TECHNIKI HISTOLOGICZNE

Zajmują się przygotowaniem materiału biologicznego do oceny mikroskopowej - na podstawie której stawiana jest diagnoza.

Stosowane są różne techniki zależnie od celu badania, rodzaju tkanki i sposobu jej utrwalenia.

Są to: technika parafinowa, celloidynowa, mrożeniowa i techniki mikroskopii elektronowej.

W klasycznej diagnostyce histopatologicznej - powszechnie stosowana jest technika parafinowa i

mrożeniowa.

Aby pobrany wycinek opracowany w postaci preparatu histologicznego prezentował

obraz taki jaki jest w organizmie pacjenta musi spełniać podstawowe warunki:

1. musi być przejrzysty, odpowiednio cienki;

2. powinien być dobrze skontrastowany (zabarwiony), w celu zróżnicowania poszczególnych
   struktur wchodzących w skład narządu,

3. musi być bezbłędnie oznaczony, ponieważ bardzo często jest to jedyny materiał i nie można go pozyskać ponownie.

Rodzaje materiałów:

• materiał sekcyjny,

• materiał pooperacyjny,

• materiał śródoperacyjny „intra",

• biopsja aspiracyjna cienkoigłowa (BAC),

• wyskrobiny narządów,

• popłuczyny narządów,

• oligobiopsja(gruba igła),

• trepanobiopsja (gruba igła),

• rozgnioty (chromosomy),

• wymazy,

- zawiesiny pojedynczych komórek (PMR, płyny puchlinowe),

Z tych materiałów po odpowiednio długiej i często skomplikowanej procedurze uzyskuje się: skrawki, szlify, rozmazy, inprinty (preparat w wyniku odbicia narządu) i hodowle komórkowe. Najczęściej są skrawki i rozmazy.

Materiał musi być pobrany w przypadku guzów litych z pogranicza tkanki zdrowej i zmienionej chorobowo, ponieważ granica jest miejscem podlegającym ocenie. Pobieranie wycinka ze środka guza nie odzwierciedla postępu i rodzaju zmiany, gdyż tam często są rozległe zmiany martwicze i komórki są nieczytelne.

Każdy materiał bezpośrednio po pobraniu musi być niezwłocznie umieszczony w płynie utrwalającym, w odpowiedniej proporcji do wielkości utrwalanego narządu.

TECHNIKA PARAFINOWA - wady i zalety

Zalety:

• niskie koszty,

• powtarzalne wyniki,

• możliwość uzyskania cienkich skrawków,

• możliwość uzyskania skrawków seryjnych,

• krótki czas trwania procedury,

• możliwość barwienia prawie wszystkimi metodami
  

Wady:

- stosowanie wysokiej temperatury (50°- 60° C) zagrażającej spadkiem aktywności enzymów i obkurczaniem się niektórych tkanek,

• konieczność używania rozpuszczalników organicznych powodujących wypłukiwanie ze
  skrawków lipidów,

• dodatkowe przygotowanie skrawków do barwienia, kruszenie i rozwarstwianie skrawków przy materiałach twardych, kruchych lub o niejednorodnej strukturze,

- znaczne trudności przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni,

Technika parafinowa składa się z następujących etapów:

1.pobranie wycinka,

2.utrwalanie,

3.płukanie,

4.odwadnianie,

5.prześwietlanie,

6.przepajanie płynną parafiną

7. zatapianie,

8.krojenie skrawków,

9.naklejanie na szkiełka podstawowe,

10.barwienie i zamknięcie preparatu ( konserwacja)

Ad. 1. Wycinki powinny być jak najmniejsze, co jest gwarantem, że dobrze się utrwalą. Najważniejsza jest grubość wycinka, stąd wycinki dzielimy na : małe, średnie i grube. Grube to takie których grubość przekracza 5 mm.

