WYKŁAD 4

Rys.1 Zależność między substratem [s] a początkową szybkością reakcji [v₀]

a. bezpośrednio w układzie współrzędnym

b. w układzie współrzędnych które są odwrotnościami V i [s]

Inhibicja odwracalna:

Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócenia aktywności danego enzymu. Każda cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego szybkości katalitycznej jest określana jako inhibitor. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami komórkowymi , które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego szlaku .

Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu takimi jak toksyny i leki . W tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne , ale również letalne . Rozróżnia się dwa główne typy inhibicji enzymów :

- nieodwracalną

-odwracalną

Przy czym inhibicja odwracalna dzieli się na inhibicje kompetycyjną i nie kompetycyjną .

Inhibicje odwracalną można przezwyciężyć usuwając inhibitor z enzymu np. w drodze dializy . Jest to jednak z definicji nie możliwe w przypadku inhibicji odwracalnej .

Inhibicja nieodwracalna:

Te enzymy które wiążą się z inhibitorem nieodwracalnie często tworzą nie kowalencyjne wiązania z resztami aminokwasów znajdujących się w miejscu aktywnym lub w miejscu aktywnym inaktywują enzym na stałe .

W związku z tym biorą udział reszty Ser i Cys mające odpowiednio reaktywne grupy – OH i – SH np. związek diizopropylofluorofosforan (DIPF) składnik gazów bojowych działających na układ nerwowy reaguje z resztą Ser w miejscu aktywnym esterazy acetylocholinowej , nieodwracalnie hamując enzym i uniemożliwiając przekazywanie impulsów nerwowych (rys.2a) .

Amid kwasu jodooctowego modyfikuje reszty Cys i może być stosowany jako czynnik diagnostyczny w określeniu czy aktywność enzymatyczna wymaga jednej czy też więcej reszty Cys (rys.2b) .

Antybiotyk penicylina nieodwracalnie hamuje enzym transpeptydazą peptydoglikanu , która tworzy poprzeczne wiązanie w ścianie komórek bakteryjnych . Przy czym hamowanie to polega na łączeniu się penicyliny z resztą Ser w miejscu aktywnym enzymu .

Rys.2. Struktura i mechanizm działania :

a. diizopropylofluorofosforan (DIPF)

b. amid kwasu jodu octowego

Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do normalnego substratu enzymu , dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami substratu o wiązanie się z miejscem aktywnym (rys.3a) .Enzym może wiązać albo cząsteczkę substratu albo cząsteczkę inhibitora , ale nie oba równocześnie (rys.3b).Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie . Przy dużych stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone ponieważ duże stężenie substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczka inhibitora o wiązanie się w miejscu aktywnym .Nie nastąpi wiec żadna zmiana wartości V_max enzymu , ale w obecności inhibitora kompetycyjnego pozornie zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wartość K_m wzrasta .

Rys.3. Charakterystyka hamowania kompetycyjnego .

a. Inhibitor kompetycyjny współzawodniczy z substratem o wiązanie w miejscu aktywnym

b. Enzym może wiązać albo substrat albo inhibitor kom petycyjny , ale nie oba razem

c. Wykres kinetyki enzymu w układzie współrzędnych , które są odwrotnościami

V i [s] , ukazujący wpływ inhibitora kompetycyjnego na wartość V_max i K_m .Dobrego przykładu hamowania kom petycyjnego dostarcza dehydrogenaza bursztynianowa .Enzym ten używa bursztynianu jako substratu i jest hamowany kompetycyjnie przez malonian , który różni się od bursztynianu posiadaniem tylko jednej a nie dwóch grup metylenowych (rys.4) .Wiele leków działa przez naśladowanie struktury substratu specyficznego dla enzymu docelowego i stąd działają jako inhibitory kompetycyjne tego enzymu . Kompetycyjne charakter inhibicji można rozpoznać z użyciem wykresu Lineweavera – Burka mierzy się wtedy V_o przy różnych stężeniach substratu w obecności stałego stężenia inhibitora . Inhibicja kompetycyjna z większa nachylenie linii na wykresie Lineweavera – Burka i zmienia jej przecięcie z osią X (ponieważ K_m wzrasta) . Ale nie zmienia pozycji przecięcia tej linii z osia Y , ponieważ wartość V_max pozostaje stała (rys.3c) .

Rys.4. Inhibicja dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian

COO^--CH₂- CH₂-COO^- + FAD –(1)> COO^-CH=CH-COO^- + FADH₂

1. Dehydrogenaza bursztynianowa

COO^--CH₂-COO^- -(1)> Reakcja nie zachodzi

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce aktywne (rys.5a) i powoduje zmianę przestrzennego kształtu enzymu co prowadzi do zmniejszenia aktywności katalitycznej , ponieważ inhibitor wiąże się w innym miejscu niż substrat , enzym może wiązać albo inhibitor albo substrat lub też inhibitor i substrat równocześnie (rys.5b) .Efektu działania inhibitora niekompetycyjnego nie można przez zwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się wartość V_max .W inhibicji niekompetycyjnego powinowactwo enzymu do substratu pozostaje niezmienne , a więc wartość K_m nie zmienia się .Przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest działanie pepsatyny na enzym reninę (=chymozyna) (renina to jest czysty enzym , natomiast podpuszczka – nazwa handlowa preparatu z żołądków cieląt , z którego można otrzymywać czystą reninę) .Pepsatyna – większość proteaz aspurtylowych (karboksylowych albo kwasowych) hamowana jest przez bardzo małe stężenia izolowanego z mikro organizmów peptydy nazywanego pepsatyną .Niekompetycyjny charakter inhibicyjny można łatwo rozpoznać na wykresie Lineweavera – Burka , ponieważ następuje wtedy wzrost nachylenia linii wyznaczany doświadczalnie i zmienia się miejsce jej przecięcia z osią Y (ponieważ wartość V_max maleje ) . Ale miejsce jej przecięcia z osią X nie zmienia się (ponieważ wartość K_m nie zmienia się) (rys.5c) .

Rys.5. Charakterystyka hamowanie niekompetycyjnego

a. Inhibitor niekompetycyjny wiąże się w miejscu odmiennym od miejsca aktywnego

b. Enzym Mozę wiązać albo substrat albo inhibitor niekompetycyjny albo oba naraz

c. Wykres kinetyki enzymu w układzie współrzędnych , które są odwrotnościami V i [s] , ukazujący wpływ inhibitora niekompetycyjnego na wartość K_m i V_max