GENETYKA DROBNOUSTROJÓW

Centralny dogmat:

Doświadczenie Griffith’a:

Doświadczenie z bakteriami Diplococcus pneumoniae; hipoteza: żywe dwoinki R uległy transformacji przez martwe dwoinki S, tak, że nabrały cech dwoinek S; Avery, MacLeod i McCarty udowodnili, że czynnikiem transformującym jest DNA.

Herhey i Chase wykazali, że DNA jest materiałem genetycznym przenoszącym informację.

Reguły Chargaff’a:

• Ilość A równa jest ilości T, a G równa C

• Stosunek sumy stężeń molowych A + T do sumy stężeń molowych C + G jest gatunkowo specyficzny (może być [A]+[T]=[C]+[G], [A]+[T]>[C]+[G], [A]+[T]<[C]+[G]).

Chromosom bakteryjny:

W chromosomie bakteryjnym można wyróżnić dwa poziomy organizacji: w skali makro i mikro. Chromosom bakteryjny składa się z kilkuset topologicznie niezależnych, superzwiniętych pętli (domen) przypominając swoim kształtem rozetę. Centralną część rozety stanowi rdzeń, który składa się z białek i prawdopodobnie również z RNA.
Za strukturę chromosomu w skali makro są odpowiedzialne DNAgyrazy, topoizomerazy, białka rdzenia oraz białka SMC (structural maintenance of chromosomes). DNAgyrazy wprowadzają lewoskrętne superzwinięcia w podwójnej, prawoskrętnej helisie DNA.
Topo I – usuwa skręt negatywny, topo IV – relaksuje DNA, rozkręca.
Sekwencja nukleotydowa chromosomu również prawdopodobnie determinuje jego strukturę – długie ciągi adeninowe promują tworzenie pętli chromosomu. Na strukturę w skali makro mają także wpływ procesy komórkowe – replikacja, segregacja.
Na lokalną strukturę DNA w skali mikro chromosomu mają wpływ przede wszystkim białka histonopodobne oraz białka uczestniczące w określonym procesie komórkowym związanym z danym, krótkim fragmentem chromosomu, np. transkrypcja genu.

Białka histonopodobne (E. coli):

*Białka zaginające DNA:
HU (heat-unstable nucleoid protein) – wiązanie nieswoiste
IHF (integration host factor) – wiązanie swoiste
Fis (factor for inversion stimulation) – wiązanie swoiste
*Białka kohezyjne – łączące nici DNA:
H-NS (histon-like nucleoid structuring protein) – wiązanie nieswoiste
Lrp – wiązanie swoiste
Dps (DNA binding protein from starved cells) – wiązanie nieswoiste

Chromosomy bakterii:

• koliste – większość

• liniowe – Borrelia, Streptomyces

• koliste i liniowe – Agrobacterium

Chromosom Streptomyces:

• część centralna silnie konserwowana (geny metabolizmu podstawowego)

• części brzegowe zróżnicowane (geny pomocnicze, dodatkowe)

• końce TIR (terminal inverted repeats, 100 kbp – 1 mbp)

Plazmidy:

Plazmidy koniugacyjne

Są cząsteczkami o wielkości ok. 30 kpz i o dużej liczbie genów, które tworzą połączenia w postaci mostków koniugacyjnych i umożliwiają przekazywanie DNA. Po wytworzeniu mostka koniugacyjnego, enzymy w nim występujące nacinają cząsteczkę DNA w miejscu określanym jako origin koniugacyjny (oriT, origin of transfer). Proces przekazywania DNA plazmidowego, polega na przyłączeniu jednego wolnego końca DNA do mostka koniugacyjnego i przekazaniu drugiego wolnego końca do cytoplazmy biorcy. Pojedyncze nici po stronie biorcy i dawcy zostają zreplikowane przez polimerazę DNA, następnie końce plazmidów zostają odłączone od mostka koniugacyjnego po czym następuje odtworzenie kolistej struktury plazmidów.

Plazmidy mobilizowalne

Plazmidy te nie mają zdolności do samoistnego przenoszenia informacji genetycznej, gdyż nie posiadają genów mogących tworzyć połączenia koniugacyjne. Posiadają za to geny kodujące białka przecinające plazmid w oriT. Po połączeniu swych właściwości z plazmidem koniugacyjnym mogą przenosić takie cechy jak: oporność na antybiotyki, produkowanie toksyn, kodowanie szlaków metabolicznych zdolnych do wykorzystywania np. cukru jako źródła węgla i energii.

IS i transpozony:

Insertion sequence – to krótka sekwencja DNA, która działa jak prosty ruchomy element genetyczny. Mają dwie główne cechy: są małe w stosunku do innych ruchomych elementów genetycznych (ok. 700 do 2500 bp), kodują tylko białka zaangażowane w aktywność transpozycyjną (ta cecha różni je od transpozonów, które zawierają również geny warunkujące inne cechy, np. oporność na antybiotyki). Te białka, to zazwyczaj transpozazy, które katalizują enzymatyczną reakcję pozwalającą IS poruszać się; a także białka regulacyjne, które stymulują lub hamują aktywność transpozycyjną. Rejon kodujący IS jest najczęściej flankowany odwróconymi sekwencjami.

