Budowa cząsteczki wirusa grypy

Materiał genetyczny wirusa ma postać RNA zawartego w lipidowo białkowej otoczce (nukleokapsyd). Materiał genetyczny tworzy rybonukleoproteina, która składa się z 8 segmentów RNA, nukleoproteiny i polimeraz (PB1, PB2 i PA). Rdzeń otoczony jest przez białko M, które z kolei otacza osłonka lipidowa. W błonie zewnętrznej znajdują się dwie glikoproteiny: hemaglutynina i neuraminidaza. Glikoproteiny są najbardziej zmiennymi elementami wirusa i stanowią główny cel dla systemu immunologicznego.

Hemaglutynina ( H, HA)

• glikoproteina o właściwościach antygenowych

• funkcją tego białka jest przyłączenie cząsteczki wirusa do powierzchni infekowanej komórki

• nazwa hemaglutynina pochodzi od zdolności tej glikoproteiny do powodowania aglutynacji (zlepiania się ze sobą) erytrocytów

Neuraminidaza ( n,na )

• enzym odpowiedzialny za rozkład kwasu sialowego (należący do glikoprotein)

• umożliwia wirusom opuszczenie komórek poprzez rozpad błony komórkowej zarażonej komórki

• umożliwia także przyłączenie się wirusa do błony komórkowej, co ułatwia proces wnikania do wnętrza komórki (neuraminidaza ma duże powinowactwo do kwasu sialowego receptorów błonowych)

Typy wirusa grypy

Dzięki różnicom antygenowym występujących w białkach wewnętrznych możliwe jest rozróżnienie trzech głównych typów wirusa:

• A

• B

• C

Wirus Grypy Typu A

• genom wirusa stanowi jednoniciowy RNA, mający 8 segmentów

• występuje u ludzi i zwierząt (świnie, konie, foki, norki, wieloryby oraz ptaki)

• jest przyczyną najbardziej gwałtownych objawów chorobowych (bardzo wysoka gorączka, skrajne wyczerpanie, silne bóle) i niebezpiecznych powikłań

• odpowiedzialny jest za występowanie poważnych epidemii i pandemii

• nazywany jest często wirusem podwyższonego ryzyka bo łatwo i często się mutuje

Klasyfikacja w oparciu o typy białek tworzących otoczkę Białkową

Wirus grypy typu A można poddać dalszej klasyfikacji na podtypy w oparciu o rodzaj białek tworzących otoczkę białkową hemaglutynina (HA lub H) oraz neuraminidazy (NA lub N). Białka te są niezbędne do poprawnej replikacji wirusa. Wyróżniono 16 podtypów HA (H1-H16) oraz 9 podtypów NA (N1-N9), co daje łącznie 144 możliwych kombinacji segmentów genowych i powoduje istnienie ogromnej różnorodności wirusów typu A. Obecnie najpowszechniejsze są szczepy wirusa należące do podtypów H1N1 oraz H3N2. Poszczególne szczepy oznacza się określając rodzaj, miejsce wyizolowania zarazka, numer próbki, rok oraz typ hemaglutyniny i neuraminidazy np. A/Moscow/10/99 (H3N2)

Wirus grypy typu b

• genom wirusa składa się z jednoniciowego RNA podzielonego na 8 segmentów

• ma tylko po jednym podtypie HA i NA

• występuje tylko u ludzi

• grypa nim spowodowana ma z reguły łagodniejszy przebieg i nie miewa charakteru pandemicznego

• może być przyczyną corocznych epidemii

Wirus grypy typu c

• występuje u ludzi i świń

• powoduje tylko lekkie infekcje, np. zapalenie spojówek i nie powoduje występowania epidemii

• w odróżnieniu od typów A i B, jednoniciowy RNA ma tylko 7 segmentów

• cząsteczka wirusa nie posiada białka neuraminidazy, za to jest wyposażona w dodatkowe białko HEF

• Epidemia - występowanie w określonym czasie i na określonym terenie przypadków zachorowań lub innych zjawisk związanych ze zdrowiem w liczbie większej niż oczekiwana.

• O pandemii grypy mówi się wtedy, kiedy ogarnia ona swoim zasięgiem poszczególne kraje, całe kontynenty, a nawet cały świat. Pandemia jest epidemia o bardzo dużym zasięgu i rozprzestrzenianiu się.

