1. Na czym polega metoda South blot?

(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7,4.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia.

5.Hybrydyzacja z sondą.

a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze.

b. Właściwa hybrydyzacja - w tym właśnie etapie wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi.

c. Płukanie filtru - pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.

6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.

2. Czym zajmuje się biotechnologia biała ?Biała - biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska. Opiera się ona na biokatalizie i bioprocesach.

3. Co to jest T-DNA i opiny ?

T-DNA (transformujący DNA) - fragment DNA z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens złożony z sekwencji lewa sekwencja zawiera geny niezbędne do formowania tumoru w prawej części tej sekwencji występują geny odpowiedzialne za syntezę opin.

Opiny - rzadko spotykane w przyrodzie, drobnocząsteczkowe związki organiczne. Związki te to pochodne metabolitów powszechnie występujących w komórkach roślinnych. Najczęściej syntetyzowane są one z aminokwasów (głównie argininy, jak na przykład oktopina lub nopalina). Opiny są dla komórek roślinnych zupełnie bezużyteczne. Stanowią natomiast pożywienie bakterii kolonizujących zaatakowaną tkankę.

4. Do czego jest używany np. fosforan wapnia

Klonowanie zarodków metodą izolacji blastomerów polega na usunięciu osłonki przejrzystej zarodka, gdy występuje on w stadium 4-komórkowym ? składa się z 4 blastomerów (wykorzystywane też są czasami zarodki składające się z 2, lub 8 blastomerów). Następnie umieszcza się go w pożywce pozbawionej jonów magnezu i wapnia, co powoduje osłabienie połączeń pomiędzy blastomerami i rozdzielenie się ich. Rozdzielone blastomery hoduje się w warunkach in vitro do momentu uzyskania przez nie stadium moruli lub blastocysty. Następnie wszczepia się je do macicy samicy-biorcy. Klonowanie tą metodę jest jednak mało skuteczne. Jest to metoda laboratoryjna.

5. PCR - (ang. polymerase chain reaction) łańcuchowa reakcja polimerazy to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Jedną z odmian tej techniki jest tzw. in situ PCR, pozwalający przeprowadzić reakcję PCR wewnątrz komórki. Reakcja, która jest prowadzona w termocyklerach, wymaga: termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów Mg2+ oraz primerów.

Primery (startery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.

Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.

6. Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting, Southern blot) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca wykrywaniu określonych fragmentów DNA . Jej nazwa pochodzi od nazwiska Edwin M. Southern, który ją opisał i przedstawił w roku 1975.

7. Hybrydyzacja northern (ang. northern blotting) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce.

8. Co oznaczaja skróty EcoRI, Taq, Taq1?

EcoRI enzym pochodzący ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje sześcionukleotydową sekwencję, przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie końce" (ang. sticky ends) w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych końców 5'

Taq Polimeraza - Do otrzymywania tego enzymu służą bakterie Thermus aquaticus lub rekombinant innej bakterii, czyli E. coli.
Enzym ten w budowie zbliżony i funkcjonalnie podobny do polimerazy DNA I z E.coli. Specyficzna właściwość to; termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C (optimum działania przy 80°C). Jako polimeraza DNA 5'->3' wymagająca do aktywności matrycy ssDNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. (PCR)

Taq1 - enzym do aktywacji potrzebuje temp 65°C

9. Przedstaw drogę od odkrycia biotechnologicznego do wprowadzenia go do przemysłu biotechnologicznego

Odkrycie ->wybór sekwencji -> wybór „drogi”- sposobu realizacji -> opracowanie receptury -> rozszerzenie procesu na skale doświadczalną ->produkcja próbna-> zapewnienie zgodności z przepisami -> wybór zakładu produkcyjnego -> powiekszenie procesu produkcyjnego na skale przemysłową. Transfer technologi -> produkcja przemysłowa -> produkt

10. Metody wprowadzania DNA do komórki zwierzęcej

1. w postaci fosforanu wapnia do linii komórkowych

2. metoda z zastosowaniem polikationów (Polibren), jonitowanego dekstranu,

3. metoda elektroporacji

4. za pomoca liposomów

5. mikroinekcja

6. metoda wstrzeliwania

11. Czy organizm żywy można opatentować ?

Nie Patenty powinny dotyczyć tylko wynalazków, nie zaś odkryć. Żyjące obecnie organizmy - rośliny, zwierzęta oraz ich geny nie są niczyim wynalazkiem i z tego względu nie powinny podlegać patentowaniu i znajdować się pod prywatną kontrolą.

Tak, Patentowanie żywych organizmów do niedawna nie było możliwe, ponieważ uważano je za część natury, a zatem byty nie podlegające patentowaniu. Sytuacja ta uległa jednak zmianie w 1980 roku, gdy w sprawie Diamonda przeciw Chakrabarty'emu Federalny Sąd Najwyższy Stanów Zjednoczonych wydał bezprecedensowy wyrok, mówiący o tym, że można opatentować żywy organizm - bakterię zdolną trawić olej.

12. Czy plazmid integruje się z DNA gospodarza ?

Tak, Agrobacterium tumefaciens wywołują chorobę nowotworową zainfekowanych roślin przekazując do komórki roślinnej duży plazmid(Ti). Część pzamidu warunkująca choroby ulega integracji z chromosomowym DNA rośliny(T-DNA).

13. Cykl lizogenny i lityczny

Cykl lizogenny, cykl lizogeniczny (biogenny) inaczej lizogenia - odmiana replikacji wirusów, polegająca na wnikaniu materiału genetycznego wirusa do komórki gospodarza i jego replikacji wraz z DNA gospodarza, która nie prowadzi do śmierci (lizy) komórki.

Pierwszym etapem cyklu lizogennego jest, podobnie jak w cyklu litycznym, wniknięcie materiału genetycznego wirusa do komórki gospodarza. Następnie wirusowy DNA integruje do genomu gospodarza. W przypadku wirusów, których materiałem genetycznym jest RNA, RNA musi najpierw zostać przepisane na DNA w procesie odwrotnej transkrypcji. Wirus w genomie gospodarza nazywany jest prowirusem, w przypadku bakteriofagów mówi się o profagu. Materiał genetyczny wirusa jest namnażany podczas replikacji genomu komórki i przekazywany do komórek potomnych

Cykl lityczny - cykl życiowy bakteriofaga polegający na zakażeniu bakterii, produkcji nowych cząstek fagowych, rozpadzie bakterii i uwolnieniu nowych bakteriofagów.