Transpozon – to sekwencja DNA, która zmienia swoje położenie w genomie; czasami tworząc lub likwidując mutacje i zmieniając wielkość genomu. Są dwie klasy transpozonów: klasa I (retrotranspozony) – rozprzestrzeniają się wykorzystują przepisanie na RNA, a potem mechanizm odwrotnej transkrypcji i integracji powstałego DNA w inne miejsce genomu; klasa II – przemieszczają się w genomie poprzez wycinanie z pierwotnego położenia, a następnie wklejanie się w inne miejsce za pomocą transpozazy.
Zastosowania: Geny zawarte w transpozonie można zastąpić innymi i wykorzystać transpozon jako wydajny wektor; można również użyć go jako sondy molekularnej do lokalizowania sekwencji DNA.

IS911 zawiera:

• orfA – wiąże IR elements – inhibicja transpozycji;

• orfAB – transpozaza

• orfB – aktywacja transpozycji

Transpozycja − proces przemieszczania się transpozonu na inną pozycje w genomie tej samej komórki.

Horyzontalny transfer genów (HGT) – polega na stabilnym przeniesieniu informacji genetycznej z jednego organizmu do drugiego, gdzie przekazane geny ulegają utrwaleniu w genomie.
Trzy podstawowe rodzaje HGT:
*koniugacja – przekazywanie genów przez bezpośredni kontakt komórek, np. bakteryjnych;
*transformacja – pobieranie DNA przez bakterie ze środowiska, dzieli się na naturalną i sztuczną;
*transdukcja – przekazywanie genów przez bakteriofagi do komórki bakteryjnej

Koniugacja – to proces płciowy, umożliwiający wymianę i rekombinację materiału genetycznego. Warunkiem koniugacji jest obecność w komórce plazmidu (czynnika płciowego F (fertility factor)). Koniugacja zachodzi pomiędzy bakteriami posiadającymi plazmid F (F+) i bakteriami nie posiadającymi (F-). Replikacja plazmidu jest niezależna od replikacji podstawowego genomu bakteryjnego. Plazmid może występować w trzech formach:
*całkowicie samodzielna jednostka replikacji (F+), zawiera ok. 100 genów;
*plazmid posiadający fragment zawierający jeden lub kilka genów z podstawowego genomu, powstający podczas niedokładnego wyłączenia z chromosomu bakteryjnego (F’);
*plazmid zintegrowany w specyficznej lokalizacji z genomem podstawowym (Hfr (high frequency of recombination)).
Episom – plazmid, który posiada zdolność czasowego integrowania z genomem podstawowym.

Komórki posiadające czynnik F posiadają na swojej powierzchni długie białkowe twory – pili (najczęściej nie więcej niż 3). Geny do ich produkcji znajdują się na plazmidzie i jest ich ok. 20. Są zbudowane z białka piliny. Jeden pilus integruje z kilkoma białkami na komórce biorcy, co umożliwia otwarcie kanału dla transferu DNA. Proces koniugacji można podzielić na cztery przedziały: wytworzenie pary koniugacyjnej; replikacja koniugacyjna; transfer DNA; dojrzewanie.
Wytworzenie pary koniugacyjnej:
W momencie kontaktu z komórką biorcy pilus depolimeryzuje u podstawy i komórki zbliżają się do siebie i powstaje pomiędzy nimi kanał. Kiedy komórki są już wystarczająco blisko rozpoczyna się koniugacyjna replikacja DNA. Powstaje wtedy jednoniciowa liniowa kopia DNA, która przechodzi do komórki biorcy. Miejsce inicjacji replikacji koniugacyjnej (origin) znajduje się na czynniku F, dlatego pomiędzy koniugującymi bakteriami F+ i F- przenoszony jest tylko on. Kiedy czynnik F znajdzie się w komórce biorcy zachodzi synteza drugiej nici i cyrkularyzacja plazmidu. Następuje rozdzielenie komórek i już obydwie posiadają plazmidy F.

Zdarza się, że komórki bakterii mogą tracić czynnik F i ulegają rewersji do F-. Dzieje się tak dlatego, że replikacja plazmidu jest niezależna od replikacji genomu bakteryjnego i w trakcie podziału komórki może nie dojść do powielenia F lub nie trafia on do jednej z komórek potomnych.

Czynnik F ma zdolność integracji do genomu bakterii, a następnie może się z niego z powrotem odłączać. Liczba miejsc integracji jest ograniczona i charakteryzują się one homologią sekwencji DNA pomiędzy F a genomem. Po właczeniu plazmidu F do chromosomu bakteryjnego powstaje komórka Hfr. Przy podziale komórki bakteryjnej czynnik F zintegrowany z genomem podlega replikacji genomowej. Jednakże połączenie komórki Hfr z komórką F- poprzez pilus powoduje uruchomienie replikacji koniugacyjnej, która rozpoczyna się od origin na czynniku F. Powstaje jednoniciowa kopia całego genomu, która może być przeniesiona do komórki biorcy. Wraz z czynnikiem F przenoszone są również geny dawcy, które mogą rekombinować z genomem biorcy. W ten sposób komórka biorcy uzyskuje nowe cechy.

