HISTOLOGIA

Technika parafinowa:

Cel badań histologicznych:

- poznanie budowy mikroskopowej
- ogół procesów mających na celu obróbkę materiału biologicznego, wynikiem jest utwardzenie materiału i przygotowanie go do ścięcia na skrawki histologiczne

• Pobranie : Histopatologia

• Utwardzenie
  Technika parafinowa

Technika kriokatowa, mrożeniowa

• Barwienie

Pobranie materiału do badań

- biopsja (najlepsza) ; ograniczenia: niemożność dotarcia

- nekropsja; bez ograniczeń, wszechstronność, procesy postmortalne wpływają na wygląd materiału; pobranie do 1h (najlepiej)

Pobranie: Histopatologia

Pobranie z miejsca reprezentacyjnego

- sprawdzić czy narząd jest jednorodny czy niejednorodny( wątroba i nerka); wątroba- bez warstw; nerka – pobranie przez cały przekrój anatomiczny

Etapy techniki parafinowej (wieloetapowa technika)

1. Utrwalenie próby

Cel:

- jak najszybsze utrzymanie procesów metabolicznych w komórce

- szybkie ścięcie białek i nadanie im cech nierozpuszczalności

- zapobieganie psuciu się

- zróżnicowanie współczynnika załamania światła (lepiej widoczne struktury)
- utrudnienie procesów osmozy (płyny fizlologiczne)

Substancje utrwalające:

1. Kwasy mineralne

- kwas chromowy (bezwodny)

- kwas pikrynowy (najczęściej stosowany)

- osmowy, azotowy, octowo lodowaty, trój chlorooctowy

2. Substancje organiczne:

- formalina

- alkohole: etylowy, metylowy

- aceton

3. Sole metali ciężkich

- sublimat: chlorek rtęci : HgCl₂
- azotan srebra
- dwuchromian potasu

4. Roztwory:

- płyn Bouin’a (15 ml kwas pikrynowy, 5 ml formaliny, 1 ml kwas octowy)

Wyliczenie czasu utrwalania

- prędkość dyfuzji wgłąb tkanki

- obejrzenie przekroju (powinien być szary, bez odbarwień)

1. Płukanie

- wodą (formalina – tylko wodą)

Przez określony czas

- w alkoholu (alkohol – alkoholem)

Alkohol do płukania musi mieć wyższe stężenie od alkoholu użytego do utrwalania, o 10%

Nie ma ściśle określonego czasu(kilka minut)

1. Odwodnienie

- należy się pozbyć wody, aby nie aktywować procesów metabolicznych

- udostępnienie tkanek dla parafiny , stosujemy szereg alkoholowy o stężeniu rosnącym

50% wyjściowy, skok stężeń co 10%

Kończymy na alkoholu absolutnym bliski 99,98% / 96%

- odwadnianie w acetonie: dla barwienia przyżyciowego

1. Prześwietlanie

- zwiększenie przepuszczalności, chłonności próby

- stosujemy kąpiel w ksylenie lub benzenie

1. Przepajanie próby parafiną w 2 fazach:

- działamy roztworem parafiny łatwo topliwej z ksylenem lub benzenem

- całość umieszczamy w cieplarce, poddanej inkubacji

- wyjmujemy

- zastępujemy czystą parafiną łatwo topliwą, do cieplarki w celu inkubacji

- zatopienie próby w parafinie trudnotopliwej

- czekamy do wystygnięcia

Zalety techniki parafinowej:
- powtarzalna, wyniki są bardziej powtarzalne
- dla wszystkich narządów, wszechstronna

Wady:
- czas: 3 dni
- ksylen i benzen – kancerogenne substancje

Mrożeniowa:
- nie nadaje się do tkanek kostnych, nerwowych
- trwa 1,5 h
- jest droższa
- ksylen, benzen – kancerogenne substancje

Próbkę oswajamy na 3 minuty, później wkładamy na 3 minuty do ciekłego azotu. Następnie przy pomocy specjalistycznego sprzętu tniemy skrawki o bardzo małej grubości nakładając je na szkiełko.