Pierwszym etapem (adsorpcji) jest przyczepienie się bakteriofaga do ściany komórkowej bakterii. Aby przedostać się przez ścianę komórkową wirusy wykorzystują receptory obecne na powierzchni komórki albo za pomocą swoich białek przebijają ścianę komórkową. Następny etap to penetracja - kapsyd pozostaje na zewnątrz, a materiał genetyczny wirusa jest wstrzykiwany do cytoplazmy gospodarza, gdzie wykorzystuje maszynerię komórkową do produkcji nowych cząsteczek wirusa. W przypadku wirusów DNA ich DNA jest przepisywane na RNA, a następnie na jego matrycy powstają białka. Jedno z pierwszych białek, które ulega translacji służy do zniszczenia DNA bakterii. Retrowirusy wykorzystują enzym odwrotną transkryptazę do przepisania RNA na DNA, które następnie znów jest transkrybowane na RNA. Kolejny etap to składanie nowych wirusów - kopii wirionu, który zaatakował komórkę. Ostatni etap to uwolnienie - komórka gospodarza ulega rozpadowi (lizie- stąd nazwa cykl lityczny), a kopie wirusa wydostają się na zewnątrz.

14. Inżynieria genetyczna - to manipulacje obejmujące wprowadzenie do komórek organizmu biorcy ściśle określonego odcinka DNA dawcy z jednym lub paru genami odpowiadającego jednostce transkrypcyjnej celem wywołania trwałych zmian.

15. Definicja genomu i genotypu.

Genom - suma czynników genetycznych

Genotyp - suma lub pewna część informacji określająca zakres możliwości genotypowych organizmów.

16. Co to jest cDNA ?

cDNA (komplementarny DNA, ang. complementary DNA) — DNA uzyskany poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA uzyskanego z komórki. Nazwę tę nosi zarówno pojedyncza cząsteczka, jak i cała biblioteka genowa uzyskana w ten sposób. Ze względu na to, że mRNA pochodzi tylko od aktywnych transkrypcyjnie genów, cDNA reprezentuje w pewnym sensie zestaw informacji genetycznej, wykorzystywanej w komórce, tkance lub narządzie (zależnie od źródła komórek). Cechą charakterystyczną jest brak intronów, co jest wynikiem potranskrypcyjnej obróbki mRNA.

17. Czego dotyczy metoda shot gun?

Metoda shot gun dotyczy konstrukcji biblioteki genowej, polega na poddaniu obcego DNA i DNA wektora trawieniu enzymem restrykcyjnym co spowoduje pocięcie na fragmenty które poddaje się ligacji, która prowadzi do transformacji.

18. Podaj etapy tworzenia biblioteki genomowej człowieka.

Przygotowanie biblioteki obejmuje następujące etapy:

1. Izolacja DNA. W zależności od typu biblioteki, którą pragniemy uzyskać izolujemy całkowity DNA lub DNA z danego typu organelli,

2. Fragmentacja DNA. DNA poddajemy fragmentacji z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych lub metod fizycznych takich jak np.

sonikacja. Trawienie restrykcyjne (częściowe) wykonuje się na ogół w taki sposób, by uzyskać fragmenty dłuższe niż wynikałoby to z

3. Ligacja z wektorem. Każdy fragment DNA, który ma być stabilnie utrzymywany w bibliotece, musi zostać połączony z cząsteczką

4. Transformacja. DNA biblioteki należy umieścić w komórkach E.coli lub drożdży, które następnie rozsiewane są na szalki selekcyjne

w celu uzyskania pojedynczych klonów, z których każdy zawiera inny fragment genomu. Biblioteka na tym etapie może zostać poddana

19. Co to są biblioteki genomowe?

to kolekcja klonów (zazwyczaj bakterii), która jako całość zawiera co najmniej jedną kopię każdej sekwencji DNA obecnej w genomie organizmu, którego bibliotekę genomową utworzono.

Powstaje przez pocięcie całego genomu danego organizmu enzymami restrykcyjnymi, a następnie połączenie powstałych w ten sposób fragmentów DNA z wektorami (np. plazmidami lub kosmidami), tak że każdy wektor zawiera jeden, losowo wybrany fragment. Wektory te następnie wprowadza się do komórek bakteryjnych (np. bakterii Escherichia coli) - każda bakteria pobiera jeden wektor, a więc zawiera jeden fragment oryginalnego genomu. Taka bakteria, namnażając się, tworzy klon bakteryjny zawierający ten fragment.

20. alfa- komplementacja - na czym polega?

alfa-komplementacji system selekcji Polilinkery większości wektorów są Umi ejscowione w obrębie genu kodującego enzym β-galaktozydazę. Transformacji podlegają bakterie, które posiadają mutację we fragmencie genomu kodującym tą właśnie część enzymu. Umożliwia to dokonanie na odpowiednio przygotowanej pożywce selekcji bakterii, które pobrały zrekombinowany plazmid, gdyż tylko one zabarwione będą na biało. Te bakterie, u których doszło do komplementacji mutacji enzym jest sprawny i rozkłada dodany do pożywki substrat, co powoduje, że taka kolonia przybiera niebieskie zabarwienie.

21. Czym zajmuje się biotechnologia czerwona?

Czerwona - biotechnologia wykorzystywana w ochronie zdrowia, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, czy genoterapii i ksenotransplantologii.

22. Co to jest łysinka fagowa?

Jeśli jako wektora użyto fagów lub innych wirusów, w rezultacie tego procesu otrzymuje się populację łysinek fagowych w szalkach z komórkami bakteryjnymi lub łysinek wirusowych w szalkach z komórkami zwierzęcymi.

23. Czy ATP jest potrzebne w procesie ligacji? Uzasadnij

Tak, ponieważ łączenie DNA następuje poprzez wytworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` w reakcji zależnej od ATP.

