Techniki histologiczne
Mikroskopy świetlne
I. Zasady powstawania obrazu w mikroskopie świetlnym.
1.Zespół optyczny mikroskopu świetlnego.
- źródło światła (żarówka) wbudowane jest w podstawę mikroskopu. Posiada
regulowaną jaskrawość świecenia i wyposażone jest w przesłonę,
- kondensor to zespół soczewek skupiających wiązkę promieni świetlnych w
celu oświetlenia pola widzenia w preparacie. Apertura numeryczna
kondensora powinna być zgodna z aperturą numeryczną obiektywu,
- obiektyw jest jednym z dwóch elementów tworzenia obrazu powiększonego.
Jest to układ soczewek niwelujących wady optyczne pojedynczej soczewki:
aberrację sferyczną i chromatyczną:
a) aberracja sferyczna powodowana jest tym, iż poszczególne strefy soczewki
różnią się ogniskowymi co powoduje nieostrość obrazu,
b) aberracja chromatyczna wywołana jest tym, iż współczynnik załamania
światła soczewki zmienia się w zależności od długości przechodzącej fali
świetlnej; efektem tego jest rozszczepienie przechodzącego światła i
pojawienie się barwnych obwódek wokół konturów obrazu,
- pośrednie układy optyczne położone są pomiędzy obiektywem a okularem.
Są to zwierciadła załamujące promienie świetlne pod określonym kątem bądź
układy pryzmatów lub półprzepuszczalnych luster,
- okular jest to układ soczewek działający na zasadzie lupy, za pomocą
którego oglądamy obraz mikroskopowy.
2. Obraz mikroskopowy jest pozorny, powiększony i odwrócony.
3. Powiększenie całkowite mikroskopu obliczamy mnożąc powiększenie
obiektywu przez powiększenie okularu i pośredniego układu optycznego.
ll. Mikroskop kontrastowo-fazowy.
1. Fala świetlna posiada trzy parametry fizyczne: długość, amplitudę oraz fazę.
Dwa pierwsze rejestrowane są przez siatkówkę oka człowieka natomiast faza
nie. W obrębie kondensora mikroskopu kontrastowo-fazowego znajduje się
pierścieniowata przesłona przekształcająca strumień świetlny w wiązkę
promieni o kształcie pustego stożka. Tak uformowana wiązka światła
przechodzi przez preparat, który działa jak siatka dyfrakcyjna: część promieni
ulega ugięciu, reszta przechodzi prostoliniowo. Struktury preparatu powodują
zróżnicowane ugięcie promieni i przesunięcie ich fazy. Obiektyw mikroskopu
zawiera układ optyczny, który powoduje opóźnienie lub przyspieszenie fazy
promieni biegnących prostoliniowo. W płaszczyźnie obrazu dochodzi do
interferencji obu typów promieni. Struktury obecne w preparacie i powodujące różnego stopnia przesunięcie fazy fal świetlnych dostrzegane są w postaci
skontrastowanej, czyli jako pola jaśniejsze i ciemniejsze.
2. Mikroskop kontrastowo-fazowy stosowany jest do badania komórek nie
zabarwionych, żywych oraz do wzmocnienia kontrastu w preparatach
zabarwionych słabo lub wybiórczo.
lll. Mikroskop fluorescencyjny.
1. Fluorescencja jest to zdolność niektórych substancji do emitowania światła
widzialnego pod wpływem naświetlania promieniami ultrafioletowymi (UV).
Własność tę posiadają niektóre substancje obecne w komórkach (Iipofuscyny,
porfiryny, witamina A) jak też specjalne barwniki, tzw. fluorochromy.
2. Obraz uzyskiwany w mikroskopie jest negatywem obrazu uzyskiwanego w
typowym mikroskopie świetlnym - na ciemnym tle widoczne są świecące
(fluoryzujące) struktury komórkowe i tkankowe.
lV. Współogniskowy (konfokalny) skaningowy mikroskop świetlny.
1.W mikroskopie świetlnym obraz uzyskiwany jest jedynie z określonej
głębokości preparatu. Obraz ten jest zaburzony przez promienie dochodzące
do obiektywu z warstw położonych powyżej i poniżej. Mikroskop konfokalny
przepuszcza promienie świetlne wyłącznie z płaszczyzny formowania obrazu,
eliminując światło pochodzące z leżących poza nią warstw preparatu.
2. Źródłem światła w mikroskopie konfokalnym jest laser. Pochodzący z niego
wąski promień jest skupiony na płaszczyźnie obrazu w postaci wąskiej plamki
o średnicy 0,1 mikrometra. Plamka ta przesuwa się z dużą szybkością
oświetlając kolejne obszary preparatu - nazywamy to skanowaniem obrazu.