Ad. 2. Utrwalanie zapobiega zmianom pośmiertnym, które powstają w wyniku:

- szoku śmierci,

- cięcia tkanek

- działania własnych enzymów autolitycznych

i ma na celu zachowanie tkanki w stanie najbardziej zbliżonym do przyżyciowego, dlatego wycinki umieszczane są natychmiast po wycięciu w płynie utrwalającym.

Proces ten polega na denaturacji białka, tworzeniu licznych wiązań krzyżowych przez co zostają zatrzymane wszystkie procesy życiowe oraz nie dochodzi do przemieszczania składników komórki.

Dobór utrwalacza zależy od: rodzaju tkanki, rodzaju badania, prędkości przenikania płynu, sposobu barwienia.

Skuteczność utrwalania zależy od: grubości i wielkości wycinka, stopnia uwodnienia i

unaczynienia narządu, wieku tkanki, prędkości przenikania płynu, ilości wiązań krzyżowych,

stałej dielektrycznej, momentu dipolowego utrwalacza, pH płynu utrwalającego, temperatury utrwalania i sposobu umieszczenia wycinka w utrwalaczu.

Utrwalanie przeprowadza się metodą: immersyjną, perfuzyjną i przy pomocy mikrofal.

Ad. 3. Płukanie wycinków ma na celu pozbycie się utrwalacza, ponieważ przetrzymanie wycinka w nim powoduje powstawanie strątów, utrudnia barwienie, krystalizację utrwalacza imitującego pigment.

Rodzaj płukania zależy od rodzaju zastosowanego utrwalacza. Najczęściej stosuje się wodę bieżącą, alkohol i bufory.

Ad. 4. Odwadnianie jest stosowane w technice parafinowej do wycinków narządowych. W przypadku rozmazów, rozgniotów czy hodowli tkankowej można od razu po utrwaleniu przystąpić do barwienia.

Odwadnianie ma na celu utwardzenie wycinka, aby następnie otrzymać w wyniku krojenia cienkie skrawki o bardzo niewielkiej grubości. Im cieńsze mają być skrawki, tym lepiej musi być odwodniony krojony materiał (2-5 µm).

Odwadnianie przeprowadza się stopniowo, aby uniknąć rozwarstwienia tkanek rozpoczynając od alkoholu 70% do 100%, czasami od 50% (tkanki płodowe) lub acetonem.

Ad. 5. Odwodnionego materiału nie można przepoić i zatopić w środowisku apolarnym(parafina, celloidyna, metakrylan), jeśli wcześniej wycinków się nie prześwietli (przeprowadzi przez płyny pośrednie) tj. umieści w substancjach organicznych, które w równym stopniu mieszają się z alkoholem 100% i parafiną.

Wycinki dobrze prześwietlone nabierają wrażenia przeźroczystych (bursztynowych - landryna sycylijska).

Ad. 6. Przepajanie płynną parafiną odbywa się w temp. 60° C w termostacie, a następnie wycinki zatapiamy doprowadzając parafinę płynną do zestalenia.

Prawidłowo zatopiony materiał jest bloczkiem jednakowej grubości, bez białych wykwitów z centralnie ułożonym wycinkiem.

Uzyskane bloczki po wymodelowaniu poddaje się krojeniu.

Ad. 7. Do krojenia skrawków histologicznych służą mikrotomy. Stosowane są 3 typy mikrotomów: saneczkowy, rotacyjny i wahadłowy.

Przed przystąpieniem do krojenia modelujemy bloczek, którego kształt zależy od kształtu i wielkości wycinka. Tkanki słabo widoczne modelujemy w kształcie trapezu równoramiennego lub podbarwiamy eozyną (śluzówki). Następnie montujemy bloczek w uchwycie mikrotomu, przygotowujemy płaszczyznę skrawania wyrównując powierzchnię nożem żyletkowym gorszej jakości - trymowanie bloczka.

Po wyrównaniu powierzchni skrawania zmieniamy nóż na dobrej jakości przeznaczony do właściwego krojenia.