24. Sposoby eukariotycznej nadekspresji białek. Krótko opisz.

- splicing (zwykle nie działa dla genów eukariontów wyższych)

-proces dojrzewania białka

-kosztowna i trudna hodowla

25. Co to jest F+ , F- i chyba HFr?

F + Komórka zwierająca plazmid koniugacyjny (płodna, dawca)

F - komórka nie zawierająca plazmidu koniugująca (nie płodna, biorca)

HFr - wodorek fransu ??? czy na pewno to ???

26. Proteasom - jest to wieloenzymatyczny kompleks utworzony z proteaz. Jest odpowiedzialny za degradację enzymów i białek regulatorowych.

Zbudowany jest z cylindra 20S i dwóch regulatorowych kompleksów 19S znajdujących się na obydwu końcach cylindra. Podjednostka 19S rozpoznaje białka, które są przeznaczone do degradacji i odpowiada za jego rozwinięcie i skierowanie do cylindra. Natomiast cylinder jest odpowiedzialny za ich fragmentację. Proteasom degraduje tylko naznaczone wcześniej białka. Znacznikiem tym jest ubikwityna. Wchłonięte przez proteasom białko rozkładane jest do pojedynczych aminokwasów i krótkich peptydów złożonych z 10-12 aminokwasów.

27. Elektroforeza - jest to technika polegająca na rozdziale substancji w polu elektrycznym. Wykorzystuje różnice w szybkości ruchu naładowanych substancji (fazy rozproszonej) względem nieruchomego ośrodka.

28. Najważniejsze etapy w elongacji w procesie translacji i gdzie zachodzą?

Po złożeniu rybosomu, tj. przyłączeniu podjednostki 60S do powstałego układu, przez odpowiednie tRNA dostarczane są kolejne aminokwasy. Rybosom przesuwa się stopniowo wzdłuż nici mRNA, do której na zasadzie komplementarności dopasowują się cząsteczki aminoacylo tRNA. Dopasowanie to dotyczy obszaru antykodonu tj. trójki nukleotydów (z tRNA) "pasujących" do kodonu z mRNA. I tak z kodonem CAC oddziaływać będzie tRNA zawierający antykodon GUG i niosący histydynę.

Do kolejnego aminokwasu dostarczonego w miejsce A rybosomu przez aminoacylo tRNA przyłącza się za pośrednictwem grupy karboksylowej wcześniej odczytany aminokwas występujący w danym momencie - jeszcze w postaci związanej z tRNA - w miejscu P rybosomu. Tzn. jeśli pierwszym kodonem jest AUG, drugim CAC, a trzecim UUU będziemy mieli do czynienia z następującymi zmianami na terenie rybosomu:

1. Do dostarczonej jako drugiej w kolejności histydyny przyłącza się inicjacyjna metionina. Na tRNA histydynowym ( w miejscu A ) tworzy się dipeptyd Met-His i przesuwa się w miejsce P.

2. Do przyłączonej jako trzeciej fenyloalaniny grupą karboksylową przyłączy się dipeptyd Met-His i powstanie trójpeptyd Met-His-Phe, przemieszczany jak poprzednio w miejsce P.

29. Kontrola ekspresji genetycznej

Ujawnienie się funkcji genu pod wpływem różnych czynników wewnątrz i

zewnątrzkomórkowych nazywa się ekspresją genu.

Kontrola wytwarzania białek może następować przez:

-kontrolowanie, kiedy i jak często dany gen ulega transkrypcji

-kontrolowanie procesów składania i dojrzewania pierwotnego

transkryptu RNA

-selekcjonowanie mRNA i decydowanie, który z nich ma ulegać

translacji na rybosomach

-wybiórczą aktywację lub inaktywację białek po tym, jak już

zostały wytworzone

-Najważniejsza kontrola działania większości genów odbywa się na poziomie

TRANSKRYPCJI

30. Co to jest Flavr Savr?

FlavrSavr - pomidor, który był pierwszym przypadkiem komercyjnej, zmodyfikowanej genetycznie rośliny uprawnej i jadalnej, dopuszczonej do spożycia przez ludzi. Wyprodukowany został przez firmę biotechnologiczną Calgen Inc. z Davis w stanie Kalifornia i przedstawiony do oceny Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) w 1992r. Wprowadzony do sprzedaży w 1994,

Pomidory FlavrSavr były bardziej odporne na gnicie, poprzez wprowadzenie do nich antysensownego genu, którego produkt interferował i powstrzymywał produkcję enzymu - poligalakturonazy (patrz: Interferencja RNA). Enzym ten jest normalnie odpowiedzialny za rozkład ściany komórkowej (a zatem mięknięcie tkanki), podczas dojrzewania, starzenia i w końcu psucia się owocu.

31. Etapy transgenezy

- wyizolowanie blastocysty, która powstała ze skrzyżowani dwóch myszy albinosów

- wszczepienie zmienionych genetycznie komórek- powstaje blastocysta chimera

- wszczepienie blastocysty chimery do zastępczej matki - samicy (albinos)

- młode są chimerami i po skrzyżowaniu z albinosami u ich potomstwa będą albo same transgeniczne myszy albo nie transgeniczne myszy

32. Co to jest miRNA, ori i Arg

miRNA (mikroRNA) - jednoniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 21-23 nukleotydów, regulujące ekspresję innych genów. miRNA kodowane są przez genom komórki, jak normalne geny, i transkrybowane przez RNA polimerazę II, tak samo, jak mRNA. Prekursorem są niewielkie RNA, o strukturze spinki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA. Wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność

Miejsce ori - Miejsce na cząsteczce DNA, od którego zaczyna się replikacja. Cząsteczki DNA komórek eukariotycznych zawierają wiele miejsc origin, a prokariotyczne jedno.

Arg - Arginina, (skróty:R, Arg) - organiczny związek chemiczny, jeden z 20 aminokwasów kodowanych przez DNA. Obecność grupy guanidynowej w cząsteczce aminokwasu jest przyczyną jego zasadowego charakteru.

33. Cechy kodu genetycznego. Odpowiedź uzasadnij

-trójkowy - do zakodowania 20 różnych aminokwasów przez cztery rodzaje zasad niezbędne jest, aby podstawowe jednostki kodu genetycznego składały się zawsze z trzech zasad. taka trójka zasad w DNA to kodon. Z 64 rodzajów kodonów trzy nie kodują aminokwasów.