Grypa hiszpanka

Pandemia, która miała miejsce w latach 1918-1919, znana pod potoczną nazwą "hiszpanka" była pandemią wywołaną przez wyjątkowo groźną odmianę podtypu H1N1 wirusa A grypy. Pochłonęła ona jak się ocenia od 50 do 100 mln ofiar śmiertelnych na całym świecie. Była to jedna z największych pandemii w historii ludzkości, w przebiegu której zachorowało ok. 500 mln ludzi, co stanowiło wówczas 1/3 ludzkości.

Grypa azjatycka

• Szczep grypy azjatyckiej powstał w prowincji Junan w Chinach w 1957 roku.

• Wirus, który spowodował epidemię grypy azjatyckiej uzyskał miano H2N2

• Ten wariant wirusa najprawdopodobniej pojawił się poprzez zmieszanie szczepu ludzkiego z wirusem atakującym dzikie kaczki.

• W sumie epidemia dotknęła do 50% populacji świata, a 25% odczuwało objawy. Śmiertelność wyniosła 1/4000 osób, głównie wśród dzieci i osób starszych. Całkowita ilość zgonów przekroczyła 1 milion, mogła dojść nawet do kilku milionów.

• Po mutacji powstał wirus H3N2, który wywołał później grypę Hong-Kong

Przyczyny zmienności wirusa grypy

• Przesunięcie antygenowe (ang. antigenic drift)

• Skok antygenowy (ang. antigenic shift), reasortacja

Przesunięcie antygenowe (dryft)

Występuje w przypadku wirusów zarówno typu A, jak i typu B. Polega na zajściu mutacji punktowych. Wśród nich najczęściej obserwowane są podstawienia, delecje i insercje. Efektem zachodzenia mutacji punktowych są zmiany w genach, które kodują hemaglutynine i neuraminidazę, a to z kolei powoduje występowanie co roku epidemii grypy.

Skok antygenowy (reasortacja)

Występuje tylko u wirusów grypy typu A. Reasortacja możliwa jest dzięki segmentowej budowie genomu wirusa grypy. Podczas skoku antygenowego dochodzi do wymiany całych segmentów RNA między różnymi wariantami wirusów, które zakażają tą samą komórkę. Do reasortacji może dochodzić zarówno pomiędzy ludzkimi wirusami grypy, jak też między wirusami wstępującymi u ludzi oraz u zwierząt. Reasortacja genetyczna może powodować pojawianie się nowych białek hemaglutyniny (lub niekiedy neuraminidazy), na które populacja nie wytworzyła odporności. W konsekwencji nowe wirusy mogą powodować pandemie.

Podstawowa zasada przeciwdziałania grypie – szczepienia ochronne!

W leczeniu przyczyn grypy, czyli niszczeniu wirusów grypy typu A i B  podstawową zasadą jest profilaktyka. Leki przeciwwirusowe nowej generacji i starszej należy stosować jako uzupełnienie szczepienia przeciwko grypie, a nie jako jego substytut.

W celu profilaktyki stosuje się obecnie 2 rodzaje szczepionek:

• Inaktywowane

• Żywe, czyli atenuowane

Leki antygrypowe

W przypadków wystąpienia objawów grypy można rozważyć włączenie do terapii leków antywirusowych:

• Inhibitorów białka wirusowego M2: amantadyny i rymantadyny

• Inhibitorów neraminidazy: zanamiwiru, oseltamiwiru i peramiwiru

Inhibitory białka wirusowego M2

• Amantadyna i rymantadyna są inhibitorami wewnętrznego białka M2 wirusa grypy

• Są skuteczne tylko w przypadku wirusa grypy typy A

• Hamują adsorpcję wirusa i przenikanie do wnętrza komórek

• Wywołują wiele działań niepożądanych

• Obecnie nie zaleca się ich stosowania ze względu na bardzo duży odsetek szczepów wirusa opornych na te leki

Hemaglutynina i neuraminidaza

• Hemaglutynina –w nazwach szczepów oznaczana literą H; umieszczona na powierzchni wirionów, umożliwia ich połączenie z kwasem sialowym

• Neuraminidaza - w nazwach szczepów oznaczana literą N; uwalnia powstałe w komórce wiriony umożliwiające zakażenie kolejnych komórek. Enzym odpowiedzialny za rozkład kwasu sialowego, występujący w wirusach grypy. Należy on do glikoprotein. Neuraminidaza umożliwia również przyłączenie się wirusa do błony komórkowej, co ułatwia proces wnikania do wnętrza komórki - ma ona duże powinowactwo do kwasu sialowego receptorów błonowych.