Zintegrowany czynnik F może wyłączyć się z genomu wraz z sąsiadującymi genami (nazywamy go wtedy F’), które w procesie koniugacji zostaną również przeniesione do komórek biorcy.

Transformacja:
Transformacja to przyjęcie przez komórkę bakteryjną cząsteczki DNA i włączenie jej poprzez rekombinację do bakteryjnego chromosomu. W transformacji naturalnej DNA pochodzi z komórki bakterii dawcy, praktycznie każda część genomu może zostać pobrana przez komórkę biorcy. Naturalna transformacja jest gatunkowo specyficzna lub ograniczona do bakterii blisko spokrewnionych, ponieważ rekombinacja wymaga homologicznych odcinków DNA.

W trakcie śmierci komórki bakteryjnej (lizy) DNA uwalniane jest do środowiska. Wtedy fragmenty kwasu nukleinowego mogą zostać pobrane przez bakterie kompetentne tj. posiadające zdolność transformacji. W przypadku niektórych gatunków bakterii transformacja jest ustalonym i ważnym mechanizmem wymiany informacji genetycznej.

Transdukcja:
Transdukcja jest to przeniesienie materiału genetycznego do komórki bakteryjnej z wykorzystaniem bakteriofaga.
Na przykładzie faga P1: Wielkość genomu P1 to 110 tysięcy par zasad. Ma on postać dwuniciowego, linowego DNA, jednakże replikuje w postaci kolistej. W czasie cyklu litycznego bakteriofaga P1 czasem dochodzi do przypadkowego upakowania fragmentów DNA bakteryjnego wraz z niekompletnym DNA fagowym w kapsyd. Powstają wtedy defektywne cząsteczki fagowe. Komórka bakteryjna będąca gospodarzem P1 ginie przy uwolnieniu bakteriofagów. Fagi defektywne posiadają pełen zestaw białek niezbędny do wstrzyknięcia DNA do komórki bakterii, jednak nie posiadają zestawu genów fagowych potrzebnych do wytworzenia nowych cząsteczek faga. Dzięki takim nielizogennym fagom może dojść do przeniesienia genów bakteryjnych z jednej komórki do drugiej. Większość P1 w lizacie to cząsteczki fagowe zdolne do indukcji pełnego cyklu litycznego. Dlatego, aby zwiększyć szanse na przeżycie rekombinantów musimy ograniczyć możliwość jednoczesnej infekcji komórki E. coli przez dwie lub więcej cząsteczek fagowych. W tym celu komórki infekujemy zawiesiną fagów o bardzo niskim mianie, nie przekraczającym jednej cząsteczki P1 na jedną komórkę E. coli. Jednocześnie możemy zastosować chemiczną inhibicję wiązania P1 z komórką bakteryjną, w tym celu możemy użyć cytrynianiu, który jako chelat wiąże jony wapnia niezbędne dla efektywnej adsorpcji fagów na komórkach. Innym sposobem może być użycie lizogennego mutanta P1, niezdolnego do pełnego cyklu litycznego bez pomocy fagów prawidłowych.

Plazmidy:

• samodzielne pozachromosomalne replikony;

• występują u bardzo wielu organizmów prokariotycznych oraz niektórych eukariontów;

• wielkość: od 1000 bp do 1,5 mbp;

• geny podstawowe (do replikacji);

• geny dodatkowe:
  * geny oporności na antybiotyki, metale ciężkie;
  * geny kodujące antybiotyki, toksyny;
  * geny płciowości;
  * geny systemu restrykcji i modyfikacji;
  * geny metabolizmu węglowodanów etc.;

• cechuje je zdolnosć do trwałego utrzymywania się (stable maintenance) w komórce i replikowania się w kontrolowany sposób;

Mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów:

• system miejscowo specyficznej rekombinacji – wspomaga jedynie losowy rozdział plazmidów;

• system aktywnego rozdziału (partycji) (active partition) – wspomagają fizyczny rozdział kopii plazmidów do komórek potomnych [inaczej zwane podziałem dimerów i multimerów];

• systemy post-segregacyjnego zabijania (addykcyjne) (plasmid addiction systems – PSK) – działają po podziale komórki, uzależniają komórkę gospodarza od występujących w niej plazmidów (addykcja); nazywane systemami post-segregacyjnego zabijania, systemami trucizna-odtrutka, systemami toksyna-antidotum; komórka tracąca plazmid ginie;
  system tworzą przynajmniej dwa geny plazmidowe, warunkujące powstawanie: *stabilnej trucizny (dłuższy okres półtrwania) i *nietrwałego antidotum (krótkie okresy półtrwania).