Mikroskopia elektronowa
l. Przygotowanie materiału.
1. Utrwalanie materiału; najczęściej utrwalaczem jest aldehyd glutarowy o
stężeniu od 0,5% do 6% rozpuszczony w buforze kakodylowym o pH 7,2 - 7,4.
2. Zapewnienie odpowiedniej osmolarności utrwalacza do osmolarności
utrwalanej tkanki.
3. Temperatura utrwalania w granicach 1-4°C; warunkuje łagodne i płynne
utrwalanie.
4. Nadmiar utrwalacza wypłukuje się buforem kakodylowym.
5. Osmowanie (utrwalanie wtórne) materiału poprzez zanurzenie wycinka
materiału w 0,5 - 2,5% czterotlenku osmu na okres 1-2 godzin. Czterotlenek
osmu jest jednocześnie utrwalaczem i „barwnikiem", czyli środkiem
kontrastującym.
6. Odwadnianie materiału w roztworach alkoholi o wzrastających stężeniach.
7. zatapianie materiału w substancjach o bardzo wysokiej twardości; żywice
epoksydowe lub akrylowe.
ll. Zasady optyki elektronowej
- do wytworzenia obrazu w ME służy strumień elektronów wytwarzany w
warunkach wysokiej próżni,
- uzyskiwane powiększenia w zakresie od 1000 do 500 000 razy,
- strumień elektronów przechodzi przez system „soczewek"
elektromagnetycznych wokół których wytwarza się silne pole magnetyczne,
które ugina strumień elektronów skupiając go
- powstający w mikroskopie obraz jest odtworzony na ekranie
luminescencyjnym, emitującym światło widzialne,
- rozpędzone elektrony zderzają się z atomami preparatu wywołując:
a) przejście części elektronów przez preparat prostoliniowe (elektrony
pierwotne nie rozproszone),
b) część elektronów przechodząc zmienia swój tor (elektrony rozproszone),
c) część elektronów odbija się od próbki (e. pierwotne wstecznie
rozproszone),
d) z orbit atomów próbki wybijane są elektrony, które biegną w kierunku
przeciwnym (e. wtórne),
- elektrony pierwotnie nie rozproszone i rozproszone wykorzystywane są w
mikroskopie transmisyjnym,
- elektrony wstecznie rozproszone i wtórne wykorzystywane są w mikroskopie
skaningowym.
Ill. Mikroskop elektronowy transmisyjny.
1. Jest odpowiednikiem mikroskopu świetlnego; strumień elektronów
przechodzi przez preparat analogicznie do strumienia świetlnego w
mikroskopie świetlnym.
2. W wykontrastowanym preparacie (osmem) rejony wykontrastowane
powodują rozproszenie elektronów - miejsca ciemne a rejony niewykontrastowane swobodnie przepuszczają elektrony - miejsca jasne.
IV. Mikroskop elektronowy skaningowy (SEM).
1. Mikroskop ten służy do badania zróżnicowanych przestrzennie powierzchni
próbek i pozawala na uzyskanie ich plastycznego, prawie trójwymiarowego
obrazu o bardzo dużej ostrości.
2. Strumień elektronów skupiany jest w postać wąskiej wiązki, która punktowo
pada na powierzchnię próbki pokrytej złotem lub platyną; metale te nie
przepuszczają elektronów. Pomiędzy obiektywem a próbką znajduje się
układ elektromagnetyczny - deflektor. Deflektor stele zmienia kierunek
biegu wiązki elektronów skanując powierzchnie próbki.
Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym l
(technika parafinowa; barwienie hematoksylina i eozyna)
pobranie materiału,
utrwalenie - chemiczne,
odwodnienie w szeregu alkoholowym 50%,70%,80%, 90%, 100%,
płyny pośrednie - ksylen, benzen, toluen,
zatapianie w parafinie i formowanie bloczków,
krojenie skrawków- mikrotom rotacyjny lub mikrotom saneczkowy,
naklejanie na szkiełko podstawowe,
płyny pośrednie - ksylen, benzen, toluen,
nawadnianie w szeregu alkoholowym 50%,70%,80%, 90%, 100%,
płukanie w wodzie destylowanej,
barwienie hematoksyliną,
płukanie w wodzie bieżącej,
barwienie w eozynie,
płukanie w wodzie destylowanej,
odwodnienie w szeregu alkoholowym 50%,70%,80%, 90%, 100%,
płyny pośrednie - ksylen 3-5x,
zamknięcie pod szkiełkiem nakrywkowym np. w balsamie kanadyjskim,
wysuszenie w cieplarce próżniowej.
