Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych
Wykonanie:
Celem ćwiczenia jest zapoznanie praktyczne z metodyką oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych na podstawie pomiaru przyrostu redukcyjności mieszaniny reakcyjnej oraz na podstawie zmiany zabarwienia skrobi z jodem.
Metody wykorzystujące przyrost redukcyjności w mieszaninie redukcyjnej:
Otrzymany w kolbie miarowej na 10ml wyciąg z trzustki wieprzowej uzupełniamy 0,9% NaCl i mieszamy. Do 3 czystych probówek pobieramy po 0,3 ml 1% roztworu skrobi i wstawiamy na 5 minut do łaźni wodnej o temp. 37°C. Po 5 minutach do 2 probówek dodajemy po 0,2 ml wyciągu enzymu z kolby na 10 ml (próby właściwe) i przeprowadzamy reakcję hydrolizy skrobi w ciągu 15 minut w 37°C. Następnie do wszystkich 3 probówek dodajemy po 1,5 ml roztworu heksacyjanożelazianu (III) potasu, a do trzeciej probówki zawierającej substrat dodatkowo 0,2 ml enzymu (próba materiałowa). Do czystej probówki dodajemy 0,5 ml wody destylowanej oraz 1,5 ml roztworu heksacyjanożelazianu (III) potasu (próba odczynnikowa). Po dokładnym wymieszaniu wszystkie 4 probówki wstawiamy do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewamy 10 minut. Po tym czasie chłodzimy do temperatury pokojowej. Po schłodzeniu do każdej probówki pobieramy po 10 ml wody destylowanej i dobrze mieszamy. Dokonujemy odczytu w spektrofotometrze przy długości fali 420 nm.
Reakcja skrobi z jodem. Metoda Sandstedta, Kneena i Bliska.
Do 3 czystych probówek pobieramy po 1 ml 1% roztworu skrobi, wstawiamy na 5 min do łaźni wodnej o temp 37°C, następnie do dwu z nich dodajemy po 1 ml roztworu enzymu z kolbki na 10 ml (próby właściwe), a do trzeciej 1 ml wody (próba materiałowa). Inkubujemy przez 15 minut. Po tym czasie przerywamy reakcję dodając 5ml 0,5 M kwasu solnego. Następnie pobieramy po 0,25 ml mieszaniny i dodajemy do 5ml roztworu jodu. Po dokładnym wymieszaniu dokonujemy odczytu dla długości fali 670 nm.
Wyniki i obliczenia:
Część A:
Próba pełna 1 |
Próba pełna 2 |
Średnia absorbancja |
Próba materiałowa |
Próba odczynnikowa |
0,773 |
0,820 |
0,7965 |
1,291 |
1,371 |
Próba odczynnikowa - Próba materiałowa:
1,371 - 1,291 = 0,08
Próba odczynnikowa - Próba pełna
1,371 - 0,7965 = 0,5745
Próba pełna - (Próba odczynnikowa - Próba materiałowa):
0,5745 - 0,08 = 0,495
Ilość maltozy odczytana dla absorbancji równej 0,495 z krzywej wzorcowej: 612μg
w 0,2 ml próby - 612 μg maltozy
10 ml - x
x = 30 600 μg = 30,6 μg
0,2 ml - 30,6 mg
1000 ml - y
y = 153 g
153 g maltozy / 342 g/mol = 0,447 mola = 447 mmola
447 mmola / 15 min = 29, 825 mmol/min
29,825 mmola / min*g trzustki = 29,825 mmola uwolnionej maltozy / min * g trzustki
Część B:
Próba materiałowa: 0,583
Próba pełna: 0,337
Różnica: 0,246
0,583 - 10 mg skrobi
0,246 - x
x = 4,22 mg rozłożonej skrobi
czyli:
1 ml - 4,22 mg
10 ml - 42,2 mg rozłożonej skrobi
0,2 ml wyciągu z trzustki - 42,2 mg
1000 ml - y
y = 211 g
211g / 15 min = 14,067 g skrobi/min
14,067 g /min * g trzustki = 14, 067 g rozłożonej skrobi / min*g trzustki
1