• Barwienie

1. Cel

Wyeksponować

2. Metody barwień

- przyżyciowe- kontrast- barwienie za życia organizmu
Niskie stężenie barwnika, roztwór nie może >1 %
Barwniki umożliwiają przeprowadzenie analiz pośmiertnie lub przyżyciowo z zastosowaniem specjalistycznego sprzętu. (barwniki fluorescencyjne)
Wlew dożylny, iniekcja dożylna, dootrzewnowa, podskórna (słabe efekty, długo się czeka, mało widoczny efekt, krótko się utrzymuje)
- barwienie postmoralne na skrawkach histologicznych (najłatwiejsze)

3. Barwniki

- każdy odczynnik chemiczny, bez wysokiej toksyczności, nie uszkadza tkanek
- musi posiadać cząsteczki barwne – chromofory
- chromofory łączą się z odpowiednimi strukturami dając efekt barwny, żeby mógł się z nią związać musi zawierać resztę azotową (w strukturze barwiącej musi być azot)

4. Podział barwników

• Zasadowe

Sole zasad, barwią jądro komórkowe, zasadochłonne substancje cytoplazmy

Np. fuksyna zasadowa, hematoksylina, czerwień jądrowa, zieleń metylowa

• Kwaśne

Niektóre kwasy i sole tych kwasów

Barwią cytoplazmę komórki i jej składniki

Np. eozyna, fuksyna kwaśna, błękit metylenowy

• Obojętne

Są to sole kwasów i zasad

Mieszanina musi składać się z jednakowych ilości barwników: zasadowych i kwaśnych
- najrzadziej wykorzystywane
- efekty trudne do zanalizowania
np. fiolet metylowy, azur metylenowy

Rozpuszczalne w tłuszczach: czerwień oleista, Sudan

5. Rodzaje/ typy barwień

• Cytologiczne

Wizualizacja organelli komórkowych np. aparat Golgiego

• Cyto i histochemiczne

Do wybarwiania substancji w komórce np. glikogen, witaminy

• Topograficzne

Ma na celu opisanie struktury tkanki (poznawcze)

• Struktur zrębowych

Tylko tkanka łączna, wybarwia ją

• Specjalne

Dotyczy szczegółowej metodyki badania danego typu tkanki, czy narządu np. tkanki kostnej

• Fluorescencyjne(przyżyciowe)

• Dobre efekty wizualne, struktury świecą w ultrafiolecie; minusy: komórki maja zdolność swoistą świecenia bez barwienia i można się pomylić np. tkanka łączna , barwniki szybko się rozkładają pod wpływem światła dziennego
  - zasadowe: oranż akrydyny,
  - kwaśne: eozyna
  - obojętne : rodamina B

• Immunohistochemiczne

Najmłodsze z barwień stosowane w histologii. Najdokładniejsze i miarodajne. Najtrudniejsze do przeprowadzenia .

1. Istota barwienia

- zastosowanie przeciwciał jako barwnika
miozyna przeciwciało
białko szukamy

Przeciwciało nie łączy się z cała cząstką antygenu, tylko z jej fragmentem – determinantą antygenową

• Podział przeciwciał

  • Monoklonalne

- wykrywają jedną determinantę, antygen
- bardzo wysoka swoistość
- najbardziej dokładny wynik, jeśli wszystko poszło dobrze
- reakcja fałszywie negatywna, jeśli źle przeprowadzimy barwienie

• Poliklonalne
  - wykrywają grupę antygenów
  - są mniej swoiste, ale często wykorzystywane
  - reakcja fałszywie pozytywna, antygen(znaleziony) bardzo podobny do tego którego chcieliśmy znaleźć

• Znakowanie przeciwciał
  Przeciwciało musi być znakowane, podbarwiane:
  - białka zewnętrzne – metal ciężki np. ferrytyna (Fe)
  - czysty metal ciężki np. złoto koloidalne
  - enzymy
  - fluorochrony

• Sposób wykonania barwienia immunohistochemicznego
  - bezpośredni
  - pośredni

Bezpośredni:
- wykonanie oznakowania przeciwciała

Pośredni: II etapy:

• Wprowadzamy do preparatu przeciwciało nieoznakowane (nie widać połączenia)

• Wprowadzamy dodatkowe przeciwciało oznakowane i ono wykryje ten wcześniejszy kompleks; połączy się lub wybarwić barwnikami fluorescencyjnymi