Zalety i ograniczenia techniki parafinowej.
Zalety:
powszechnie stosowana w badaniach diagnostycznych,
możliwość pozyskania skrawków cienkich,
możliwość uzyskania skrawków seryjnych,
stosunkowo krótki czas całej procedury (1-3 dni),
niski koszt pojedynczego preparatu.
Wady:
wysoka temperatura zatapiania w parafinie (50-60°C),
konieczność używania rozpuszczalników organicznych (alkohol, ksylen),
kruszenie się i rozwarstwianie skrawków przy materiałach twardych lub o niejednorodnej strukturze,
znaczne ograniczenia przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni.
Cele utrwalania:
natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, przede wszystkim przez denaturację enzymów,
związanie i wytracenie (precypitację) niektórych zawartych w tkankach substancji, co zapobiega ich późniejszej dyfuzji,
wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych w dalszych etapach procedury,
niekiedy poprawę optycznego zróżnicowania tkanek poprzez wywołanie w niej reakcji chemicznych ułatwiających późniejsze barwienie.
Cechy dobrego utrwalacza:
szybko przenika w głąb tkanek,
powoduje szybką stabilizację struktur wewnątrzkomórkowych, głównie poprze denaturację białek,
nie niszczy struktur wewnątrzkomórkowych,
jest izotoniczny w stosunku do płynu tkankowego,
jest mało toksyczny dla otoczenia.
Metody utrwalania:
utrwalanie immersyjne,
utrwalanie perfuzyjne,
utrwalanie przy użyciu mikrofal.
Utrwalacze chemiczne:
Proste (jednoskładnikowe):
- aldehydy - formaldehyd (4-10%), glutaraldehyd (1,5%-6%),
- alkohole - etylowy, metylowy, terpineol (50-100%),
- ketony - aceton (50-100%),
- związki metali ciężkich - czterotlenek osmu (0,5-2,0 %).
Złożone (wieloskładnikowe):
- utrwalacz Bouina - kwas pikrynowy i formalina,
- utrwalacz Carnoya - etanol, kwas octowy, chloroform,
- utrwalacz Zenkera - sublimat, dwuchromian potasu, kwas octowy, siarczan sodu.
Barwienie l
A. Przygotowanie skrawków do barwienia - w histologii są używane przede wszystkim wodne roztwory barwników, rzadziej alkoholowe.
B. Barwienie barwnikami kwaśnymi i zasadowymi:
struktury o charakterze zasadowym (kwasochłonne) np. białka cytoplazmatyczne, włókna kolagenowe barwią się barwnikami kwaśnymi np. eozyną, oranżem G,
struktury o charakterze kwaśnym (zasadochłonne) np. jądro komórkowe barwią się barwnikami zasadowymi np. hematoksylina, błękitem metylowy.
C. Impregnacja związkami metali:
sole srebra impregnują niektóre ziarna wydzielnicze, włókna retikulinowe
sole złota impregnują niektóre komórki nerwowe i glejowe,
związki osmu łączą się z lipidami zawartymi np. w osłonkach mielinowych.
D. Bejcowanie.
Barwienie dwuetapowe:
Substancja chemiczna zmieniająca właściwości wiązań chemicznych w tkankach (nie dająca odczynu barwnego).
Barwnik wybarwiający struktury komórkowe.
E. Różnicowanie:
barwienie progresywne - przerywamy barwienie w momencie uzyskania pożądanej barwy,
barwienie regresywne - tkankę przebarwiamy a następnie barwnik odpłukujemy
odpowiednim roztworem odbarwiającym do uzyskania właściwego nasilenia kolorów.
Barwienie II
barwienie polichromatyczne - polega na barwieniu mieszaniną barwników zasadowych i kwaśnych np. May-Grunwald Giemza (barwienie stosowane w hematologii). Efekt barwienia jest wypadkową działania wszystkich barwników zawartych w mieszaninie.
barwienie przyżyciowe - polega na wprowadzeniu barwnika do żywego organizmu lub komórki. Stosowane w tych metodach barwniki np.czerwień obojętna, błękit metylenowv, błękit toluidyny, zieleń Janusowa lub tusz chiński wykazują znikome właściwości toksyczne.
zjawisko metachromazji - polega na tym, że struktury wybarwiają się na inny kolor niż barwa użytego barwnika. Ziarna komórek tucznych po barwieniu błękitem toluidyny (niebieski) wybarwiają się na kolor różowo-fioletowy. Zjawisko to jest związane z powstawaniem, podczas barwienia dimerów cząsteczek barwnika, które absorbują inną długość widma światłą widzialnego.