Plazmidy:

• ColE1 (6,4 kbp) – koduje oporność na kolicynę (bakteriocyna wytwarzana przez E. coli, antybiotyk bakteryjny o bardzo wąskim zakresie działania) [ColE1 is a plasmid found in bacteria. It carries a gene for colicin E1 (the cea gene). It also codes immunity from this product with the imm gene. In addition the plasmid has a series of mobility genes (mob).
  [Zawiera: oriV – origin replikacji; oriT – origin dla transferu koniugacyjnego; mob – mobilizacja (nukleaza); rom – kontrola liczby kopii – stabilizuje kompleks RNA I i RNA II uniemożliwiając degradację RNA; colE1 – colicin E1; imm – oporność na kolicynę.]

• R100 (100 kbp) – koduje oporność na antybiotyki i wiele substancji chemicznych (chloramfenikol, streptomycyna, sulfonamidy, jony rtęci, tetracyklina). Zawiera dwa duże rejony – fragment regulacyjny (zawiera geny warunkujące i regulujące proces replikacji i koniugacji (repA/oriV – replikacja; oriT – koniugacja); fragment oporności – zawiera geny warunkujące oporność (cat – chloramfenikol; str – streptomycyna; sul – sulfonamidy; mer – jony rtęci; tet – tetracyklina).

• R1 – this plasmid imparts multi-drug antibiotic resistance to its host bacteria.

It's known as a "low copy" plasmid, meaning that it exists in relatively few copies in any given bacteria. Because of its low copy nature, R1 must rely on "type II" segregation system to ensure that at least one copy is contained in each daughter cell after mitosis.

Some genes on the R1 plasmid are:

ParM is a prokaryotic actin homologue which provides the force to drive copies of the R1 plasmid to opposite ends of rod shaped bacteria before mitosis.

The Hok/sok system a postsegregational killing system of the plasmid.

CopA-like RNA, an antisense RNA involved in replication control of the plasmid.

Iterons are directly repeated DNA sequences which play an important role in regulation of plasmid copy number in bacterial cells. It is one among the three negative regulatory elements found in plasmids which control its copy number, the others being antisense RNAs and ctRNAs. Iterons complex with cognate (pokrewny) replication (Rep) initiator proteins to achieve the required regulatory effect.

Replikacja bakteryjna:

• jest semi-konserwatywna;

• enzymy:
  * helikazy – rozplatają nici DNA;
  * topoizomerazy – stabilizują odcinki jednoniciowe;
  * białka wiążące ssDNA – zapobiegają zwijaniu w podwójną nić;
  * prymaza DNA – syntetyzuje startery RNA;
  * ligaza DNA – łączy nowosyntetyzowane odcinki DNA;
  * polimerazy DNA:
  - polimeraza I – synteza nici opóźnionej, wypełnianie po starterach RNA;
  - polimeraza II – sprawdzanie i naprawa;
  - polimeraza III – synteza nici wiodącej;

• bakterie mają jedno miejsce inicjacji replikacji;

• widełki replikacyjne są niesymetryczne;

Kontrola replikacji bakteryjnej:

• miejsca inicjacji replikacji zawierają sekwencje DNA bogate w pary A-T;

• kontrola poprzez metylację DNA (u E. coli metylowana jest sekwencja GATC, która w miejscu inicjacji replikacji występuje 11 razy; pełna metylacja ori następuje po 10 min. od inicjacji replikacji; metylację katalizuje dam metylaza; metylacja jest drogowskazem naprawy post-replikacyjnej;

Metylacja u Procaryota

Podczas inicjacji replikacji metylacja umożliwia odróżnienie DNA zreplikowanego od niezreplikowanego. Inicjacja jest bezpośrednio sterowana metylacją w obrębie sekwencji oriC. Metylaza dam dołącza resztę metylową do adeniny w pozycji N-6 w sekwencji -GATC-, -CTAG-. W obszarze oriC jest aż 11 takich sekwencji. Przed replikacją sekwencje w obu niciach są zmetylowane. Podczas replikacji do nici potomnych włączane są niezmetylowane zasady, co powoduje, że wszystkie zasady w jednej nici są zmetylowane, a w drugiej nie. Inicjacja replikacji zostaje zahamowana do czasu wstawienia brakujących grup metylowych do DNA.
Jednocześnie możliwość rozróżnienia nici nowozsyntetyzowanej od nici macierzystej bezpośrednio po syntezie pozwala na poreplikacyjną naprawę przez wycinanie niewłaściwie sparowanych nukleotydów. Kompleks enzymów replikacyjnych rozpoznaje niezmetylowany łańcuch DNA i nacina go w dwóch miejscach: z jednej strony w obrębie zmetylowanej sekwencji GATC (CTAG), a z drugiej w sąsiedztwie niewłaściwie włączonej zasady. Następnie dochodzi do rozplecenia i usunięcia odcinka DNA przez helikazę II, a powstała luka zostaje komplementarnie wypełniona przez odpowiednią polimerazę.

