BIOTECHNOLOGIA 8 WYKŁAD

Fleming - penicylina

Waksman Selman Abraham - 1888-1973 - amerykański mikrobiolog, prof. Rutgers University w New Brunswick; 1952 nobel za odkrycie streptomycyny

1928 Penicylina jako antybiotyk Fleming

1942 Masowa produkcja penicyliny w grzybach

1944 Waksman izoluje streptomycynę, jako efektywny antybiotyk na gruźlicę.

Izolacja szczepów jest prosta. Czy to bakterie z rodzaju Streptomyces, czy grzyby - rosną łatwo na pożywkach płynnych przy dobrej dostępności tlenu.

Najtańszą pożywką będzie: woda wodociągowa, nie musi być destylowana. Woda z dodatkiem prostej substancji organicznej - bardzo tanią substancją jest mączka sojowa.

Roztwór mączki sojowej w wodzie wodociągowej jest dobrym podłożem wzrostowym dla przyszłych organizmów, które będą produkować antybiotyki na skalę przemysłową [ma być tanio].

Często stosuje się mannitol - proste źródło węgla potrzebne głównie grzybom do wzrostu, aby mogły się dobrze rozwijać. Nie wszystkie drobnoustroje wytwarzają amylazę, aby rozłożyć skrobię i późnej wykorzystywać cukry proste... dlatego mannitol jest całkiem fajnym źródłem węgla.

Pobiera się próbkę gleby.

Gdy ma się kolekcję szczepów, można przeprowadzić screening - charakterystyka szczepów, które będą produkować antybiotyki. Szczepy izolowane z gleby nie mogą być zanieczyszczone, muszą pochodzić z pojedynczej kolonii.

Łatwiej przetrzymuje się bakterie w formie atenuowanej - forma żywa w przetrwalną.

Liofilizacja - przejście w stan zamrożenia [dokładniej: odparowania wody w niskiej temperaturze i pod obniżonym ciśnieniem]. Nie następują żadne zmiany genetyczne w genomach mikrobów. Szczep jest gwałtownie suszony i zamrażany. Liofilizowany produkt jest w postaci proszku.

To samo powoduje wpakowanie mikrobów do gliceryny.

HPLC - się sprawdza substancję...

HPLC preparatywne - jak znajdziemy nowy wzór w pikach, to jest to szczep podejrzany o produkcję nowego antybiotyku. Pewnych informacji dostarcza równoległa analiza w postaci TLC - chromatografia cienkowarstwowa.

Cienkowarstwowa: substancja z supernatantu, nanosi się próbkę na płytkę. Rozpuszczalnik - metanol:chloroform:woda niosą substancje przez nośnik [np. żel krzemionkowy] i zachodzi rozdział.

Pojawienie się nowej plamy - płyty są wybarwiane przy pomocy barwników skierowanych przeciwko najważniejszym związkom spodziewanym w układzie. Zauważenie nowej plamy lub nowego sposobu wędrowania jest sygnałem, że być może szczep, który badamy zawiera nowy antybiotyk.

Działanie przy pomocy TLC i HPLC to screening chemiczny.

Musi być prowadzony też równolegle screening biologiczny - działanie, które pozwoli wykazać nam, że w danym supernatancie badanego szczepu jest aktywność przeciwbakteryjna. Supernatant stanowiący źródło potencjalnego antybiotyku jest stosowany w stosunku do wzorcowych bakterii, które są wrażliwe na antybiotyki.

Jeżeli znajdziemy nową aktywność przeciwbakteryjną, tudzież mamy nową plamę/pik, to z dużą pewnością możemy pomyśleć, że mamy szczep, który będzie nowym producentem antybiotyku.

Warto teraz znaleźć substancję i określić jej strukturę. W grę wchodzi HPLC preparatywne - jeśli pojawia się pik bez tła w postaci innych pików. Wówczas dajemy próbkę do analizy struktury.

Ważne jest zachowanie odpowiednich warunków we wstępnych analizach, aby zachować różne warunki - w różnych warunkach różny jest wzór produkcji substancji - np. natlenienie hodowli jest najważniejszym elementem przyczyniającym się do różnego wzoru HPLC i różnego składu supernatantu. Stosuje się kolby erlenmayera z wrębami. Hodowla odbywa się na mieszadłach o ruchu rotacyjnym. Jeżeli kolbki mają występki szklane w denkach, w zależności od obecności i ich ilości jest różny stopień rozbijania hodowli wraz z ruchem rotacyjnym - jest więc różny stopień natleniania hodowli. Wzory HPLC w tych różnych warunkach natlenienia spowodowanych są bardzo różne!