• Sposoby barwień

- pojedyncze – 1 barwnik

- złożone – więcej niż 1 barwnik

-progresywne – stosujemy barwnik o niskim stężeniu, preparat przetrzymujemy przez ściśle określony czas, po którym jest efekt zasadniczy barwienia

- regresywne – wysokie stężenie barwnika, do momentu przebarwienia całego preparatu, po tym odbarwiamy (różnicowanie), umieszczamy w związku chemicznym, który ma odbarwić (można zepsuć preparat)

- bezpośrednie – umieszczamy preparat i czekamy na odbarwienie

- pośrednie – należy wcześniej przygotować skrawki aby reakcja barwna nastąpiła
(bejcowanie tkanek – przygotowanie)

- absorpcja- wchłanianie barwnika do tkanek (przyżyciowo)

- impregnowanie – użycie metali ciężkich np. srebro
na skrawkach lub przyżyciowo ( jeśli przyżyciowo to później i tak trzeba uśmiercić osobnika)

TKANKI

• Nabłonkowa (regenerująca)

• Łączna ( właściwa, chrzestna, kostna, krew i limfa)

• Mięśniowa

1. Nabłonkowa

- komórki ściśle do siebie przylegają
- drobne komórki
- błona podstawna (białko graniczne)
- 1 jądro w komórkach nabłonkowych (centralne jądro)

- nabłonek przejściowy – więcej niż 1 jadro, max 4

- nabłonek walcowaty – jadro na dole komórki, nie musi być centralne
- komórki nabłonka nazywają się keranocytami

• Ukrwienie tkanki nabłonkowej

- nie posiada własnych naczyń krwionośnych
- ma zakończenia nerwowe (narząd może boleć)
- filamenty keratynowe – organella ( które są tylko w tkance nabłonkowej)

• Podział tkanki nabłonkowej
  a) czynnościowy
  b) strukturalny
  
  A. Czynnościowy:
  - okrywający (ochrona) np. naskórek człowieka
  - wyścielający (wyściela narządy, naczynia krwionośne)
  - gruczołowy (najbardziej zróżnicowana grupa funkcjonalna, wydzielający)
  - zmysłowy ( odbieranie bodźców)
  
  B. Strukturalny
  Ilość warstw komórkowych na błonie podstawnej
  - jednowarstwowy
  - wielowarstwowy

Jednowarstwowy:
- płaski
Komórka silnie spłaszczona ( naczynia krwionośne, pęcherzyki płucne)

- sześcienny = kostkowy
Komórka : podstawa = wysokość komórki (tarczyca)

- walcowaty = cylindryczny
Podstawa mniejsza od wysokości (wyściela przewód pokarmowy)

- wielorzędowy
Komórki różnego kształtu.
Każda komórka musi mieć kontakt z błoną podstawną ! (górne drogi oddechowe)

Tkanka jednowarstwowa: walcowata i wielorzędowa może posiadać rzęski


Wielowarstwowy ( posiada więcej niż 1 jadro)

- płaski

nierogowaciejący (początek odcinka układu
pokarmowego; jama, przełyk)
rogowaciejący (naskórek)

- walcowaty
Wyściela powieki, ślinianki, cewka moczowa

- przejściowy ( drogi moczowe)

Tkanka wielowarstwowa:

- warstwa podstawna(warstwa rozrodcza, odnawiane komórek)
- warstwa środkowa (komórki różnicujące się; w rożnym stadium rozwoju)
- warstwa właściwa ( właściwie wykształcone komórki)

• Funkcje nabłonka:
  - ochronna (bariera)
  - gruczoły – kształtują pH ( obronna)
  - glikokaliks – receptor komórkowy (obronna) – Aktywacja reakcji immunologicznych
  - rzęski zwiększają funkcjonalność układu
  - regulacja gospodarką wodną
  - bierze udział w procesach termoregulacji

1. Tkanka łączna ( podstawowa tkanka stanowiąca rusztowanie dla organizmu, odżywianie organizmu)

Komórki rozrzucone; są luźno rozmieszczone. Występuje dużo substancji międzykomórkowej. Jest to macierz, która składa się głownie z proteoglikanów ( białko)
Posiada naczynia krwionośne i włókna nerwowe.
Białka występujące w tkance łącznej to kolagen i elastyna.

