Otrzymywanie limfocytów z narządów limfatycznych -zwierz dośw(myszki) przed wyizolowaniem należy skrwawić -całość przeprowadzamy w tem 4`C na łażni lodowej-umieszczone w płynie odżywczym izolowane narządy wyczesujemy igłą preparacyjną – zawiesinę komórek przecedzamy przez sito do próbówek i wirujemy 15-30 min zbieramy supernatant, wirujemy i płuczemy 3x przy 1200 obr/min. – po ostatnim wirowaniu osad z komórek zawieszamyw 1-2 ml plynu odżywczego

Otrzymtwanie makrofagów: wypłukujemy jame otrzewnowa za pomocą płynu odżywaczego (Hanksa) – licz makrofagów można zwiększyć wywołując zapalenie poprzez dodanie dootrzewnowo jałowego oleju parafin lub bulionu

Otrzy, leukocytów z krwi obwod (hemoliza): -mieszamy równe ilości krwi i wody destylowanej jałowej w prób wirnikowej – pozostawiamy na 20-30sek – dod płyn Hanksa w proporcji 1:10 – wirujemy 10 min przy obrotach 1650/min – osad leukocytów 3x płuczemy płynem Parkera za każdym razem wirując

Otrz leukocytów z krwi obwodowej-met sedymentacji: sedy spontaniczna: pobrana krew na heparynę zostawiamy na 1 godz w 37`C – zbieramy kozuch leukocytów, wirujemy 10 min 1650obr/min – reszki erytrocytów dod 0,5 ml jałowej wody destylowanej – osad leukocytów 3x płuczemy Parkerem; sed w żelatynie: pobrana krew na heparynę mieszamy z żelatyna 1-3% i zostawiamy na godz – zbieramy kożuch leukocytów i wir 10 min przy 1650obr/min – osad leukocytów 3x płuczemy Parkerem za każdym razem płukajac Sed w alkoholu poliwinylowym: krew mieszamy w rówych ilościach z roztw alkoholu 1,2% i zostawiamy na 45min w temp pok –tworzą się 2 warstwy – górną zbiera się i wiruje przez 30min(1600obr/,min) – do pozbycia się resztek erytrocytów dodajemy wody dest(hemoliza) – wirujemy i płuczemy 3x przy 1600obr/min – po ostanim wirowaniu osad komórek zawieszamy w płynie eagla 1-2 ml

Izolacja kom krwi obwodowej metoda wirowania w gradiencie gęstośći- wykorzystuje się róznice w wielkości i ciężarze właściwym izolowanych kom. Gradient posiada dobzrez dobrana gęstość względna i okreslona warstwa tworzy sito zatrzymujace na powierzchni izolowana populacje komórek lżejszych, przepuszczając kom cięższe.1 Krew pobran a na heparynę nawarstwiamy na gradizol G (1,5/2,5 krwi) – wir 25min/1650 – otrzymujemy frakcje krw czerw jako osad 2. Krew mieszamy równo z płynem odżywczym – na 3ml gradizolu L nawarstwiamy 4 ml krwi rozcięczonej i wir 1600 – od dna: krw czer,gradizol L,leukocyty,osocze 3.2ml krwi na 2ml fikolu w próbówce wirnikowej i wir 40min/1600 – frakcje erytrocyty i granukocyty, ficol, leuko,plazma

Testy stosowane do badania parametrów nieswoistej odporności komórkowej

Test NBT (Nitro Blue Tetrazolium)

Test zdolności zabijania wewnątrzkomórkowego zarazków. Spontanicznej redukcji soli tetrazoliowych(NBT) do nierozpuszczalnego w wodzie formazanu przez neutrofile i monocyty krwi obwodowej.

Metoda Spektrofotometryczna – Mieszamy w równych objętościach (po 0,3ml)pełnej heparynizowanej krwi i 0,1% NBT i inkubujemy w 37st.C(lub 22) w łaźni wodnej przez 15min. Do 0,15 ml tej mieszaniny dodajemy 2 ml formamidu. Po wymieszaniu wirujemy przez 5 min przy 3000 obr/min i mierzymy na spektrofotometrze wobec próby zerowej<formamid) przy filtrze 546nm.

Metoda cytochemiczna – Mieszamy w równych objętościach(po 0,3 ml)pełnej heaprynizowanej krwi i 0,1% NBT i inkubujemy w 37st.C(lub 22) w łaźni wodnej przez 15 min. Po tym czasie wykonujemy rozmazy na szkiełkach,utrwalamy je alkoholem metylowym przez 5 min, suszymy i brawimy przez 20 min 0,1% safraniną. Liczymy pod mikroskopem 100 kolejnych leukocytów z zabarwionymi na różowo złogami,określając ilość komórek zdolnych do redukcji NBT w postaci - % komórek NBT dodatnich(NBT+).