-bezprzecinkowy - między trójkami kodującymi nie ma żadnych dodatkowych elementów

-uniwersalny - kod genetyczny jest taki sam we wszystkich organizmach

-zdegenerowany - jeden aminokwas może być kodowany przez kilka różnych trójek

-niezachodzący - kodony nie zachodzą na siebie

-jednoznaczny - dana trójka koduje zawsze jeden i ten sam rodzaj aminokwasu

34. Czym różni się HSP70 i HSP60 ?

Białko HSP70 - wiąże się z łańcuchem polipeptydowym zasłaniając miejsca mogące związać się z innymi białkami. Białko HSP60 ma kształt beczułki, mogą się zwijać żeby uzyskać swoją strukturę właściwą.

35. Termocykler - urządzenie używane w laboratorium do przeprowadzania PCR. Urządzenie wyposażone jest w blok grzejny z otworami na próbówki (zwane tutaj peceerówkami), w których przeprowadza się reakcję. Urządzenie zapewnia zmiany temperatury bloku zgodne ze wcześniej zdefiniowanym programem i odpowiednie do efektywnego zajścia PCR. Bloki grzejne, by zmieniały swą temperaturę możliwie szybko, są zazwyczaj wyposażone w moduł Peltiera. Niektóre, bardziej zaawansowane termocyklery (np. do przeprowadzania reakcji , mają naczynia rekacyjne chłodzone i grzane powietrzem.

36. Z czego składa się mieszanina ligacyjna?

Mieszanina ligacyjna sklada się z: inserta, wektora, ligazy, ATP, buforu do ligacji fragmenty DNA

37. Które końce łatwiej ulegają ligacji lepkie czy tępe?

-Lepkie końce

38. Co to jest efekt pozycyjny?

Jeden z etapów regulacji ekspresji genów - transkrypcji

Efekt pozycyjny - zależność od regionalnej struktury chromatyny

(rejony eu- lub heterochromatyny)

39. Jakie formy RNA barwią się bromkiem etydryny przy technice nothern blot?

- pre-mRNA

- mRNA

- częściowo wycięte - pośrednie formy miedzy mRNA a pre-mRNA

40. Polilinker - inne nazwy, definicja.

Polilinker - jest to niewielki, sztucznie utworzony odcinek DNA, zawierający

sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych. Są to na ogół

pojedyncze miejsca cięcia w wektorze. Polilinker zazwyczaj wstawiony jest w obrębie

drugiego markera

inaczej syntetyczny odcinek DNA

41. Budowa Plazmidu Ti

- T-DNA (transformujący DNA) - fragment DNA z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens złożony z sekwencji lewa sekwencja zawiera geny niezbędne do formowania tumoru w prawej części tej sekwencji występują geny odpowiedzialne za syntezę opin

42. Kryteria czystości enzymów

-trawienie DNA

-brak 3' 5' specyficznych nukleaz

-brak nukleaz specyficznych dla jednoniciowego DNA

-brak fosfataz

-homogennosć enzymu

43. Wymień badania naukowe jakimi zajmuje się współczesna biotechnologia

- analityka różno kierunkowa

- bioinformatyka

- chemia kombinatoryczna

- diagnostyka

- synteza białek (w tym enzymów)

- genomika

- terapia medyczna (farmakogenetyka, badania kliniczne, marketing)

- produkcja aparatury i odczynników

- mikromacierze

- agrobiotechnologia

- proteomika

- wyciszanie genów

- manipulacje komórkami macierzystymi

- aparatura i odczynniki wspomagające

44. Co to jest klon i klonowanie?

Klon - to populacja identycznych pod względem genetycznym organizmów komórek, wirusów lub cząsteczek DNA . Populacja taka pochodzi z namnożenia pojedynczej kom, organizmu, wirusa czy cząsteczki DNA.

Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną jak dawca. Szczególnym przypadkiem jest twinning, czyli powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt monozygotycznych, gdzie nie można wyróżnić dawcy.

45. Jakiej wielkości odcinki DNA są włączane do wektorów kosmidowych?

Wektory kosmidowe - stosowane do klonowania dużych fragmentów DNA np. operonów prokariotycznych czy genów eukariotycznych. Budowa : są to zmodyfikowane plazmidy zawierające sekwencję cos faga l konieczną przy pakowaniu DNA do kapsydów fago wych. Najprostsze kosmidy zawierają ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencję cos. Modyfikacje tego typu wektorów polegają na zwiększaniu ilości miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element ów umożliwiających analizę klonowanego DNA

46. Jak wykryjemy 5' koniec DNA?

dam metylaza rozpoznaje sekwencję 5' GATC 3'- pozycja N6 adeniny

dcm metylaza rozpoznaje sekwencję 5' CCAGG CCTGG 3' - pozycja C5 cytozyny

47. Omów działanie odwrotnej transkryptazy

Odwrotna transkryptaza, rewertaza, polimeraza DNA zależna od RNA (EC 2.7.7.49) - enzym syntetyzujący nić DNA na matrycy RNA. Proces ten nosi nazwę odwrotnej transkrypcji (por. transkrypcja - przepisywanie z DNA na RNA). Rewertaza wykazuje także aktywność rybonukleazową. Odkrycie tego enzymu zostało w 1975 nagrodzone nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny.Odwrotna transkryptaza występuje u retrowirusów (np. HIV), którym umożliwia przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, które następnie integruje do genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA (hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji.

48. Na czym polega i do czego służy metoda replik mikrobiologicznych?

Metoda replik polega na odciśnięciu stempla na płytce "macierzystej" w celu naniesienia na welwet (pokrywający stempel) wszystkie kolonie, jakie się na tej płytce znajdują. Następnie ten stempel odbija się (replikuje) na nowych płytkach, które między sobą różnią się np stężeniem jonów metali ciężkich. Po określonym czasie inkubacji sprawdza się, które kolonie są odporne w tym przypadku na jony metali ciężkich i przy okazji na jak duże stężenia, co odczytujemy dzięki temu, że potomna kolonia na każdej płytce znajduje się w tym samym miejscu. Metoda ta jest także wykorzystywana przy selekcji mikroorganizmów po mutagenezie.