• Podział tkanki łącznej:
  - właściwa
  - chrzestna
  - kostna
  - krew i limfa

A. Właściwa:
- galaretowata : podstawowa tkanka w rozwoju płodowym
- siateczkowa: narządy krwiotwórcze i limfatyczne
- włóknista:

• Luźna : buduje rusztowanie dla narządów, bierze udział w zabliźnianiu ran

• Zbita : (zwarta) : występuje w 2 formach:

  • O utkaniu nieregularnym ( błona otrzewnowa, opłucna, wszystkie błony)

  • O utkaniu regularnym ( buduje ścięgna i więzadła)

- Tłuszczowa

• Żółta ( funkcja zapasowa, termoizolacyjna, chroni przed urazami ważne narządy)

• Brunatna ( występuje tylko u niemowląt do kilku miesięcy życia, funkcja termoregulacyjna)

- Barwnikowa ( tęczówka oka, skóra, włosy)

• Komórki tkanki łącznej właściwej:
  - fibroblasty – syntetyzują(produkują) kolagen i elastynę
  - fibrocyty – mogą syntetyzować kolagen i elastynę, przy gojeniu ran, spoczynkowe komórki
  - histiocyty – komórki żerne tkanki łącznej
  - tuczne – mastocyty – obrona przed antygenami zawierającymi histaminę; wydzielają substancje aktywujące komórki układu odpornościowego
  - lipocyty ( adipocyty ) – komórki tłuszczowe

B. Chrzęstna

- szklista – wytrzymała, najtwardsza z wszystkich tkanek chrzęstnych, najmniej elastyczna, ściera się ( stawy, pierścienie tchawicy i oskrzeli, chrząstki krtani)

- sprężysta – najbardziej miękka, elastyczna ( uszy, nos)

- włóknista (łączy w sobie cechy dwóch pierwszych )
Usystematyzowana struktura ( krążki chrzęstne międzykręgowe – dyski)

• Komórki tkanki chrzęstnej
  - chondroblasty
  - chondrocyt ( produkuje chrząstkę)

• Cechy tkanki chrzestnej:
  - we wnętrzu brak naczyń krwionośnych i włókien nerwowych
  - struktury te dochodzą tylko do błony otaczającej chrząstkę czyli ochrzęstnej, która jest unerwiona i ukrwiona
  - najbardziej odporna na brak tlenu

C. Kostna

1. Grubowłóknista – występuje w życiu płodowym; wgłębniku kostnym , szwy kostne

2. Drobnowłóknista:

- gąbczasta ( koście krótkie i płaskie)
- zbita : tworzy pozostałe elementy kostne szkieletu

• Komórki tkanki kostnej:
  - osteoblasty: tworzą strukturę kości
  - osteocyty: regulują gospodarkę mineralną kości
  - osteoklasty: komórki kościogubne, modelują kość; biorą udział w odbudowie kości

• Struktura kości:
  - blaszki kostne:

• Systemowe – układają się w owalne struktury; osteony, posiadają kanał Haversa

• Międzysystemowe – miedzy osteonami, uzupełniają strukturę kości

• Obwodowe – budują wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnie kości

• Kość otoczona jest błoną (okostną)
  W kości występują kanały o przebiegu prostopadłym do długiej osi kości, nazywane Volkmanna, a w nich biegną naczynia krwionośne

• Cechy tkanki kostnej:

- kości są ukrwione
- najtwardsza tkanka organizmu
- najbogatsza tkanka w związki mineralne
- posiada najmniej wody

D. Krew i limfa

• Krew:

2 frakcje:

-płynna: osocze
- stała : ciała morfotyczne

Osocze:
- najwięcej wody, max do 92%
- białka max do 8%

Albuminy globuliny fibrynogen

- sole mineralne
- cukry, tłuszcze itp.