Kiedy przechodzimy na większą skalę, warto pokusić się o większą ilość substancji. Przejście od skali laboratoryjnej prowadzonej w Erlenmayerkach do skali 10-litrowej już może sprawiać problemy. Zdarza się, że hodowla wzrasta w objętościach do 300 ml. Maksimum hodowli, która tam się znajduje to 100-150 ml hodowli (aby dobrze rosła i się dobrze wytrząsała).

Termostaty, czy biostaty to urządzenia zapewniające ciągły wzrost mikrobów. W takich kolbkach po 24 godzinach hodowla jest stara... właściwie to starzeje się już po 6 godzinach. W przypadku grzybów jest to proces dłuższy, ale po 24h i tak proces autolizy. Hodowle ciągłe zapewniają stałą fazę logarytmiczną wzrostu - dłużej, niż 24h. Można przy dobrym układzie prowadzić hodowlę tydzień, czy dwa tygodnie. Produkcja metabolitów największa.

Przechodzi się później na skalę 10-litrową - do biostatu. Jest to pojemnik o cylindrycznym kształcie, gdzie znajduje się hodowla badanego szczepu produkcyjnego. Jakie warunki musi spełniać biostat? Musi mieć mieszadło, zwykle wirnikowe (podobne jak w mikserze). Pożywką jest to samo - woda, mączka sojowa i mannitol.

Wzrost mikrobów wiąże się z wytwarzaniem licznych białek do podłoża. Powstaje problem spienienia danej hodowli. Spienienie hodowli jest problemem, który jest trudny do usunięcia. Są takie bakterie, jak Bacillus, które wiele białek wydzielają do podłoża wzrostowego i hodowla zaczyna się pienić dość szybko.

W praktyce stosuje się to smalec.

Do fermentorów doprowadzane jest świeże powietrze w sposób jałowy, doprowadza się kwasy i zasady, w zależności od tego, czy potrzebne jest pH niskie, czy wysokie.

Piana jest tak wszędobylska, że wszystkimi przewodami wychodzi na zewnątrz - może dostać się do wirników, łożysk - zjawisko bardzo negatywne i niepożądane. [antypienne środki, np. silikonowe]

Hodowla trwa 2 tygodnie, tudzież 10 dni, w trakcie pobieramy regularnie próbki podczas fermentacji (a więc musi być kolejne sterylne wyjście). Sprawdzamy, czy produkcja trwa, czy już nie. Jeśli się skończyła, myślimy wówczas o zakończeniu hodowli.

Zakładamy, że przejście z erlenmayerki do fermentora jest udane - udało nam się wyprodukować substancję w skali laboratoryjnej.

Następne przejście jest na skalę półprzemysłową... to skalowanie zwykle się nie udaje.

W dużych objętościach panują wielkie ciśnienia. Ciśnienia wpływają na system regulacyjny i produkcja metabolitów wtórnych ustaje. Bakterie, które produkują metabolity wtórne są bardzo zmienne. Nie są to znane systemy regulacyjne, które warunkują wytwarzanie substancji antybiotycznych. Bywa, że udaje się przejść na większą skalę - ponoć łatwo jest z tetracyklinami.

Jeśli udało się przenieść skalę na 10³-10⁴ litrów (fermentory piętrowy).

Fermentory przemysłowe - problemy: kłopoty z jałowieniem. Zazwyczaj jałowienie takiego układu polega na stosowaniu pary o wysokiej temperaturze, tyle, że autoklawowanie odbywa się ręcznie - lata sobie facet na lince od góry do dołu i „jałowi”. Gdy mamy wielką masę i wielkie inokulum, to obcym mikrobom trudno jest przełamać hodowlę mikrobiologiczną.

Największą zmorą hodowli przemysłowych są bakteriofagi. Jak dostaną się one do hodowli produkcyjnej, to porażka... Serio - przechlapane.

Walka z nimi jest trudna.

Często modyfikuje się przed produkcją szczepy w celu nabywania oporności przeciwko najbardziej znanym fagom.

Produkcja przemysłowa pozostawia po sobie duże masy odpadów, z którymi nie ma co zrobić. Podejmowane są liczne próby polegające na tym, aby zagospodarować te produkty.

Wykorzystanie mikrobów do wyłapywania jonów dwuwartościowych na śmietniskach. Sprawdzono, że ściany komórkowe grzybów i bakterii są świetnymi adsorbentami toksycznych metali. Wszędzie tam, gdzie jest możliwość skażenia środowiska jonami, należy wykorzystywać odpady poprodukcyjne po antybiotykach, po alkoholu do usuwania tych jonów. Jony te wyłapywane są jak w gąbkę.

Ale co zrobić z mikrobami, które są już skażone metalami ciężkimi? Są pomysły, aby wpakować bakteriofagi i zlizować je. Uwalnia się wolny lizat drobnoustrojów, a z nich za pomocą elektrolizy można odzyskać metale. W przyrodzie nic nie ginie.