Indeks fagocytarny – średnia liczba bakterii sfagocytowanych przez jedną komórkę fagocytującą. Do probówki wprowadzamy 0,2ml zawiesiny makrofagów i 0,2ml zawiesiny gronkowca(Staphylococcus aureus 209P) i po wymieszaniu inkubujemy w łaźni wodnej w temp. 37st.C przez 45min. Z zawiesin wykonujemy rozmazy na szkiełkach podstawowych. Suszymy je na powietrzu i barwimy metodą Pappenheima(2 ml barwnika May-Grunwalda na 3 min; 2ml wody destylowanej na 1 min; spłukać wszystko i nalać 3 ml roztworu Giemsy – 10ml wody destylowanej +15 kropel barwnika Giemsy – na 30 min; spłukać wszystko wodą i wysuszyć na powietrzu). Jądra leukocytów obojętnochłonnych barwią się na ciemnoniebiesko, cytoplazma na różowoniebiesko, a same bakterie na niebieskofioletowo. Preparaty oglądamy pod mikroskopem, licząc w 100 kolejnych makrofagach ilość sfagocytowanych bakterii. Wynik przedstawiamy jako: IF=Liczba sfagocytowanych bakterii/Liczba makrofagów fagocytujących

RBA(Respiratory Burst Activity) – ocena zdolności wewnątrzkomórkowego niszczenia bakterii przez fagocyty krwi – wybuch tlenowy

PKA (Potential Killing Activity) – ocena zdolności bójczej bakterii przez fagocyty krwi

Do wszystkich rzędów(kolumny 1-10)dodajemy po 100ul podłoża(a,b,c). Do wszystkich dołków w kolumnach 1-10 dodajemy po 100 ul zawiesiny wyizolowanych limfocytów od pacjenta(pacjent 1 – kolumna 1,pacjent 2 – kolumna 2itd. na płytce max 10 prób). Kolumna 11=próba „zero”, pozostaje pusta. Kolumna 12= kontrola – do każdego dołka po 200 ul samego podłoża,bez dodatku komórek. Inkubacja – 2h w 37st C lub do 24 h w lodówce. Wirujemy płytkę 2-5min przy 600-800 obr/min i wylewamy zawartość. Do rzędów A i B(kolumny 1-10,12) dodajemy po 100 ul 0,1% zawiesiny NBT w PBS(a) – Kontrola. Do rzędów C-E (kolumny1-10,12) dodajemy po 100 ul PMA w 0,1 % NBT (koncentracja 1 ul PMA/1ml 0,1% NBT(b) – RBA. Do rzędów F-H (kolumny 1-10,12)dodajemy po 100 ul zawiesiny bakterii(gronkowca) w 0,1% NBT (koncentracja 1 część bakterii + 2 części 0,1% NBT(c) – PKA. Inkubacja 37st.C przez 30 min. Wylewamy medium. Do wszystkich dołków dodajemy po 100 ul alkoholu absolutnego na 2-5min i wylewamy. Płuczemy 3x70% etanolem(po 100 ul/dołek)Suszymy w powietrzu(można przechowywać kilka m-cy). Odczyt: do wszystkich dołków dodajemy po 120 ul 2-n KOH i 140 ul DMSO. Wytrząsamy 2 min. PO 5 min odczytujemy na spektrofotometrze przy długości fali – 620 nm. Komórki rybie inkubujemy w 22st.C. Przy rybach do rozdziału stosujemy wyższe wartości obrotów i czas(35-45 min – 2700obr/min)

Oznaczanie lizozymu Met turbidymetryczna: poównanie gęstości optycznej zawiesiny wrażliwych bak(micrococcus lysodeitcticus) i badanego płyniu z gęstością optyczna tej samej zawiesiny z róznymi znanymi stężeniami lizozymu białka kurzego. – najpierw rozt bakterii w buforze fosforanowym – dodajemy badany materialnp surowice i mierzymy ekstyncje E0- początkowa a nastepnie po 5min E1,10 E2 do E5.E4 jest końcową – krzywa standardowa wykreślamy na podstawie pomiaru dla różnych koncentracji lizozymu np. 100ug/ml Met płytkowa : stosowana gdy oznaczanie lizozymu jest utrudnione przez znaczne zmętnienie lub zabarwienie np. hemaglobina badanego preparatu – najpierw w zawiesinie bakterii w żelu agarazowym wycinamy dołki o Sr 4mm,odległość nie mniejsz niż 4 cm – do dołka wprowadzamy badana próbe i inkubujemy przez 37`C/24godz. – jeśli jest lizozym to sa przejaśnienia wywołane rozpuszczeniem bakterii przez enzym. Śred mierzymy w mm srednica uzalezniona od ilości lizozymu – stężenie odczytujemy z krzywej standardowej