Ciała morfotyczne:
- erytrocyty : krwinki czerwone ( 5mln w 1 mikrolitrze krwi) : transport tlenu, gazów: CO₂
- leukocyty : krwinki białe ( 5 tys w 1 mikrolitrze krwi)
- granulocyty
- limfocyty ( typu B – produkują przeciwciała ; typu T – niszczą zarażone komórki, kierują odpowiedzią immunologiczną)
- monocyty: komórki żerne krwi
- trombocyty – płytki krwi, odpowiadają za krzepnięcie krwi (około 200-300 tys w 1 mikrolitrze krwi)

• Limfa: chłonka
  - rozprowadza po organizmie limfocyty zabierane z węzłów chłonnych
  - bierze udział w transporcie tłuszczów
  - istotna rola w mechanizmach obronnych organizmu, gdy dochodzi do zakażenia
  - w węzłach chłonnych dojrzewają limfocyty - białe krwinki
  - patogeny które dostana się do limfy zostają zniszczone, podobnie komórki nowotworowe
  - w skład limfy wchodzi osocze

• Cechy krwi:
  - jedyna płynna tkanka organizmu
  - funkcja obronna
  - transport wewnątrz ustrojowy
  - utrzymanie homeostazy w organizmie

1. Mięśniowa

• Rozróżniamy 3 typy tkanki mięśniowej

1. Poprzecznie prążkowana szkieletowa

2. Poprzecznie prążkowana serca

3. Gładka

• Mięśniowa poprzecznie prążkowana

Mięsień szkieletowy składa się głownie z tej tkanki.
.

Komorka mięśniowa – włókno mięśniowe:

Tkania mięśniowa poprzecznie prążkowana jest pochodzenia mezenchymalnego

Z komórek tych, w okresie życia lodowego, różnicują się jednojądrzaste mioblasty, które ulegają fuzji i powstają wielojądrzaste miotuby.

Miotuby są miejscem syntezy białek miofibrylarnych i komórkowych organelli obłonionych(mitochondria, siateczka śródplazmatyczna) i miejscem powstania synapsy nerwowo-mięśniowej. Tak powstaje komórka mięśniowa zwana włóknem mięśniowym.

Włókno mięśniowe ma kształt cylindryczny. Długość i średnica jest różna i zależy m.in. od gatunku i wieku osobnika oraz od wielkości mięśnia. Średnica włókien mięśniowych waha się w granicach od 10-100um, a długość od 1mm do kilkudziesięciu cm.

Na przekroju poprzecznym włókna mięśniowe mają kształt wieloboków, co wynika z ich ścisłego upakowania w tkance.

Błona komórkowa zwana sarkolemą jest dodatkowo otoczona amorficzną błoną podstawną, a ta otoczona jest cienką warstwą tkanki łącznej, którą nazywamy sródmięsną. W śródmięsnej umieszczone są naczynia włosowate, które zaopatrują poszczególne włókna mięśniowe.

Wnętrze włókna mięśniowego wypełniają włókienka mięśniowe (miofibryle), które biegną przez całą długość komórki, organelle komórkowe jak i mitochondria, nieliczne lizosomy oraz siateczkę śródplazmatyczną wraz z tubulami poprzecznymi, łączącymi się z przestrzenią międzykomórkową. Po za tym w zależności od typu włókna mięśniowego, w sarkoplazmie podstawowej znajdują się ziarna glikogenu lub kropelki tłuszczu

Jednostką strukturalną włókienek mięśniowych jest sarkomer, ma on kształt walca o wym: średnica 1-3um, długość od 2,3 do 2,8 um(stan spoczynku). Każde włókno mięśniowe składa się z kilkuset tysięcy sarkomerow. Włókienka zbudowane są z podłużnie ułożonych miofilamentów, wśród których rozróżniamy miofilamenty aktynowe(cienkie) i miofilamenty miozynowe(grube).

Sarkomery składają się z bardzo uporządkowanych odcinków, zwanych krążkami: I, A,Z, H, M. Poszczególne krążki jednego włókienka leżą na tych samych poziomach co krążki sarkomerów sąsiednich włókienek, co powoduje występowanie charakterystycznego poprzecznego prążkowania całych włókien mięśniowych.

Granicę sarkomeru wyznaczają krążki Z, które są miejscem zakotwiczenia fi lamentów aktynowych. Pomiędzy dwoma krążkami Z znajdują się pozostałe krążki wchodzące w skład jednego sarkomeru. Mięsnie kurczą się dzięki mechanizmowi ślizgania się filamentow. Filamenty zachodzą na siebie zachowując względną polarność po każdej stronie lini środkowej. Ruch ślizgowy jest napędzany przez głowy miozyny kroczące w kierunku końca plus przylegającego filamentu aktynowego.