49. Co to są i do czego służa plazmidy F ?

Plazmid F - występuje w bakterich

50. Kolejnośc klonowania dla wektora retrowirusa

- wniknięcie do komórki gospodarza i „rozpakowanie” wirusa

- synteza kopii DNA przez odwrotną transkryptazę

- synteza drugiej nici DNA - utworzenie dwuniciowej cząsteczki DNA

- integracja z chromosomem komórki gospodarza

- transkrypcja z udziałem polimerazy RNA gospodarza, prowadząca do utworzenia wielu kopii retrowirusowego RNA

- synteza białek kapsydu, białek okrywy i odwrotnej transkryptazy, składanie nowych wirusów i ich uwolnienie przez pączkowanie

51. Co to jest BAC ,YAC i alfa 2 i do czego służą?

-Co to jest BAC ,YAC i alfa 2 i do czego służą?

BAC to sztuczne chromosomy bakteryjne i są koliste podobnie jak naturalne chromosomy bakteryjne. BAC są oparte na plazmidach F naturalnie występujących w E.coli. Wektory BAc używane są do klonowania fragmentów wielkości przynajmniej 300kb.

YAC to sztuczne chromosomy drożdżowe i są one liniowe tak jak DNA wchodzące w skład chromosomu eukariotycznego. Uzywane SA jako wektory do klonowania, oraz do tworzenia cDNA.

52. Podaj przykłady nadprodukcji białek

Nadprodukcja białek mleka u zwierząt

nadprodukcji rekombinowanych białek u E.Coli

53. Jakiej temp. Podczas procesu hydrolizy potrzebuje większość enzymów restrykcyjnych? Znasz wyjątki?

Większość 37°C

Enzym Taq I - 65°C

54. Cykl życiowy faga M13

Każdy bakteriofag przechodzi specyficzny cykl reakcji w celu namnożenia się. Najpierw musi rozpoznać bakterie, w której może się namnożyć, i wiąże się z powierzchnią jej komórki. Następnie wstrzykuje swój kwas nukleinowy, który musi być chroniony przed bakteryjnymi nukleazami występującymi w cytoplazmie. Fagowy genom jest następnie replikowany, transkrybowany, poczym musi ulec translacji, w trakcie której produkowane są białka płaszcza i ogona (jeśli jest obecny).Następnie kompletne wiriony są składane i następuje ich uwolnienie z komórki bakterii. Różne fagi używają różnych strategii do wykonania każdej z tych reakcji.

55. Czemu wirusy są nazywane bezwzględnymi pasożytami, jakie rodzaje kwasów nukleinowych mają?

Ponieważ nie mogą namnażać się poza ciałem gospodarza, rodzaje kwasów nukleinowych - rybonukleinowy(retrowirusy) i dezoksyrybonukleinowy(wirusy).

56. Biotechnologia - interdyscyplinarna dziedzina nauki (posługująca się wiedzą z biochemii, mikrobiologii i nauk inżynieryjnych), obejmująca różne kierunki techn. wykorzystania materiałów i procesów biol. (w szczególności przebiegających przy udziale drobnoustrojów, kultur tkankowych oraz biokatalizatorów);

57. Porównaj biblioteke genomowa i cDNA

-Biblioteka genomowa zawiera introny

58. Co oznacza pojęcie prawe i lewe ramię? które to które ramie tRNA?

Ramię akceptorowe - składa się ono każdego tzw. szypuły, którą stanowi dwuniciowy odcinek kończący się niesmarowana sekwencja CCA ( 5' - 3'). Dowolnego końca 3' - OH przyłączany jest aminokwas

Ramię D - tworzy tak zwaną pętlę DHU ( dihydrouracylową) sekwencja nukleotydowi pętli jest rozpoznawana przez enzym, który przyłącza aminokwas do tRNA. Oznacza to, że ramie D zawiera informację, jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączony do danej cząsteczki tRNA

Ramię TγC - tworzy tak zwana pętlę pseudouracylową . Dzięki niej możliwe jest przymocowanie tRNA do rybosomu.

Ramię antykodonowe tworzące pętlę antykodonową . Jest to wyróżniona część tRNA która zawiera charakterystyczna trojkę nukleotydowi czyli antykodon. Zadaniem antykodonu jest rozpoznanie kodonu odczytywanej matrycy mRNA.

Ramię zmienne - pełni funkcje pomocnicze.

59. Co to jest sekwencja palindronowa?

Sekwencja palindromowa w genetyce oznacza taką sekwencję DNA, dla której sekwencja komplementarna jest identyczna (przy założeniu, że obie sekwencje czytamy z uwzględnieniem polarności nici; zgodnie z przyjętym obyczajem - od końca 5' do 3'): miejsce działań restryktaz.

60. Terapia genowa - leczenie polegające na wprowadzeniu obcych kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) do komórek. Charakter lub informacja genetyczna zawarte we wprowadzonym DNA lub RNA powinny wywierać efekt terapeutyczny. Mechanizmy działania wprowadzonych kwasów nukleinowych mogą być następujące:

• Zmuszenie komórki do produkcji białka kodowanego przez wprowadzony gen;

• produkcja białek potrzebnych, których w organizmie brakuje lub występują w niedomiarze (np. w defektach metabolicznych, takich jak hemofilia);

• produkcja białek prowadzących do śmierci komórki (apoptozy) - potencjalne zastosowanie do terapii przeciwnowotworowych (patrz: nowotwór).

• Hamowanie lub modulację ekspresji genów przez wprowadzenie:

• dominujących alleli genów kodujących nieaktywne lub defektywne białko;

• antysensowych kwasów nukleinowych wchodzących w interakcję z mRNA (patrz np.^[1]);

• pułapek (wabików) oligonukleotydowych, wychwytujących czynniki transkrypcyjne;

• małych interferujących RNA (siRNA) służących wyciszeniu ekspresji konkretnego genu;

• rybozymów (lub DNAzymów) chemicznie modyfikujących materiał genetyczny.

Metoda in vivo polega na podaniu nośnika kwasu nukleinowego do ustroju pacjenta. W tym celu najczęściej stosuje się wektory wirusowe, które potrafią wprowadzać DNA lub RNA do komórki. DNA plazmidowe (zobacz: plazmid), nie podawane z żadnym nośnikiem, jest w stanie wnikać jedynie do komórek mięśni szkieletowych.