Oznaczanie białka całkowitego i frakcji gammaglobulinowej Metoda kolumnowa; na kolumnę z Sefadexem g200 nakłada się na surowice i kilkanaście godzin filtruje.poszczególne frakcje skapują do próbówek, najwolniej albuminy-najlżejsze, najcięższe frakcje spływają najszybciej. MET ELEKTROFORETYCZNA : rozdział elektroforetyczny badanej próby przeprowadza się w polu elektr przy użyciu różnych nośników, bibuły w buforze o zasadowym pH- zastosowanie głownie do celów analitycznych i w organicznym stopniu do celów preparatywnych – znajdujące się w roztworach cząsteczki maja ładunek i migrują po przyłożeniu zewn pola elektro – białka + do katody a biał – do anody –albuminy i alfaglobuliny do anody, gammaglobuliny zostają do katody – na żelu agarozowym bialka surowicy rozdzielają się na 5:albuminy,ala 1 2,beta i gamma globuliny. Met turbidymetryczna (spektrofotometryczna): określamy zawartośc bialka całkowitego w surowicy metoda biuretową;krzywa standardowa bialka calkowitego: liofilizat białka rozpuszczamy w 5ml wody destylowanej(1ml/50g/lbiałka) następnie wykonujemy rozcięczenia. Dla każdego odczytujemy ekstyncje (kreślimy krzywa standardową) – mieszamy bad surowice 1:1 z glikolem polietylenowym i inkubujemy 2godz mieszają – wirujemy 20tys/min i zbieramy odpowiednia ilośc supernatantu – w nim metoda biuretowa określamy zawartośc białka całkowitego –odejmujemy E białka całkowitego – E supernatantu – wartość 0,2 podstawa do odczytania gammaglobulin z krzywej

Oznaczanie liczby komórek prod przeciwsciała : PCF: odczynb opiera się na zasadzie techniki łysinek stosowa w bad bakteriofagów – kom limfoidalne zmieszane z gęsta populacja erytrocytów oraz dopełniacza w żelu agarowym wylewa się na płytki petriego – kom limfoidalne w obecności dopełniacza powodują lize komórek indykatorowych(erytro) – powstają łysinki widoczne gołym okiem(niekiedy mikroskop) metody:1.bezposrednia: służy do wykrywania przeciwciał Ig M2. Pośrednia (IgG)- przed dodaniem dopełniacza krwinki traktuje się surowica antyglobulinowa- antyglob łączy się z 1 strony z przeciwciałami wytw przez kom limfoidalne z drugiej z erytrocytami – tak opłaszczone eryt są bardziej podatne na działanie dopełnicza – do pewnych wyników test wykonujemy na płytkach – do obliczen bierzemy średni,a z 2 płytek ELISSPOT: szybka metod,zastosowanie przeciwciał monoklonalnych – używa się płytek filtracyjnych multiscreenHA, które pokrywamy przeciw monokl –po immunizacji in vitro już od 3dnia(najwyższy poziom 5-10) oraz po podaniu in vivo od 5-7 dnia(najwyższy poziom 14-28 dzien) ELISA : próba immnoadsorpcyjnie związanego enzymu – stały nośnik może mieć kształt studzienek: płaskich płytek, pałeczek kulek – odczyn stosujemy w idenstyfikacji serologii i badaniach serologicznych – skałd:płytka polistyrenowa lub na innym nośniku adsorbujemy przeciwciało swoiste lub antygen diagnostyczny dla którego poszukujemy swoistych przeciwciał w badanym materiale, w zależności od rodzaju badania które wykonujemy – nanosimy zawiesinę bad materiału, a następnie konjugat(znakowane enzymem przeciwciała) – na koniec dodajemy substart dla enzymu(peroksydaza chrzanowa lub alkaliczna fosfataza) – obserwujemy przy wyniku dodatnim jego rozkład i barwna reakcje – zalety:duża czułość,szybkośc wykonania,względna trwałośc komponentów reakcji – mozliwośc odczytania barwnej reakcji gołym okiem jeżeli brak spektrofotometru

Ocena stopnia proliferacji limfocytów in vitro - w fazie poprzedzającej pojawienie sie limfocytów uczulonych i przeciwciał (4-6 dni po kontakcie z antygenem) dochodzi do transformacji małych limfocytów w komórki blastyczne (2-4 krotnie wieksze). Transformacja blastyczna limfocytów można również indukować w hodowlach tych komórek in vitro mitogennymi substancjami izolowanymi z roslin: fitohemaglutyniną (PHA) mitogennami (PMW) konkawaliną (ConA) jak również różnorodnymi antygenami takimi jak :lipopolisacharydy (LPS), obcogatunkowe białka.