Izolacja substancji

Najprościej odzyskać substancję z przesączu hodowlanego w postaci adsorpcji na sorbentach. Największe znaczenie mają żywice jonowymienne, z czego najważniejsze są żywice typu Amber lent?

Najważniejsza żywica to XAD16. Są to cząsteczki w kształcie kulek, które są kationitami. Powoduje to adsorpcję żywicy na kulkach. Przepuszczamy całą masę produkcyjną. Masa ta to supernatant pohodowlany... będzie mnóstwo substancji, które wybierze się z supernatantu.

Żywicę tą przepłukujemy wielokrotnie buforami, a na końcu odpłukujemy z niej substancje w niej zawarte gradientem etanolu. Etanol zwiększa intensywność odpłukiwania cząsteczek znajdujący się na kolumnie z żywicą jonowymienną. Jeżeli jednocześnie prowadzimy analizę wycieku, to w pewnej frakcji zauważymy interesujące nas substancje. Są to metody wystandaryzowane - wiadomo, jakie stężenia etanolu są potrzebne do izolacji substancji X [tej od Atomówek].

Konfekcjonowanie - opakowanie w butelki, ampułki. Jest to problem, bo przechowywanie substancji jest trudne. Sporo substancji się utlenia i traci trwałość.

Opłacalność produkcji spada, bo część gotowego produktu się rozkłada.

Penicylina - same penicyliny można podzielić ze względu na pochodzenie - V i G - naturalne. Ampicylina i metycylina - półsyntetyczne.

Gronkowce oporne na metycylinę - zakażenia szpitalne - do wykoszenia tylko za pomocą bakteriofagów.

Antybiotyki:

• podział według budowy chemicznej

1. Beta laktamowe: penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy

2. Makrolidy: erytromycyn i jej pochodne (roksytromycyna, klarytromycyna, spiramycyna, azytromycyna)

3. Linkozamidy: linkomycyna, klindamycyna

4. Aminoglikozydy:

I generacja - streptomycyna, kanamycyna, neomycyna

II generacja - gentamycyna, tobramycyna, amikacyna, netylmycyna

5. Tetracykliny: tetracyklina naturalna, doksycyklina - tetracyklina zmodyfikowana

6. Inne: chloramfenikol, wankomycyna, teikoplanina - antybiotyki polipeptydowe

ryfampicyna

spiramycyna, azytromycyna - "antybiotyki ostatniej szansy"

Aminoglikozydy I generacji stosuje się w inżynierii genetycznej.

II generacja - gentamycyna - stosuje się go w przypadku hodowli tkankowych w przypadku patogenów wewnątrzkomórkowych. Jest to duży antybiotyk, nie wnika do wnętrza komórek eukariotycznych i jest stosowany do izolacji patogenów wewnątrzkomórkowych.

Tetracykliny: doksycyklina używana przez lekarzy, przy trudnych przypadkach zapalenia płuc.

Chloramfenikol - marker genetyczny używany przy szczepach opornych na chloramfenikol. Ryfampicyna - pierwotnie była używana do zwalczania gruźlicy.

Podział antybiotyków na podstawie mechanizmu działania:

• beta laktamowe, do których należą między innymi penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy i monobaktamy

• ampicyliny - wytwarzane przez pleśnie Penicyllium, odkryte w latach 20 ubiegłego wieku

• miejscem działania jest ściana komórkowe, antybiotyku tej grupy uniemożliwiają prawidłową syntezę ścian komórkowych - tworzenie wiązań krzyżowych pomiędzy liniowymi polimerami peptydoglikanu

• wiele bakterii wytwarza enzymy niszczące penicyliny (penicylinazy) i są niewrażliwe na działanie tych antybiotyków, geny kodujące te enzymy zlokalizowane są często na plazmidach

• obecnie stosuje się szereg modyfikowanych chemicznie penicylin o lepszych właściwościach

Skutki modyfikacji cząsteczki penicylin to:

• oporność na działanie penicylinaz (metycylina, oksacylina, kloksacylina, nafcylina)

• szersze spektrum działania, naturalne głównie na G+, modyfikowane, takie jak ampicylina, czy karbenicylina aktywne także w stosunku do G-

• celem działania penicylin są tylko enzymy występujące u bakterii w związku z czym ich toksyczność jest niewielka, jednak mogą powodować uczulenia

Poza antybiotykami betalaktamowymi inhibitoram syntezy ścianykomórkowej są:

• wankomycyna - uniemożliwienie tworzenia wiązań pomiędzy liniowymi polimerami peptydoglikanu (mechanizm inny, niż beta laktamów)

• cykloseryna - uniemożliwia powstawanie prekursorów peptydoglikanu

• bacytracyna - oddziałuje z prekursorami ściany komórkowej i hamuje jej syntezę

Antybiotyki hamujące działanie polimerazy RNA - ryfampicyna, stosowana do leczenia zakażeń wywołanych przez Mycobacterium tuberculosis lub leprae

Substancje hamujące syntezę nukleotydów - sulfonamidy, właściwie hamują syntezę kwasu foliowego (nie powstaje w organizmie człowieka), przez co zaburzają syntezę nukleotydów, wadą jest duża toksyczność oraz wywoływanie reakcji uczuleniowych.