Inhibitory neuraminidazy

• Zanamiwir, oseltamiwir i peramiwir są inhibitorami neuraminidazy (NA)

• Są wykorzystywane w leczeniu i profilaktyce

• Skuteczne dla wirusów typu A i typu B

• Naśladują naturalny substrat dla NA i działają na drodze kompetencji, mając większą specyficzność i powinowactwo do NA niż właściwy kwas sialowy

Zastosowanie tych leków pomaga zapobiegać rozprzestrzenianiu się wirusa grypy w organizmie i łagodzi objawy zakażenia, może również zapobiec ich wystąpieniu.

Zanamiwir

• Lek ten tak hamuje aktywność neuraminidaz wirusów grypy typu A i B

• Z trudnością przechodzi przez błony komórkowe, co powoduje trudności we wchłanianiu z przewodu pokarmowego, podawany poprzez inhalację

• Skraca czas trwania grypy bez powikłań o średnio 1-2,5 dnia

• Zapewnia łagodniejszy przebieg choroby

• Działania niepożądane jakie może wywołać ten lek to:

• bóle głowy

• objawy żołądkowo-jelitowe

• zapalenie oskrzeli

• duszności

• wysypka i pokrzywka

Zanamiwir jest bardziej zbliżony budową chemiczną do naturalnego substratu neuraminidazy, czyli kwasy sialowego, dzięki czemu umożliwia dopasowanie strukturalne do „kieszeni wiążącej” substrat, bez konieczności zmiany konformacyjnej. Oddziaływanie leku z centrum aktywnym neuraminidazy dotyczy reszt kwasu glutaminowego, a grupy hydroksylowe glicerolu wiążą się z kwasem glutaminowym.

Oseltamiwir

• W wątrobie ulega enzymatycznej konwersji przez esterazy do aktywnej formy

• Skraca czas trwania grypy o ok. 1,2-1,4 dnia

• Zmniejsza natężenie objawów choroby, poprawia samopoczucie

• Ogranicza szerzenie się zakażenia

• Objawami niepożądanymi są:

• wymioty

• biegunka

• pokrzywka

• zapalenie wątroby

METODY WYKRYWANIA WIRUSÓW GRYPY

Okienko serologiczne- Jest to przedział czasu od chwili zakażenia do możliwości wykrycia tego zakażenia przez laboratorium za pomocą oznaczania obecności przeciwciał. Inaczej okres od początku infekcji do wytworzenia przez organizm wykrywalnego stosowanymi w diagnostyce metodami miana przeciwciał zwalczających dany antygen.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych opiera się na ocenie odpowiedzi immunologicznej organizmu na rozwijające się zakażenie (swoiste przeciwciała) lub też wykazaniu obecności wirusa, jego antygenów, ewentualnie kwasu nukleinowego w materiale klinicznym oraz ich identyfikacji.

Ważna diagnostyka grypy

• By uniknąć antybiotykoterapii

• By podjąć właściwe leczenie

• Szybkie użycie inhibitorów neuraminindazy

Warunki uzyskania wiarygodnego wyniku badania laboratoryjnego zależne są od tego:

• Kiedy materiał został pobrany

• W jaki sposób został pobrany, m. in. jakiego rodzaju podłoża użyto

• W jaki sposób został przechowywany materiał i jak długo

• W jaki sposób był transportowany

Kiedy pobrać materiał?

Materiał do badań laboratoryjnych w kierunku grypy najlepiej jest pobrać w ciągu 3 dni od momentu wystąpienia objawów choroby. Powinno być użyte do tego celu odpowiednie podłoże transportowe dla wirusów, zapewniające im określoną stabilność zanim próbka trafi do laboratorium.

Skąd pobierać materiał?