Trzeba go odpowiednio ustawić względem bloczka.

Ważne są 2 parametry:

1. kąt między długą osią ostrza (żyletki) a krawędzią bloczka (krojenie materiałów b. twardych) rys. 1.

2. kąt nachylenia tylnej płaszczyzny ostrza noża do płaszczyzny skrawania skrawków (kąt
   prześwitu) rys. 2.

Kąt ten powinien wynosić od 3° do 10°.

Przy materiałach miękkich kąt prześwitu powinien być mniejszy niż przy krojeniu tkanek twardych

Ad. 8. Naklejanie skrawków na szkiełka podstawowe można wykonywać przez:

• łapanie na wodzie (42-48°C) zależnie od temperatury topnienia zastosowanej parafiny.

• łapanie na 96% alkoholu (glikogen)

• naklejanie na piecyku elektrycznym

Skrawki naklejamy stroną błyszczącą, tj. tą która przylegała w czasie krojenia do noża. Po rozprostowaniu skrawka pod wpływem podwyższonej temperatury i napięcia powierzchniowego płynu przenosimy skrawek na szkiełko podstawowe.

Po naniesieniu skrawka na szkiełko nadmiar wody odciągamy wilgotną bibułą i pozostawiamy preparaty do wysuszenia w temperaturze 37°- 40°C.

Ad.9. Barwienie histologiczne ma na celu skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych za pomocą barwników.

Cząsteczki każdego barwnika posiadają dwie istotne dla jego funkcji grupy chemiczne: grupę barwną decydującą, o jego kolorze i grupę chwytną odpowiedzialną za wiązanie się cząsteczek barwnika z grupami chemicznymi tkanki.

Barwienie polega na przyłączeniu grup chwytnych określonego barwnika do struktur komórkowych lub tkankowych posiadających odpowiednie grupy wiążące. Barwienie ma niski stopień swoistości (wiele różnych struktur i substancji może wiązać ten sam barwnik), dlatego stosuje się różnicowanie.

Barwienie skrawków parafinowych składa się zawsze z następujących etapów:

• odparafinowanie,

• nawodnienie,

• właściwe barwienie,

- odwodnienie,

• prześwietlenie

• zamknięcie w balsamie kanadyjskim lub innym medium.

Zasady przy barwieniu:

- preparat umieszczamy w płynie tzw. „twarzą” do osoby barwiącej

- przy przenoszeniu preparatu barwionego z kuwety do kuwety odsączamy płyn ligniną, aby nie zanieczyszczać odczynników

- preparat dokładnie odwadniamy i prześwietlamy

- zamykamy w medium np. w balsamie

- oceniamy wynik barwienia.

Wyniki barwienia wybranymi metodami:

1. barwienie hematoksyliną i eozyną (H+E)

jądra - fioletowe z wyraźnie widoczną błona jądrową, chromatyną i jąderkami

cytoplazma - różowa w różnych odcieniach

tkanka łączna - różowa

mięśnie - różowo - czerwone

erytrocyty - czerwono - pomarańczowe

2. barwienie zrębu łącznotkankowego metodą Van Gieson

jądra - szare lub czarne

cytoplazma - oliwkowa

tkanka łączna - różowo - czerwona

mięśnie - żółte

3. barwienie kwaśnych mukopolisacharydów błękitem alcjanu

jądra - czerwone

cytoplazma - bezbarwna lub różowa

kwaśne śluzowielocukry - niebieskie lub turkusowe

4. barwienie kości metodą Schmoorla

osteocyty - czerwono brązowe

osseomukoid - żółty

kanaliki kostne - brązowe

kanały Haversa - brązowe

5. barwienie zrębu łącznotkankowego metodą „AZAN” wg. Heideinheina

tkanka łączna - niebieska

mięśnie - fioletowo-niebieskie

jądra - czerwone

erytrocyty - czerwone

śluz - niebieski

---