Metoda ex vivo polega na wyizolowaniu komórek z organizmu pacjenta, wprowadzeniu do nich terapeutycznego DNA lub RNA (zobacz: transfekcja) i ponownym podaniu ich pacjentowi.

61. Mutageneza - zarówno spontaniczny jak i wywołany przez mutageny proces powstawania zmian - mutacji w DNA.Mutageneza jest wykorzystywana w hodowli roślin uprawnych w celu wyprowadzenia nowych odmian. Jest też wykorzystywana w badaniach naukowych (np. analiza ekspresji genów). Mutageneza może być losowa lub ukierunkowana - wywołująca mutację w określonym miejscu w sekwencji DNA.

mutageneza ukierunkowana, technika → inżynierii genetycznej prowadząca do sztucznego wywoływania → mutacji w ściśle określonym miejscu genomu; zaprogramowaną mutację określonego genu przeprowadza się stosując przynajmniej jedną z trzech podstawowych metod zmian bezpośrednich DNA: insercję, delecję lub substytucję nukleotydów; w zależności od stosowanych metod wyróżnia się mutagenezę sterowaną oligonukleotydami, kasetową, insercyjną i inne.

62. GMO, czyli organizmy zmodyfikowane genetycznie (organizmy transgeniczne) to rośliny, zwierzęta i drobnoustroje, których geny zostały celowo zmienione przez człowieka. Rekombinacja DNA i inne pokrewne techniki pozwalają tworzyć organizmy o odmiennych właściwościach niż macierzy gatunek. Pierwszy "GMO "został stworzony w 1973 przez Stanley Cohena i Herberta Boyer'a.

63. Rośliny transgeniczne (modyfikowane genetycznie) - przykłady

Kukurydza
- odporność na owady - wszczepiony został gen odpowiedzialny za wytwarzanie białka, które zjadane przez owada niszczy jego przewód pokarmowy co doprowadza do śmierci. Białko to "działa" tylko w organizmach niektórych, ściśle określonych gatunków owadów-szkodników, nie jest aktywne np. u człowieka.
- wytwarzanie substancji używanych do wyrobu leków lub szczepionek,
Ziemniaki
- wzrost zawartości skrobi, ponadto odmiany składające się wyłącznie z amylopektyny - u odmian tradycyjnych 20% skrobi to amyloza, którą usuwa się z ziemniaków przemysłowych co podnosi koszty,
- odporność na herbicydy, stonkę ziemniaczaną, wirusy,
- "słodkie ziemniaki" - wprowadzenie genu odpowiedzialnego za wytwarzanie słodkiego białka - taumatyny,
- odporność na ciemnienie pouderzeniowe - większa trwałość,
- mała zawartość glikoalkaloidów - substancji szkodliwych na człowieka, występujących w surowych ziemniakach.
Pomidory
- spowolnienie dojrzewania, większa trwałość
- większa zawartość suchej masy,
- poprawa smaku (?),
- intensywniejsza barwa, cieńsza skórka.
Truskawki
- wyższa słodkość owoców,
- spowolnienie dojrzewania,
- odporność na mróz.

64. Zastosowanie roślin transgenicznych

-Rolnictwo:

Odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin, środki chwastobójcze.

Odporność na choroby powodowane przez grzyby, wirusy, bakterie.

Odporność na owady - szkodniki.

Odporność na niekorzystne warunki środowiska

Poprawa cech jakościowych oraz użytkowych roślin

-Medycyna

szczepionki

65. Przykłady roślin transgenicznych wykorzystywanych do produkcji szczepionek.

Ziemniaki - zawierające gen pochodzący od bakterii E.coli. W rezultacie tej zmiany ziemniaki gromadziły obce białko. Zostały przeprowadzone testy na ludziach, którym podawano zmodyfikowane, surowe, ziemniaki. Okazało się, że wytworzyli oni przeciwciała w odpowiedzi na podany antygen.

Sałata - produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B można się szczepić jedząc sałatę 

66. Oczyszczanie genomowego DNA zwykle przeprowadza się przygotowujac najpierw jądra komórkowe , oddzielone od innych organelli (mitochondria i chloroplasty zawieraja DNA, który mógłby zanieczyszczać preparat jądrowego DNA), a następnie usuwając białka, lipidy i inne niepożądane makrocząsteczki - za pomocą trawienia proteazą i ekstrakcji fazowej (mieszanina fenol - chloroform).

67. Scharakteryzuj system binarny roślin transgenicznych. - wektory do transformacji roślin

Agrobacterium tumefaciens wywołują chorobę nowotworową zainfekowanych roślin przekazując do komórki roślinnej duży plazmid(Ti). Część plazmidu warunkująca choroby ulega integracji z chromosomowym DNA rośliny(T-DNA).

Guzy „crown gall”stanowią duży zbiór niezróżnicowanych komórek, z których wiele zawiera T-DNA. Wiele komórek nie zawiera T-DNA, co implikuje, że T-DNA aktywnie zapobiega różnicowaniu kodując syntezę substancji blokujących różnicowanie i że substancja ta może drogą dyfuzji przenikać do komórek sąsiednich.

68. Wektor genetyczny - wykorzystywana powszechnie w inżynierii genetycznej, niewielka cząsteczka DNA (taka jak plazmid czy DNA wirusów), służąca wprowadzeniu żądanej sekwencji DNA do komórki.

69. Rodzaje wektorów: wektory plazmidowe, wektory fagowe, kosmidy, wektory ekspresyjne, wektory wahadłowe, wektory sekrecyjne, sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC), sztuczne chromosomy bakteryjne

-Kosmidy - sztucznie wytworzone wektory używane w inżynierii genetycznej. Kosmidy tworzy się łącząc plazmidy z sekwencją cos bakteriofaga lambda. Dzięki temu tego rodzaju wektor zyskuje właściwości charakterystyczne zarówno dla plazmidu jak i dla faga

-Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) jest zrekombinowanym DNA bazującym na DNA plazmidowym bakterii pałeczki okrężnicy (Escherichia coli), używanym w inżynierii genetycznej, jako wektor do klonowania DNA

-Sztuczny chromosom drożdżowy (YAC) jest zrekombinowanym chromosomem drożdży Saccharomyces cerevisiae używanym w inżynierii genetycznej, jako wektor do klonowania DNA.