I Metoda Izotopowa trasformacji blastycznej limfocytów - Oparta na pomiarze inkorporacji radioaktywnie znakowanhch prekursorów kwasów nukleinowych i białek w stymulowane limfocyty. Limfocyty transformujące w blasty intensywnie syntezuja kwasy nukleinowe oraz białka i wbudowuja dodane do hodowli prekursory tych związków jak H3-urydyna C14-leucyna. Ilośc wbudowanych prekursorów mozna wyznaczyc przez pomiar promieniowania beta w licznikach scyntylacyjnych. Do 6 próbówek wlewamy po 1 ml zawiesiny limfocytów, nastepnie do 3 próbówek dodajemy mitogen np fitohemaglutyninę (10-15 ug/ml), do pozozstałych podłoża do hodowli (kontrola). Próbówki zakrywamy folia i inkubujemy w 37C w atmosferze zawierającej 5% co2 przez 72h, po 48h do wszytskich próbówek dodajemy po 0,1 ml roztworu H3-tymidyny w podłożu do hodowli o aktywności 5uCi/ml , i ponownie hodowle wstawic do inkubatora z Co2 na 24h. Po tym czasie zlewamy płyn znad osadu i przepłukujemy trzykrotnie PBS, za każdym razem wirując przez 10 min przy 1000obr/min. do osadu dodajemy 1ml 5% kwasu trójchlooctowego i pozostwaiamy na 10 min, po tym czasie wirujemy przy 1000obr/min przez 5 min. zlewamy kwas i dodajemy po 0,2 ml (w rękawiczkach) rozpuszczalnika organicznego na 10 min, po tym czasie do każdej próbówki dodajemy po 5 ml płynu scyntylacyjnego i przelewamy do naczynek scyntylacyjnych i wstawiamy do licznika Beckmana. wynik przedstwaiamy w postaci indeksu stymulacji IS -(cpm-liczba impulsów stopień promieniowania) IS=cpm próby z mitogenem/cpm próby bez mitogenu (próba dodatnia to IS≥2).

II. Metoda spektrofotometryczna transformacji blastycznej limfocytów (MTT Test) – początkowa metodyka jest identyczna jak w metodzie izotopowej transformacji blastycznej limfocytów. Różnice zaczynają się w momencie, gdy zamiast H3-tymidyny dodajemy do hodowli 10ul roztworu MTT w stężeniu 10mg/ml PBS. Mieszaninę inkubujemy 2h w 37st.C. Płytki wirujemy przy 600-800 obr/min, wylewamy z płytki płyn i dodajemy DMSO w ilości 100ul. Płytki odczytujemy w spektrofotometrze przy filtrze 620nm. Do rzędów A i B(kolumny 1-10) dodajemy po 10 ul podłoża(a),do rzędów C-E(kolumny 1-10)po 10 ul Con A(b),do rzędów F-H(kolumny 1 -10) po 10 ul LPS(c). Do wszystkich dołków w kolumnach 1-10 dodajemy po 90 ul zawiesiny wyizolowanych limfocytów od pacjentów (pacjent 1- kolumna 1,pacjent 2 – kolumna 2 itd., na płytce max 10 prób). Kolumna 11 = próba „zero”,pozostaje pusta. Kolumna 12= kontrola – do każdego dołka po 100 ul samego podłoża, bez dodatku komórek. Inkubacja – 48 h w 37st.C Do wszystkich dołków w kolumnach 1-10 i 12 dodajemy po 20 ul MTT rozpuszczonego w podłożu(stężenie 7mg/ml). Inkubacja 37st.C przez 2h. Wirujemy płytkę 5 min przy 600-800obr/min i wylewamy zawartość dołków. Do wszystkich dołków dodajemy po 100 ul DMSO. Po 5 min odczytujemy na spektrofotometrze przy długości fali – 620nm. Wynik przedstawiamy w postaci indeksu Stymulacji(IS) (OD-gęstość optyczna roztworu):

IS=OD próby z mitogenem/OD próby bez mitogenu; próba dodatnia to IS≥2