• Wymaz z nosa, nosogardzieli

• Popłuczyny z gardła

• Aspirat odessany z nosowej części gardła

• Popłuczyny oskrzelowe

• Płyn mózgowo – rdzeniowy

Metody diagnostyki zakażeń wirusowych

• Bezpośrednie:

• izolacja i identyfikacja wirusa

• Wykazanie antygenów wirusowych w materiale klinicznym

• Pośrednie

• Diagnostyka serologiczna

Metody molekularne

• RT – PCR

• Real – time RT – PCR

• NASBA – Nucleid Acid Sequence – Based Amplification

• Multiplex RT - PCR

• Nested RT - PCR

Metody molekularne

Zalety:

• Wyższa czułość i swoistość niż pozostałe techniki

• Umożliwia wczesne wykrycie materiału genetycznego wirusa

• mniej restrykcyjne wymagania w stosunku do badanego materiału biologicznego (konieczne minimum to tylko 2–5 cząstek wirusowego RNA lub DNA)

• Pula wirusów, które można rozpoznać tymi metodami nadal rośnie

Wykrywanie antygenów wirusowych

• Metoda immunoenzymatyczna

• Metoda immunochromatograficzna

• Metoda immunofluorescencji

Metoda immunoenzymatyczna

Inaczej test ELISA. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem.

Podstawowy schemat testu ELISA:

• Antygen unieruchomiony jest na powierzchni fazy stałej

• Wprowadzenie materiału biologicznego (osocze lub surowica),  w którym badana będzie obecność przeciwciał specyficznych dla unieruchomionego antygenu

• Powstaje kompleks immunologiczny (unieruchomiony antygen i przeciwciało), przeciwciało dzięki temu jest związane z podłożem

• Po przepłukaniu środowiska reakcji, dodawany jest tzw. koniugat czyli przeciwciało skierowane przeciw przeciwciałom ludzkim połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. 

• Po ponownym przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym zawarty w koniugacie katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można ocenić ilościowo metodą spektrofotometryczną, służącą do pomiaru intensywności barwy

• Poziom intensywności barwy, zależny od stężenia produktu reakcji enzymatycznej, jest proporcjonalny do stężenia przeciwciał w próbce.

• Równolegle do próbek badanych, przeprowadza się analogiczne etapy reakcji dla tzw. surowic kalibracyjnych (kalibratorów) o znanym stężeniu badanego przeciwciała.

• Z równania krzywej kalibracyjnej oblicza się stężenie przeciwciał w próbkach badanych

Opłaszczanie i blokowanie fazy stałej

Wymagane jest opłaszczenie fazy stałej przeciwciałem lub antygenem.

Faza stała to płytki polistyrenowe lub pleksiglasowe ze studzienkami(dołkami). W tej metodzie wykorzystuje płytki 96-dołkowe.

Opłaszczenie rozpoczyna się od dodania przeciwciała lub antygenu. Całość inkubowana jest w temp. 37⁰C, a potem 4⁰C.

Czynnik stosowany do opłaszczenia zawieszony jest w buforze.

Należy zablokować miejsca niezajęte za pomocą czynników blokujących, np. roztworu owoalbuminy lub odtłuszczonego mleka, by zapobiec nieselektywnemu przyłączeniu się białek do fazy stałej w następnych etapach.

Metoda immunofluorescencji

Jest stosowana jako metoda potwierdzająca wyniki uzyskane w teście IC i IE. Metodę immunofluorescencyjną charakteryzuje większa czułość i swoistość, jednak interpretacja wyników wymaga doświadczenia, jest subiektywna i bardziej czasochłonna.

W reakcji pośredniej za pomocą znakowanych fluoresceiną antyludzkich przeciwciał wykrywa się ludzkie przeciwciała związane z danym mikroorganizmem.

W reakcji bezpośredniej antygen reagując ze znakowanym przeciwciałem daje znakowany kompleks antygen-przeciwciało.

Metoda immunochromatograficzna

W testach immunochromatograficznych wykorzystuje się zasadę działania opierającą się na połączeniu przeciwciała z białkowym antygenem. Reakcja immunologiczna przebiega na papierze chromatograficznym (membranie nitrocelulozowej) z wykorzystaniem zjawisk kapilarnych. Jedno przeciwciało jest unieruchamiane na membranie celulozowej, a drugie jest znakowane koloidalnym złotem i przenika na powierzchnię testową.