Sprawozdanie z ćwiczeń z przedmiotu agrobiotechnologie.

Temat:

Pobieranie i sterylizacja materiału roślinnego. Zakładanie kultur in vitro: przygotowywanie eksplantatów, wszczepianie na pożywki oraz zabezpieczenie.

Wykonawcy :

Irena Waśkiewicz

Karolina Walinowicz

Rolnictwo, grupa 2,

zespół B1

1. Cel zadania:

Sprawdzenie wpływu stężenia sterylizatora chemicznego na sterylność i zdolność kiełkowania nasion rzodkiewki oraz na sterylność i rozwój tkanki korzenia marchwi.

2. Wprowadzenie merytoryczne.

W związku z tym, że kultury in vitro powinny być prowadzone w warunkach sterylnych, również materiał roślinny, szkło, narzędzia i pożywki muszą być sterylne - wyjałowione. Czynności związane z izolacją i przenoszeniem eksplantatów należy prowadzić w warunkach uniemożliwiających zakażenie, dlatego też najlepiej wykonywać je na stole z ciągłym nawiewem filtrowanego, sterylnego powietrza.

Rośliny mateczne, z których pobiera się materiał do kultury, powinny posiadać pełną zdrowotność. Bardzo ważnym elementem do jej zapewnienia jest stosowanie właściwych zabiegów agrotechnicznych oraz niezbędnej chemicznej ochrony [Malepszy 2005].

Kultury in vitro to hodowla komórek, tkanek lub fragmentów organów roślinnych, prowadzona w naczyniach szklanych, na specjalnie dobranych pożywkach, w ściśle kontrolowanych, sterylnych warunkach. Wykorzystuje się tutaj zjawisko totipotencji, czyli zdolności odtworzenia całej rośliny z jej części, a nawet z pojedynczej komórki [http://www.lasypolskie.pl/sekcja-400.html].

Czynniki od których zależy wynik kultury in vitro:

1. wewnętrzne (związane bezpośrednio z eksplantatem)

- genotyp rośliny dawcy eksplantatu (rodzaj, gatunek, odmiana)

- rodzaj organu, tkanki oraz jego wielkość

- stopień zróżnicowania eksplantatu

- stan fizjologiczny rośliny dawcy eksplantatu

- wiek rośliny, dawcy eksplantatu

2. zewnętrzne (związane bezpośrednio z samą kulturą)

- światło - spektrum, natężenie, cykl dobowy

- temperatura

- pożywka - dostarczyciel składników odżywczych

Funkcje pożywki:

Dostarcza składników pokarmowych potrzebnych do wzrostu i rozwoju eksplantatu. Odbiera metabolity wtórne i substancje szkodliwe oraz je nautralizuje. Spełnia rolę fizycznego utrzymania.

Składniki pożywki:

- makroelementy- podawane w postaci soli rozpuszczonych w wodzie

- mikroelementy- podawane w postaci soli rozpuszczanych w wodzie

- związki organiczne

A) witaminy, a) kwas nikotynowy, b) pirydoksyna, c) tianina d) M-inosytol

B) aminokwasy a) glicyna,

C) źródło węgla organicznego a) monocukry- glukoza, fruktoza b) dwucukry- sacharoza

-inne:

A) hydrolizat kazeiny

B) mleko potasowe

C) regulatory wzrostu

- substancje zestalające

A) agar

B) agaroza

C) gerlit

Mikrorozmanażanie roślin

Technika mikrorozmanażania pozawaljąca rozmnożyć w warunkach in vitro materiał roślinny z niewielkich fragmentów roślin , tkanek lub pojedynczych komórek i otrzymać tym sposobem dużą ilość sadzonek w stosunkowo krótkim czasie. Jako eksplantaty pierwotne wykorzystywane są tu przede wszystkim tkanki merystematyczne, składające się z młodych, szybko dzielących się komórek. Tkanki te pozbawione są patogenów grzybowych i wirusów, stąd dają początek zdrowym roślinom [Przyborowski 2008].

3. Opis przebiegu doświadczenia, zestawienie i opis przeprowadzonych obserwacji, wnioski końcowe.

Przygotowanie, sterylizacja i rozlewanie pożywek.

I. Przygotowanie pożywki MS i MSO (wg. Mureshige i Skoog, 1962)

Do dwóch kolb stożkowych o pojemności 500 ml wlano 250 ml wody redestylowanej (woda odmierzona za pomocą cylindra). Następnie pisakiem zaznaczono na każdej z kolb poziom wody i odlano połowę ponownie do cylindra. Dodano odpowiednią ilość wszystkich roztworów makroelementów, schelatowanego żelaza i mikroelementów, a do pożywki MS odpowiednie ilości roztworów związków organicznych. Odważono 20 g/l sacharozy i dodano do każdej z pożywek, mieszano aż do rozpuszczenia kryształków , następnie odważono 6 g/l agaru i również dodano do każdej z pożywek. Zmierzono poziom pH i doprowadzono go do poziomu między 5,7-5,9 za pomocą 1N HCI lub 1N NaOH, uzupełniono wodą redestylowaną do kreski i zabezpieczono wylot kolby folią aluminiową . Pożywkę wstawiono do autoklawu i sterylizowano w temp. 121⁰C przez 17 minut.

