnotobiotycznych:
- zwierzęta aseptyczne (bezbakteryjne i akseniczne) - pozbawione jakichkolwiek obcych organizmów
- zwierzęta gnotobiotyczne (w ścisłym sensie) - uzyskane z poprzednich przez sztuczne zasiedlenie ich czystymi
kulturami jednego lub kilku gatunków drobnoustrojów
- zwierzęta SPF (Specific Pathogens Free) - posiadają normalną florę bakteryjną, ale są wolne od określonych
zarazków chorobotwórczych
W badaniach rutynowych zwierzęta te nie znajdują zastosowania - wysokie koszty (otrzymywanie tych zwierząt i ich chów wymagają specjalnej techniki, dużego nakładu finansowego i aparaturowego
Podstawa oceny wyników badań biologicznych:
-charakterystyczne objawy chorobowe, np. tężca, botulizmu
- typowe zmiany w tkankach i narządach
- mikroskopowe wykazanie zarazków w zakażonym organizmie
Przy braku objawów chorobowych - po pewnym czasie zwierzę badamy: serologicznie - wykazanie obecności w surowicy, swoistych dla danego zarazka przeciwciał lub alergicznie (np. po zakażeniu prątkami gruźlicy).
3