Systemy restrykcji-modyfikacji

Podstawową funkcją restrykcyjnych endonukleaz i metylotransferaz jest ochrona genomu gospodarza przed obcym DNA wnikającym do komórki. Enzymy te rozpoznają specyficzne sekwencje DNA, co umożliwia im precyzyjne działanie. Systemy restrykcyjno-modyfikacyjne poza nielicznymi wyjątkami obejmują dwie aktywności enzymatyczne: endonukleolityczną i modyfikacyjną (metylującą). W ich skład wchodzi również regulatorowe białko C. Endonukleazy hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w obrębie specyficznej sekwencji niezmetylowanego DNA lub w ich sąsiedztwie (a degradacja jest kontynuowana przez egzonukleazy). Metylotransferazy modyfikują je przez przyłączenie do reszty adeniny lub cytozyny grupy metylowej (jako źródło reszty metylowej wykorzystują S-adenozylometioninę (SAM)), chroniąc w ten sposób DNA gospodarza przed restrykcją. Systemy R-M są specyficzne gatunkowo i sub-gatunkowo.

Typy systemów R-M:

• typ I – rozpoznaje specyficzną sekwencję, ale przecina DNA w odległości 1000 – 5000 bp od niej (wymaga SAM, Mg2+, ATP); dwufunkcyjny kompleks; trzy podjednostki (R, M, S; rywalizacja między R i M);

• typ II – rozpoznaje sekwencję DNA i tnie wewnątrz niej lub w pobliżu (wymaga Mg2+); oddzielne enzymy (R i M działają oddzielnie);

• typ III – rozpoznaje sekwencję DNA i tnie w pobliżu (wymaga Mg2+, ATP); dwufunkcyjny kompleks, dwie podjednostki (R i M działają symultanicznie lub rywalizują)

Fenotyp mutatorowy – to mutacje, które pozwalają przetrwać w zmiennym, a w szczególności we wrogim środowisku. Mutacje, które pozwalają na szybką adaptację i są jedną ze strategii umożliwiających przetrwanie gatunku.

Naprawa DNA bezpośrednia

Polega na prostym odwróceniu powstałej zmiany z udziałem odpowiednich enzymów. Typy naprawianych uszkodzeń: 

• Pęknięcia nici DNA - ligaza DNA naprawia przerwane wiązania fosfodiestrowe. Reakcja ta zwana ligacją polega na połączeniu wolnych końców z wykorzystaniem energii zgromadzonej w ATP. 

• Uszkodzenie alkilacyjne DNA - metylacja lub etylacja zasad i grup fosforanowych. Reszta metylowa usuwana jest przez metylotransferazy. Białko MGMT po usunięciu grupy metylowej przenosi ją na własną cysteinę (Cys145) i ulega bezpowrotnej inaktywacji. Jest to zatem system kosztowny, zmuszający komórkę do ciągłej syntezy enzymu w dużych ilościach. 

• Fotoreaktywacja – naprawianie fotodimerów pirymidyn powstałych pod wpływem działania promieniowania UV. Katalizowana przez fotoliazę reakcja zależna jest od energii pozyskiwanej z absorpcji światła o długości fali 300–500 nm. 

Rys. 1. Napawa pęknięcia w nici DNA 

Naprawa DNA pośrednia

BER (ang. base excision repair) – koryguje niewielkie uszkodzenia poprzez wycinanie i naprawianie pojedynczych zasad, które uległy modyfikacjom chemicznym (np. alkilacji, deaminacji). Proces ten zachodzi etapowo: 
• Odpowiednia glikozydaza DNA przecina wiązanie β-N-glikozydowe, a następnie usuwa uszkodzoną zasadę tworząc miejsce AP (apurynowe lub apirymidynowe). 
• Endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i przecina wiązanie fosfodiestrowe w kierunku 5’ od powstałego uszkodzenia. W ten sposób powstają wolne końce 3’- OH. 
• Wiąże się do nich polimeraza DNA I, która następnie wypełnia lukę nową nicią syntetyzowaną na martycy DNA. U różnych organizmów w procesie tym biorą udział różne rodzaje polimerazy. 
• Na koniec ligaza DNA łączy obie nici i syntetyzuje ostatnie wiązanie fosfodiestrowe. 

Niektóre glikozydazy wykazują dodatkową aktywność nukleolityczną. Nacinają one łańcuch po stronie 3’ miejsca AP i tworzą jednonukleotydową lukę w DNA. 

Rys. 2. Naprawa typu BER 

NER (ang. nucleotide excision repair) – poprzez wycinanie uszkodzonych nukleotydów usuwa duże uszkodzenia DNA zniekształcające strukturę podwójnej helisy. Wycinany odcinek może być różnej długości. 
• Białka XPA i XPC rozpoznają uszkodzenie. 
• Endonukleazy XPG i XPF nacinają nić DNA po obu stronach powstałego błędu. 
• Helikazy XPB i XPD rozplatają podwójną helisę w sąsiedztwie uszkodzonego nukleotydu, a następnie uwalniają fragment zawierający zmianę. 
• Usunięty odcinek uzupełniany jest dzięki aktywności enzymu polimerazy DNA. 
• Ligazy łączą ze sobą obie nici. 