II. Rozlewanie pożywki do naczyń:

Opisano naczynia, w których znajdowała się pożywka. Po otwarciu autoklawu wyjęto kolby i przeniesiono do komory laminarnej. Ostrożnie mieszano obserwując co się dzieje wewnątrz kolby, a następnie zdjęto folię aluminiową. Opalono nad palnikiem wylot kolby i wlano odpowiednią ilość pożywki do naczynia.

Pobieranie i sterylizacja materiału roślinnego. Zakładanie kultur in vitro: przygotowywanie eksplantatów, wszczepianie na pożywki oraz zabezpieczanie.

I. Sprawdzenie wpływu stężenia sterylizatora chemicznego oraz czasu traktowania na różne rodzaje eksplantatów.

Obliczenia objętości podchlorynu sodu o stężeniu wyjściowym 30% i ilość wody jaką należy pobrać by przygotować 180 ml sterylizatora:

Stężenie sterylizatora %	Podchloryn Na 30% [ml]	Woda [ml]	Objętość końcowa [ml]
5	30	150	180
10	60	120	180
15	90	90	180
25	150	30	180

II. Wpływ stężenia sterylizatora na sterylność i zdolność kiełkowania nasion rzodkiewki (Raphanus dativus).

Przygotowano w pięciu różnych kolbach roztwory podchlorynu sodu o stężeniach: 5%, 10%, 15%, 25%. Wlano sterylizator do odpowiednio oznakowanych zlewek o pojemności 50 ml z nasionami rzodkiewki tak, aby poziom cieczy wynosił 25 ml i mieszając od czasu do czasu odczekano 10 minut. W warunkach sterylnych usunięto sterylizator. Zalano na kilka sekund 70% denaturatem, a następnie zlano ten roztwór. Do nowych sterylnych zlewek przełożono sterylizowane nasiona i zalano sterylną wodą (5 minut). Czynność powtórzono zmieniając wodę oraz czas płukania na 10 minut i 15 minut. Wysterylizowane nasiona wyłożono na pożywkę MSO. Płytki opisano i szczelnie owinięto parafilmem i przeniesiono do pokoju hodowlanego na światło (temp. 23⁰C).

Analiza wyników - pożywka MS i MS0 (nasion rzodkiewki)

Stężenie sterylizatora [%]		Sterylność hodowli [%]			Liczba wyłożonych nasion			Liczba skiełkowanych nasion		% skiełkowanych nasion		Morfologia siewek
MS0	MS	MS0		MS	MS0	MS		MS0	MS	MS0	MS	MS0	MS
5	5	60	50		15		10	2	5	13,3	50	Dwie siewki wytworzyły liście właściwe	Procesy życiowe podjęło 5 nasion - wytwarzając prawidłowe liścienie
10	10	73	50		15		10	2	5	13,3	50	Skiełkowały 2 nasiona, wytwarzając prawidłowe liścienie	5 nasion skiełkowało prawidłowo wchodząc w fazę liścienia właściwego
15	15	66		60	15	10		8	7	53,3	70	8 roślin wytworzyło liścienie	Skiełkowało 7 nasion wytwarzając liścienie właściwe
25	25	85		60	15	10		15	1	100	10	15 nasion skiełkowało - wytworzyło liścienie	Rozwinęła się 1 roślina (wytwarzając liścienie właściwe)

Opis wyników przeprowadzonej obserwacji
Największą liczbę prawidłowo rozwiniętych siewek rzodkiewki stwierdzono na pożywce MS0 (w szczególności na stężeniu sterylizatora 25%, na którym stwierdzono 15 prawidłowo skiełkowanych siewek). Liczba skiełkowanych siewek na pożywce MS była mniejsza i mieściła się w przedziale miedzy 1 a 7. Sterylność hodowli była bardzo wysoka - na pożywce MS0 gdzie wynosiła 73% i 85% dla sterylizatorów 10 i 25%. Na pożywce MS również była wysoka, nie niższa niż 50%.

Większość skiełkowanych nasion wytworzyło liścienie właściwe.

Wnioski:

Na pożywce MS stężenie sterylizatora nie wykazało dużego wpływu na sterylność hodowli (przy wszystkich stężeniach sterylność 50 - 60%). Na tej samej pożywce stężenie sterylizatora ma natomiast wpływ na procent skiełkowanych nasion. Najlepiej kiełkują przy 15% stężeniu (70% skiełkowanych). Źle wpływa na kiełkowanie nasion wysokie stężenie sterylizatora (przy 25% - tylko 10% skiełkowanych).