Antybiotyki hamujące powstawanie DNA - chinolony - inhibitory gyrazy - bierze udział w replikacji DNA (rozplatanie helisy).

Beta laktamy wiążą się z białkami wiążącymi penicylinę (PBP). Nie powstaje ściana komórkowa.

OmpL - gdy ten regulator ulegnie uszkodzeniu, przestają powstawać poryny, przez które antybiotyki wnikają do środka.

Oszukiwanie bakterii przez stwarzanie nowych pochodnych, które są przez nie nierozpoznawalne jest to działanie pozwalające na wyodrębnienie nowej klasy penicylin.

metycylina - gronkowce szybko nauczyły się ją rozkładać

wankomycyna - działa na ściany komórkowe. Inkorporuje w struktury ściany. Nie łączy się z białkami PBP, a inkorporuje w strukturę.

Komórka pod mikroskopem potraktowana bacytracyną lub cykloseryną wygląda, jakby była poszatkowana na kawałeczki. Następuje tzw. sferoplastyzacja komórki bakteryjnej. Ściana komórkowa ulega trawieniu, ale nie do końca - część pozostaje. W odróżnieniu od protoplastyzacji, która całkowicie pozbawia bakterie ściany komórkowej.

Ryfampicyna - pierwszy ważny lek stosowany w walce z gruźlicą.

Podział antybiotyków na podstawie mechanizmu działania:

• leki hamujące syntezę białek

inhibitory jednostki rybosomalnej 30s

do nich należą aminoglikozydy (streptomycyna), wiążą się z podjednostką 30s i wchodzą do kompleksu 30s-A-50S, kompleksy takie są nieaktywne w procesie syntezy białka, najbardziej znane to streptomycyna, stosunkowo toksyczna. Stosuje się ją tylko, gdy jest to konieczne.

Neomycyna - biegunka u małych dzieci.

Kanamycyna - leczenie zakażeń wywołanych przez Mycobacterium tuberculosis

tetracykliny łączą się z podjednostką 30S uniemożliwiając wiązanie z tRNA, bakteriostatyki o szerokim spektrum działania, stosowane przede wszystkim do niszczenia bakterii wewnątrzkomórkowych, mogą wywołać zaburzenia żołądkowo-jelitowe, przebarwienia rosnących zębów

• leki hamujące syntezę białek

inhibitory jednostki rybosomalnej 50s

chloramfenikol - substancja toksyczna, wiąże się z podjednostką 50S i zakłóca tworzenie wiązań peptydowych między aminokwasami, co powoduje przedwczesne zakończenie syntezy białek, raczej nie stosuje się go u dzieci (toksyczny), może powodować zmiany w obrazie krwi

makrolidy - podobnie jak chloramfenikol powodują przedwczesne zakończenie syntezy białek, najbardziej znany lek z tej grupy to erytromycyna - mogą zakłócać pracę wątroby.

Antybiotyki mają spore znaczenie alergiczne dla człowieka.

Antybiotyki

podział produowanych antybiotyów według praktycznego zakresu ich działania

(według Kuryłowicza i Kowszych-Gifinder)

Antybiotyki mogą być takie, które mają szeroki zakres działania i mają stosowane w lecznictwie - do nich należą penicyliny, makrolidy, neomycyny. Działają na bakterie gram- oraz gram + i kieruje się je przeciwko wszelakim grupom mikrobów.

Wankomycyna - działa tylko specyficznie przeciwko gram+. Na gram- nie działa, bo wankomycyna działa na ściany komórkowe i gram+.

Klasyczny, który działa tylko na gram- to polimiksynaB

Na grzyby działają:polieny makrolidowe, amfoterynaB, kandycydynaB, filipina, kamycyna, leworyna

Na nowotwory działają: aktynomycyny, rybomycyna (daunomycyna, rubidomycyna), mitomycyna, bruneomycyna (streptonigryna, rufomycyna), oliwomycyny (chromomycyny, mitramycyna).

Rubidomycyna produkowana w Polsce.

Silicażel - żel silikonowy, gdzie substancja ponosi się do góry na zasadzie adsorpcji i substancje ulegają podnoszeniu wraz z ruchem fazy wodnej i organicznej ku górze.

Błekit tetrazolowy - odczynnik do wybarwiania cukrów.

Odczynnik Ehrlicha - do oznaczania indolu [?]

semialdehyd jakiśtam - do cukrów.C

Biotechnologia, wykład VIII, strona 5

---