Rys. 3. Naprawa typu NER 

Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów
Niekomplementarne nukleotydy rozpoznawane są przez odpowiednie białka (Mut-S, Mut- H i Mut- L u Procaryota, białka kodowane przez geny hMLH i hMSH2 u Eucaryota). Identyfikacja nowo zsyntetyzowanej nici możliwa jest dzięki metylacji oraz nieobecności połączeń między tworzącymi ją fragmentami Okazaki. Helikaza rozplata podwójną helisę, a egzonukleoaza degraduje oznaczoną nić. Jej fragment wraz z niedopasowanym nukleotydem jest usuwany i odbudowywany przez odpowiednią polimerazę DNA. Ligaza odtwarza wiązania fosfodiestrowe. 

Naprawa rekombinacyjna – pozwala na naprawę uszkodzeń występujących w obu niciach (ang. double-strand breaks, DSBs). Jest ona wyjątkowo niebezpieczna dla genomu ze względu na brak matrycy umożliwiającej odtworzenie zmienionego fragmentu. 

• Łączenie niehomologicznych końców (ang. non-homologous end joining, NHEJ) - system wykorzystywany do naprawy przerw w przypadku braku homologicznych sekwencji mogących posłużyć do odtworzenia ciągłości nici. Wieloskładnikowy kompleks białkowy kieruje ligazę na miejsce pęknięcia. W jego skład wchodzą: białko Ku, kinaza białkowa DNA-PKCS, białko XRCC4. Mechanizm ten nie jest dokładny, gdyż w uszkodzonym rejonie powstaje kilkunukleotydowa delecja. 

Rys. 4. Naprawa poprzez łączenie niehomologicznych końców

• Rekombinacja homologiczna – polega na naprawie uszkodzonego chromosomu z wykorzystaniem siostrzanej chromatydy lub chromosomu homologicznego jako wzoru. Prowadzi do powstania jednej prawidłowej cząsteczki DNA i jednaj cząsteczki mającej dwa uszkodzone miejsca. 

Naprawa indukowana, czyli system SOS (ang. save our souls) - ostateczna odpowiedź komórki bakteryjnej na rozległe uszkodzenia DNA. Jest ona regulowana przez wiele operonów i uruchamiana w przypadku pojawienia się jednoniciowego DNA (ssDNA), oligonukleotydów lub wolnych trójfosforanów nukleotydów świadczących o zahamowaniu replikacji. System SOS jest mutagenny. Obniża wierność replikacji DNA i pozostawia błędy w sekwencji nukleotydów. 
Najważniejszymi regulatorami systemu SOS są białko RecA (aktywator operonów SOS) i LexA (represor wszystkich operonów SOS). 
Gdy w komórce nie ma uszkodzeń DNA lub są one na tyle małe, że mogą być naprawione przez inne systemy, cząsteczki białka LexA wiążą się z promotorami operonów SOS hamując ekspresję genów. Łączą się także z promotorem genu RecA. Gdy w komórce pojawią się poważniejsze uszkodzenia, sygnał wysyłany przez ssDNA i ATP powoduje zmianę konformacji białka RecA, które stymuluje autoporteolizę białka LexA i indukcję systemu SOS. W momencie, gdy sygnał o uszkodzeniu DNA zanika, RecA powraca do nieaktywnej konformacji, która nie powoduje już autoprotolizy LexA. 

Rys. 5. Indukcja systemu SOS przez uszkodzone DNA 

Operony, to jednostki tranksrypcyjne występujące u organizmów prokariotycznych w skład których wchodzi kilka genów kodujących zazwyczaj białka powiązane ze sobą funkcjonalnie. Dzięki obecności operonów możliwa jest regulacja ekspresji genów bakteryjnych, która pozwala mikroorganizmom odpowiadać na zmiany warunków zewnętrznych np. brak lub obecność substancji odżywczych. Operony możemy podzielić na indukowane i hamowane. Operony indukowane inaczej kataboliczne zawierają geny kodujące enzymy zaangażowane w procesach katabolicznych, ich ekspresja kontrolowana jest poprzez substrat. Produkcja enzymu następuje wyłącznie wtedy, gdy substrat jest obecny w środowisku. Przykładem operonu indukowanego jest operon laktozowy. Drugą grupę operonów stanowią operony hamowane (anaboliczne) kodujące głównie geny szlaków biosyntetycznych. Ekspresja tych genów jest kontrolowana przez produkt końcowy szlaku metabolicznego. Produkt ten może hamować ekspresję operonu lub też ją kontrolować poprzez atenuację. Przykładem tego rodzaju operonu anabolicznego jest operon tryptofanowy zawierający geny kodujące enzymy niezbędne w procesie syntezy tryptofanu. 

