TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

EKSPRESJA

1. porozmawiamy o NRs na podstawie publikacji “One big family”

2. różnica między transformantami a rekombinantami

3. jak stwierdzić obecność posiadanie transformantów

4. jak stwierdzić posiadanie rekombinantów

5. jak stwierdzić posiadanie rekombinantów z poprawnie (w poprawnej orientacji) wklonowanym insertem

6. zastanowić sie nad odczynnikimi stosowanymi podczas zajęć

NRs:

Ligandy dla receptorów jądrowych:

-ogółem substancje lipofilowe

-hormony steroidowe

-kwasy tłuszczowe

-hormony tyroidowe

-wit. D3

-proglastyny

receptory sieroce - nie posiadają specyficznego ligandu

3 domeny: NTD (N-terminal domain) DBD (DNA binding domain) i LBD (ligand binding domain)

a) NTD - regulacja transkrypcji; posiada sekwencję AF1 - ważna przy transaktywacji
i oddziaływań białko - białko

-brak stabilnej struktury

b) DBD - znajduje się w środku cząsteczki białka i zawiera dziewięć zachowawczych reszt cysteinowych. Domena ta jest odpowiedzialna za wiązanie się receptora do swoistej sekwencji nukleotydowej. PALEC CYNKOWY: 8 reszt Cys bierze udział w wiązaniu jonów Zn2+: pierwsze 4 wiążą jeden jon, a drugie 4 drugi jon. Jony Zn2+ stabilizują strukturę domeny; jeżeli ich nie ma, to domena nie przyjmuje właściwej dla siebie konformacji.

Rejon wiążący Zn2+ w receptorze steriodowym rozpoczyna się helisą alfa na końcu pierwszej domeny palca cynkowego. Jeśli receptor jest związany z DNA to helisa ta leży w dużym rowku DNA i oddziałuje ze swoistą sekwencją nukleotydową.

ERE - elementy odpowiedzi na estrogeny - receptor estrogenu przyłącza się do DNA jako dimer.

c) LBD - domena położona bliżej końca karboksylowego.

- zbudowana głównie z helis alfa

- ligand wiąże się w hydrofobowej kieszeni, między helisami

-bierze udział w procesie dimeryzacji cząsteczek receptora

Przyłączenie liganda prowadzi do rearanżacji strukturalnych - ostatnia helisa alfa (12),która:

- posiada reszty hydrofobowe po jednej stronie helisy i wystaje na zewnątrz receptora w formie niezwiązanej z ligandem

- przemieszcza się do powierzchniowej bruzdy znajdującej się u boku receptora w formie związanej z ligandem

Koaktywatory: zawierają motyw L-X-X-L-L.

Jak odróżnić transformanty od rekombinantów?

-PCR/ odpowiednie startery, elektroforeza

-insercyjna inaktywacja

-selekcja biało-niebieska

-trawienie enzymami restrykcyjnymi

Transfekcja- proces wprowadzenia obcego DNA lub RNA do komórki.

• chemiczna

  • transfekcja kompleksami DNA z fosforanem wapnia

  • lipofekcja − transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA

• elektroporacja − transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku elektrycznego w roztworze zawierającym kwas nukleinowy. Szok elektryczny powoduje przejściowe utworzenie w błonie komórkowej mikroporów, przez które może się dostać DNA lub RNA.

• pocisk genowy − transfekcja balistyczna − wstrzeliwanie do wnętrza komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA

• mikroiniekcja – roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.

Transdukcja- proces wprowadzenia nowego genu do komórki przez wirusa.

Zastosowanie praktyczne do wprowadzania genów do komórek. Do transdukcji komórek bakteryjnych najczęściej używa się wektorów opartych na fagu lambda

A ja przed chwilą zobaczyłam w dżin klouning end dienej analajzys, że transdukcja, to przyjęcie DNA fagowego, w taki sam sposób jak na skutek transformacji.

Transduction is the process by which DNA is transferred from one bacterium to another by a virus.

Transformacja- wprowadzenie do komórki obcego materiału genetycznego (DNA), zwłaszcza niewielkiej jego porcji, obejmującej jeden do kilku genów.

Zmodyfikowana w ten sposób komórka oraz - w przypadku organizmów wielokomórkowych - zregenerowany z niej organizm nosi nazwę transformanta.

Gen wprowadzony na zasadzie transformacji do komórki-biorcy zwany jest ogólnie transgenem. Transformant i jego potomstwo dziedziczące transgeny nazywa się organizmami transgenicznymi albo zgodnie z przyjętym obyczajem, choć nie całkiem zgodnie z logiką, organizmami genetycznie zmodyfikowanymi, czyli GMO.

na wykładzie: “przeniesienie rekombinowanej cząsteczki DNA do kom. bakteryjnej”