Na pożywce MS0 wysokie stężenie sterylizatora miało dobry wpływ na sterylność hodowli (przy 25% stężeniu - 85% sterylność). Przy niższych stężeniach, sterylność kształtowała się na podobnym poziomie. Wysokie stężenie sterylizatora na pożywce MS0 miało dobry wpływ na kiełkowanie nasion (przy 25% - 100% skiełkowanych). Niskie stężenie sterylizatora (5 - 10%) miało zły wpływ na kiełkowanie nasion (tylko 13,3%).

Rodzaj pożywki nie miał znacznego wpływu na sterylność hodowli, natomiast na procent skiełkowanych nasion, pożywka MS wpłynęła lepiej (kilkukrotnie wyższy procent skiełkowanych nasion - z wyjątkiem stężenia 25%, gdzie procent skiełkowanych nasion na pożywce MS0 był 10-krotnie wyższy niż na pożywce MS.

Nieprzestrzeganie zasad prawidłowej sterylizacji w niektórych przypadkach mogło spowodować, że sterylność była trochę niższa.

II. Wpływ stężenia sterylizatora na sterylność i rozwój tkanki korzenia marchwi (Daucus carota).

Korzenie marchwi dokładnie umyto w wodzie z detergentem i pocięto je na mniejsze fragmenty, a następnie przeniesiono do opisanych zlewek i zalano roztworami sterylizatora o odpowiednich stężeniach tak, aby w każdej był taki sam poziom cieczy. Czekano 10 minut, mieszając od czasu do czasu. W warunkach sterylnych usunięto sterylizator. Materiał zalano na kilka sekund 70% denaturatem a następnie zlano ten roztwór. Sterylizowany materiał przełożono do sterylnych dużych zlewek i zalano sterylną wodą (5 minut - mieszając od czasu do czasu). Czynność powtórzono zmieniając wodę oraz czas płukania na 10 minut i 15 minut. Z wysterylizowanych kawałków korzenia marchwi za pomocą sterylnych narzędzi usunięto tkanki wierzchnie, tak aby pozostał sam rdzeń. Następnie pokrojono rdzeń na fragmenty o wielkości 0,5xo0,5x0,5 cm i wyłożono na pożywki MS i MS0 przygotowane wcześniej. Płytki opisano i szczelnie owinięto parafilmem, następnie przeniesiono je do pokoju hodowlanego na światło (temp. ok. 23⁰C).

Analiza wyników - pożywka MS i MS0 (marchew)

Stężenie sterylizatora [%]		Sterylność hodowli [%]		Liczba włożonych eksplantatów		Liczba rozwijających się eksplantatów		% rozwijających się eksplantatów		Inne uwagi
MS	MS0	MS	MS0	MS	MS0	MS	MS0	MS	MS0	MS	MS0
5	5	20	80	5	5	0	0	0	0	-	-
10	10	100	100	5	5	0	1	0	20	-	-
15	15	80	60	5	5	4	4	80	80	-	-
25	25	60	20	5	5	1	3	20	60	-	-

Opis wyników przeprowadzonej obserwacji:

Podczas hodowli korzenia marchwi rozwinęły się eksplantaty - po 4 na pożywce MS i MS0 przy tym samym stężeniu sterylizatora - 15%. Przy stężeniu sterylizatora 5 i 10% (pożywka MS) nie rozwinęły się eksplantaty. Sterylność hodowli na obu pożywkach wyniosła po 100% przy stężeniu sterylizatora 10%. Najniższa sterylność była przy stężeniu sterylizatora 25% - wyniosła 20%.

Wnioski:

Optymalna dla utrzymania sterylności hodowli (na pożywce MS) jest 10% stężenie sterylizatora (100% sterylność). Najsłabiej sterylność zapewnia sterylizator o stężeniu 5% (sterylność 20%).

Stężenie sterylizatora na pożywce MS ma również wpływ na procent rozwijających się eksplantatów. Z przeprowadzonego doświadczenia wynika również że najlepszy wpływ na rozwijanie się eksplantatów ma stężenie sterylizatora 15% (80% rozwiniętych). Stężenie 5 i 10% źle wpływa na rozwój eksplantatów (0% rozwiniętych).

Na pożywce MS0 optymalne dla utrzymania sterylności hodowli jest również stężenie sterylizatora 10%. Podobnie jak na pożywce MS, na MS0 również 15% stężenie sterylizatora najlepiej wpływa na rozwijanie się eksplantatów. Natomiast 5% stężenie sterylizatora na eksplantaty wpływa najgorzej (0% rozwiniętych).

Sterylność i procent rozwijających się eksplantatów w niewielkim stopniu uzależnione jest od rodzaju pożywki (zbliżone wyniki na MS i MS0).

Nieprzestrzeganie zasad prawidłowej sterylizacji w niektórych przypadkach mogło spowodować, że sterylność była trochę niższa.

Literatura:

• Malepszy 2005, Biotechnologia roślin pr. Zbiorowa pod red. S. Malepszego, Wydawnictwo Nauk PWN Warszawa 2005.

• Przyborowski 2008 Materiały z wykładu z dnia 14. 10. 08r.

• http://www.lasypolskie.pl/sekcja-400.html

1

---