Operon laktozowy

Operon laktozowy składa się z trzech leżących liniowo obok siebie genów kodujących enzymy zaangażowane w proces przyswajania laktozy przez bakterie Escherichia coli.
Są to gen lac Z kodujący β-galaktozydazę, enzym hydrolizujący laktozę do glukozy i galaktozy, gen lac Y dla permeazy laktozowej - białka błonowego zaangażowanego w transport β-galaktozydów ze środowiska do wnętrza komórki oraz gen lac A kodujący transacetylazę β-galaktozydazową biorącą również udział w hydrolizie tego disacharydu. Geny te znajdują się w operonie pod jednym promotorem i są wspólnie transkrybowane, dając jedną cząsteczkę mRNA. W sąsiedztwie genów struktury znajduje się gen lac I kodujący represor zaangażowany w regulację ekspresji genów operonu laktozowego. W podstawowym modelu regulacji operonu laktozowego represor laktozowy spełniał rolę czynnika blokującego, który wiąże się z sekwencją DNA zwaną operatorem znajdującą się pomiędzy promotorem a początkiem genu lac Z i uniemożliwia polimerazie RNA dostęp do promotora. Dlatego w sytuacji braku laktozy transkrypcja trzech genów operonu jest zahamowana. W momencie pojawienia się w środowisku źródła laktozy bakteria może pobrać kilka jej cząsteczek i rozszczepić na glukozę i galaktozę. Produktem pośrednim w tej reakcji jest allolaktoza - izomer laktozy, który indukuje ekspresję operonu laktozowego poprzez połączenie się z represorem laktozowym. Allolaktoza wiążąc się z represorem zmienia jego konformację w taki sposób, że nie może on być dłużej związany z operatorem. Dzięki temu polimeraza RNA może związać się z promotorem i rozpocząć transkrypcję operonu. W warunkach pełnej indukcji w komórce znajduję się ok. 5000 cząsteczek każdego z białek. Po wyczerpaniu źródła laktozy, gdy brakuje allolaktozy, represor ponownie przyłącza się do operatora i wyłącza operon. Operon laktozowy podobnie jak inne operony kataboliczne podlegają równocześnie regulacji pozytywnej inegatywnej. Regulacja negatywna polega na przyłączeniu represora do operatora uniemożliwiając w ten sposób wiązanie polimerazy RNA i zachodzenie transkrypcji. W regulacji pozytywnej zwanej represją kataboliczną główną rolę odgrywa białko CAP będące aktywatorem katabolicznym. Białko to w obecności cAMP wiąże się z sekwencją DNA powyżej promotora, zwiększając w ten sposób powinowactwo polimerazy RNA do promotora a tym samym zwiększając aktywność transkrypcyjną operonu laktozowego. Mechanizm ten pozwala operonowi laktozowemu reagować na obecność glukozy w podłożu, która jest źródłem energii preferowanym przez komórkę. Dlatego też, jeśli zarówno glukoza jak i laktoza są obecne w otoczeniu komórki, poziom transkrypcji operonu laktozowego jest niski. 

Rys.1 Operon laktozowy

Operon tryptofanowy

Operon tryptofanowy składa się z 5 genów strukturalnych; trp E, trp D, trp C, trp B i trp A kodujących enzymy - syntetaza antranilowa, syntetaza indologlicerofosforanu, syntetaza tryptofanowa, zaangażowane w proces biosyntezy tryptofanu. Geny te, podobnie jak w operonie laktozowym posiadają jeden wspólny promotor i ulegają transkrypcji w postaci jednej cząsteczki RNA. Regulacja operonu tryptofanowego opiera się na systemie represor-operator podobnie jak w operonie laktozowym. Represja operonu zachodzi w obecności cząsteczki regulatorowej - tryptofanu, która jest produktem szlaku biochemicznego katalizowanego przez enzymy kodowane przez ten operon. Gdy tryptofan jest dostępny w otoczeniu komórki, operon jest wyłączony, ponieważ kompleks represor-tryptofan wiąże się do sekwencji operatora trp, uniemożliwiając w ten sposób związanie się polimerazy RNA z promotorem trp. W momencie braku tryptofanu, który działa jak korepresor, wspólnie z represorem blokując swoją syntezę. Represor nie może związać się z operatorem i zachodzi ekspresja operonu. Dodatkowo operon tryptofanowy zaopatrzony jest w dodatkowy mechanizm regulujący transkrypcję zwany atenuacją. Mechanizm ten opiera się na przedwczesnej terminacji transkrypcji, dzięki czemu pozwala na dostosowanie niektórych procesów biosyntezy do potrzeb komórki. 

Rys.2 Operon tryptofanowy

Regulon – grupa operonów pozostająca pod kontrolą jednego białka, kodowanego przez specjalny gen regulatorowy.