70. Cechy dobrego wektora - pojemność, zdolność inkorporacji do genomu komórki docelowej, usunięte wszystkie geny wirulencji.

71. Bakteriofag, fag - wirus atakujący bakterie. Przeważnie dany bakteriofag zdolny jest do infekcji tylko jednego gatunku (a czasem tylko szczepu) bakterii. Mogą przybierać kształty złożone (buławkowate), pałeczkowate lub wielościenne.

Struktura bakteriofagi - Zakażenie następuje w ten sposób, że kwas nukleinowy jest przez ogonek wstrzykiwany do komórki bakterii, część białkowa wirusa (tzw. otoczka czyli kapsyd) pozostaje na zewnątrz. Bakteriofagi zjadliwe namnażają się i zabijają bakterię, łagodne zaś wbudowują się w chromosom komórki bakteryjnej i mogą istnieć przez wiele pokoleń bakterii.

72. Niektóre ważne enzymy mające zastosowanie w technikach inżynierii genetycznej. Ligaza DNA i ligacja. Odwrotna transkryptaza (krótka charakterystyka).

Ligaza DNA - enzym łączący wolne końce cząsteczek DNA. Łączenie DNA następuje poprzez wytworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` w reakcji zależnej od adenozynotrójfosforanu (ATP). Reakcja katalizowana przez ligazę nazywa się ligacja.

Odwrotna transkryptaza, rewertaza, polimeraza DNA zależna od RNA - enzym syntetyzujący nić DNA na matrycy RNA. Proces ten nosi nazwę odwrotnej transkrypcji (por. transkrypcja - przepisywanie z DNA na RNA). Rewertaza wykazuje także aktywność rybonukleazową.

Odwrotna transkryptaza występuje u retrowirusów (np. HIV), którym umożliwia przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, które następnie integruje do genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA (hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji.

Odwrotna transkryptaza podczas syntezy DNA robi dużo błędów, ponieważ nie ma aktywności korekcyjnej. Pozwala to na szybką akumulację mutacji w organizmach takich, jak wirus HIV, które wykorzystują ją do replikacji. Inhibitorem rewertazy jest AZT.

73. Bakteriofag lambda

Pochodne faga lambda są zdecydowanie najczęściej stosowanymi wektorami fagowymi. W porównaniu z wektorami plazmidowymi pozwalają one na znacząco prostsze klonowanie większych fragmentów DNA, co więcej wydajność infekcji komórek bakteryjnych fagiem jest wyższa niż wydajność transformacji. Genom bakteriofaga lambda to dwuniciowa cząsteczka DNA (dsDNA) od długości 48502 bp, niosąca około 40 genów. Ważny z punktu widzenia inżynierii genetycznej jest fakt, że dojrzałe cząstki fagowe zawierają liniową cząsteczkę DNA, która jest zakończona tzw. odcinkami cos (cohesive ends). Cos są ponadto niezbędne podczas umieszczania wirusowego genomu w białkowym kapsydzie.

Po infekcji komórki bakteryjnej fagiem lambda mogą zachodzić dwa modele wydarzeń. Cykl lityczny, prowadzący do lizy bakterii i uwolnienia namnożonych cząstek wirusowych, bądź cykl lizogenny, podczas którego materiał genetyczny faga wbudowuje się do genomu gospodarza, zakażenie wirusem przebiega więc niejako poprzez fazę utajenia. Przełączenie cyklu lizogennego w lityczny może nastąpić w każdym momencie pod wpływem różnych czynników, jak choćby zmiana temperatury czy składu pożywki w warunkach in vivo.

74. PLAZMIDY - RODZAJE I CHARAKTERYSTYKA

Plazmidy to kwasy nukleinowe ktore maja zdolność do samoreplikacji
- episomy - plazmidy które mogą rekombinowac z DNA jądrowym i wlaczac sie do genomu (albo calkiem albo fragmentarycznie)
- plazmidy wystepuja w cytoplazmie organizmow prokariotycznych
- w komórkach moze wystepowac kilka rodzajów plazmidów jesli sa one w stosunku do siebie „przyjzane” (jesli sa jadrowe).
- plazmidy namnażają sie w komórce niezaleznie od jej podziałów
- plazmidy dzielimy na :

1. naturalne
2. sztuczne (powstaja w wyniku zmiany plazmonu - p.dimeralne)

- wytwarzaja antybiotyki

R - odporny na antybiotyki Ti - agrobacterium tumefaciens
F - przenoszenie

75. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS I JEGO STRATEGIA ZYCIOWA

Jest to bakteria atakująca rośliny - wprowadza swoje geny ( zawarte z plazmidzie Ti) do komórki roślinnej.

· jest glebową bakterią patogenną - powoduje choroby roślin: guzowatość korzeni (A.tumefaciens) lub przerosty korzeni (A.rhizogenes)
· Gatunki z rodzaju Agrobacterium: m.in. A.tumefaciens i A.rhizogenes
· Gram (-)
· zawierają duże plazmidy (megaplazmidy): Ti (A.tumefaciens) i Ri (A.rhizogenes)
· potrafi przenosić fragment tego plazmidu (tzw. T-DNA) do genomu komórek roślinnych
· przenoszony fragment niesie funkcje determinujące syntezę opin - związki potrzebne do wzrostu bakterii (źródło węgla i azotu)
· każdy ze szczepów może utylizować jedną z trzech klas opin:
o oktopinę i jej pochodne (lizopina, kwas oktopinowy, histopina)
o nopalinę i jej pochodne (kwas nopalinowy, agrocypina)
o agropinę
· infekuje rośliny z 331 rodzajów, 643 gatunków
· infekcyjność zależy od gatunku i organu rośliny
· gatunki jednoliścienne są "mniej" wrażliwe na infekcję Agrobacterium