Procesy syntezy i dojrzewania mRNA u organizmów prokariotycznych i eukariotycznych znacznie różnią się od siebie. 
Podstawową różnicą pomiędzy mRNA bakteryjnym a eukariotycznym, jest to, że mRNA bakterii w zasadzie nie podlega dojrzewaniu – nie zawiera intronów. Pierwotny transkrypt syntetyzowany przez polimerazę RNA jest od razu dojrzałym mRNA i jeszcze przed zakończeniem transkrypcji rozpoczyna się translacja. mRNA jest syntetyzowany na matrycy DNA. Rybonukleotydy są dodawane do końca 3’ transkryptu RNA na zasadzie komplementarnego łączenia zasad. W czasie procesu elongacji łańcucha mRNA tworzy się pęcherzyk transkrypcyjny, wewnątrz którego znajduje się hybryda DNA-RNA. Pęcherzyk przesuwa się po matrycy i uwalniany jest transkrypt. Zakończenie transkrypcji może przebiegać z udziałem samodzielnych terminatorów lub białka Rho. mRNA bakteryjny jest policistronowy, co oznacza że zawiera informacje dotyczące budowy wielu różnych białek.
W odróżnieniu od organizmów prokariotycznych wszystkie eukariotyczne mRNA mają czapeczkę przyłączoną na końcu 5’, większość z nich jest poliadenylowana przez dodanie serii adenozyn do końca 3’, wiele transkryptów zawiera introny i podlega procesowi składania, a niektóre są poddawane redagowaniu. Tworzenie się czapeczki to wieloetapowy proces, który rozpoczyna się w niedługim czasie po zajściu efektywnej inicjacji i oddaleniu się polimerazy od promotora. Pierwszym etapem tego procesu jest dodanie guanozyny do końca 5’ RNA. W drugim etapie następuje przekształcenie końcowej guanozyny w 7-metyloguanozynę. Czapeczka może być istotna dla eksportu mRNA z jądra, ale jej podstawową rolą jest udział w procesie inicjacji translacji. Proces elongacji łańcucha u eukariotów jest znacznie dłuższy, co jest spowodowane obecnością intronów oraz występowaniem nukleosomów. Praktycznie wszystkie eukariotyczne mRNA mają serię do 250 adenozyn na końcach 3’. Nukleotydy te nie są zakodowane w DNA, ale dodawane do transkryptu przez polimerazę RNA niezależną od matrycy zwaną polimerazą poli(A). Najczęściej poliadenylacja stanowi nieodłączną część procesu terminacji transkrypcji. Rola „ogona” poli(A) nie jest do końca znana. Zakłada się, że może mieć on wpływ na stabilność RNA oraz pełnić funkcje w inicjacji translacji. Powstały pre-mRNA u eukariotów podlega procesowi dojrzewania, który polega wycinaniu intronów. Eukariotyczny pre-mRNA może zawierać ponad 100 intronów, stanowiących znaczną część transkryptu. Muszą one zostać wycięte, a eksony połączone w odpowiedni sposób, aby transkrypt mógł funkcjonować jako dojrzały mRNA.

Genom fagów:

• geny wczesne – ekspresja natychmiast po wniknięciu do bakterii; kodują białka niezbędne do replikacji fagowego genomu;

• geny późne – kodują specyficzne białka fagowe;

• jednoniciowy, kolisty DNA (M13, Φ174);

• dwuniciowy, liniowy DNA (λ, T4);

• RNA (MS2)

Czym różni się cykl lityczny wirusa od cyklu lizogenicznego?

W cyklu litycznym wirus po połączeniu z genomem bakteryjnym namnaża się, odbudowuje swoją otoczkę białkową (kapsyd) i niszczy komórkę bakteryjną. Dochodzi wtedy do lizy, czyli rozpadu komórki bakteryjnej. W takim cyklu wirus powoduje śmierć swojego gospodarza.
W cyklu lizogenicznym, po wniknięciu do bakterii, DNA wirusa łączy się z jej genomem, z którym jest on powielany i przekazywany kolejnym pokoleniom (może być przekazywany komórkom potomnym przez wiele pokoleń, nie przejawiając szkodliwego działania).

Cykl lityczny bakteriofagów

• Etap adsorpcji – wirus styka się z powierzchnią atakowanej komórki.

• Etap wnikania (penetracji) – wirion wnika do komórki gospodarza ( wyjątek stanowią bakteriofagi, które wprowadzają do komórki jedynie swój kwas nukleinowy).

• Etap replikacji – kwas nukleinowy wirusa przejmuje kontrolę nad metabolizmem zainfekowanej komórki, powielane są części składowe nowych wirionów ( kwas nukleinowy i białka kapsydu).

• Etap składania (dojrzewania) – powstawanie nowych wirionów poprzez połączenie kwasu nukleinowego i kapsydu.

• Etap uwolnienia (elucji) – powstałe wiriony opuszczają komórkę, towarzyszy temu jej zniszczenie (liza).

Bakteriofag ΦX174 – jednoniciowy, kolisty DNA, zachodzący kod genetyczny, wykorzystuje trzy ramki odczytu.

Bakteriofag M13 – jednoniciowy, kolisty DNA; infekuje tylko bakterie F+; uwalnia się z komórki bez lizy; białko wirionów polimeryzuje wokół ssDNA w trakcie przechodzenia faga przez błonę komórkową.

Bakteriofag MS2 – jednoniciowy RNA; infekuje tylko bakterie F+.

Bakteriofag T4 – dwuniciowy, liniowy DNA.

Bakteriofag lambda – dwuniciowy, liniowy DNA; często integruje z genomem gospodarza.

Bakteriofag P1 – dwuniciowy, liniowy DNA; rzadko integruje z genomem gospodarza.