76. TRANSFORMACJA Agrobacterium
Bakteria glebowa Agrobacterium tumefaciens powoduje powstawanie guzów we wszystkich badanych pod tym względem roślinach dwuliściennych i w niektórych jednoliściennych. Za tworzenie się guzów odpowiedzialny jest plazmid Ti (ang. tumor inducing). Fragment tego plazmidu przenoszony jest do komórki roślinnej i stabilnie integruje w genom. Zawarte w tym fragmencie geny ulegają ekspresji w komórce roślinnej. Integrujący fragment nazwano T-DNA (transferred DNA). Analiza genetyczna wykazała, że dwa regiony plazmidu Ti są niezbędne do powstania guza: T-DNA i region vir (virulence). Mutacje we fragmencie T-DNA zmieniają morfologię guza, natomiast mutacje w regionie vir zaburzają jego powstanie. T-DNA zawiera geny które są związane z produkcją fitohormonów (auksyn, cytokinin, kwasu indolilooctowego). Nadprodukcja tych hormonów podwyższa tempo podziału komórki, zapobiega różnicowaniu i w rezultacie powoduje powstanie guza. Inne geny T-DNA odpowiedzialne są za syntezę aminokwasów i pochodnych cukrowych zwanych opinami, oraz za ich wydzielanie z komórki roślinnej. Opiny zawarte w guzie tkanki roślinnej mogą służyć jako źródło węgla i azotu dla Agrobacterium.
Wykazano, że obszar T-DNA zawiera sekwencje niezbędne do przeniesienia go do komórki roślinnej. Niezbędny do przeniesienia T-DNA jest region vir, który jest aktywny nawet gdy znajduje się w innym replikonie. DNA zawarty między granicznymi sekwencjami przenoszony jest do komórki roślinnej z pomocą białek kodowanych przez geny znajdujące się w regionie vir, a następnie integruje w genom roślinny.
Proces manipulowania plazmidem wprowadzanym do rośliny, można podzielić na dwa etapy :
1. Klonowani i zmiany w DNA prowadzone w bakteriach E.coli
2. Wprowadzenie gotowego konstruktu do Agrobacterium, które służy do transformacji rośliny.

77. CHARAKTERYSTYKA PLAZMIDU Ti
Charakterystyka plazmidu Ti
· duży kolisty plazmid zawierający min. geny:
- wirulencji
- katabolizmu specyficznych dla szczepu opin
- biosyntezy opin specyficznych dla szczepu
- związane z biosyntezą hormonów roślinnych - specyficzne dla szczepu
· geny wirulencji i katabolizmu opin są zgrupowane razem i znajdują się poza obszarem T-DNA
· geny biosyntezy opin oraz geny związane z syntezą hormonów roślinnych znajdują się w obszarze T-DNA
· obszar T-DNA jest wyznaczony przez specyficzne sekwencje DNA (bezpośrednie powtórzenia o długości 25 pz) zwane granicznymi (LB- Left Border i RB - Right Border)
· tylko prawa sekwencja graniczna (RB) jest wymagana do rozpoznania i przeniesienia T-DNA
· obecność lewej sekwencji granicznej (LB) poprawia efektywność tego procesu
· wielkość plazmidów Ti: 150-800 kb

78. Typy plazmidów Ti (dzikich)
Istnieją różne typy plazmidów Ti zależnie od tego jaki rodzaj opin potrafią utylizować. Najlepiej poznane są plazmidy Ti nopalinowe i oktopinowe. Obydwa typy posiadają obszar T-DNA ale różniący się strukturą:
· Nopalinowy T-DNA - prosty ciągły segment, około 22 kb
· Oktopinowy T-DNA - złożony z 3 segmentów; lewy segment DNA (TL) = 13kb, centralny segment (TC) = 1.5kb, prawy segment (TR) = 7.8kb; lewy segment zawiera funkcje onkogenne a prawy segment geny syntezy opin
Uogólniony model przeniesienia i integracji T-DNA
· Nić T powstaje i jest przenoszona do komórki roślinnej w postaci kompleksu DNA-białka. Transfer wymaga genów vir zlokalizowanych na plazmidzie Ti i genów chromosomalnych
· Białko, które znajduje się na końcu 5' nici T-DNA wchodzi w interakcję z roślinnym DNA i nacina je
· Jednoniciowe T-DNA jest przyłączane do jednej nici roślinnego DNA a napięcia torsyjne z tym związane powodują rozerwanie drugiej nici roślinnego DNA
· Końce nici T są łączone z końcami roślinnego DNA na drodze ligacji, dosyntetyzowana zostaje nić komplementarna do nici T
· Naprawy (łatanie dziur) i replikacja obszarów integracji nici T prowadzą często do duplikacji i rearanżacji w tym obszarze

79. GENY ODCINKA T-DNA I ICH EFEKTY FENOTYPOWE
Koduje 2 klasy genów warunkujacych transformowany fenotyp :
1. zaangazowanych w synteze opin
2. odpowiedzialnych za biosynteze regulatorow wzrostu roslin

T-DNA
· obszar przenoszony do komórek roślinnych
· zawiera geny kodujące białka zaangażowane w biosyntezę opin i białka zaangażowane w biosyntezę fitohormonów
· pomimo tego, że geny te rezydują na plazmidzie bakteryjnym to są aktywne tylko w komórkach roślinnych
· zawierają typowe eukariotyczne sekwencje regulujące ich transkrypcję: TATA-boxy i CAAT-boxy oraz typowe roślinne sygnały poliadenylacji
· część tych sekwencji wykorzystano do regulacji ekspresji genów markerowych

80. Biotechnologia -podział:

• Biała - biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska. Opiera się ona na biokatalizie i bioprocesach.

• Czerwona - biotechnologia wykorzystywana w ochronie zdrowia, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, czy genoterapii i ksenotransplantologii.

• Zielona - biotechnologia związana z rolnictwem obejmująca stosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej czy zwierzęcej.

• Fioletowa - związana z ustawodawstwem, które dotyczy biotechnologii (prawne i społeczne uwarunkowania).

Podziały tradycyjne:

• biotechnologia zwierząt,

• biotechnologia roślin,

• biotechnologia żywności.

oraz

• biotechnologia tradycyjna (stosuje naturalne enzymy lub organizmy nie zawierające obcego materiału genetycznego),

• biotechnologia nowoczesna (stosuje organizmy, enzymy i białka zmodyfikowane genetycznie).

---