CYKLINY,UBIKWITYNA,APOPTOZA

ROLA CYKLIN I KINAZ ZALEŻNYCH OD CYKLIN

Kluczowymi cząsteczkami regulatorowymi cyklu komórkowego są 2 grupy cząsteczek: -cykliny -kinazy zależne od cyklin.

Cykliny nie mają aktywności enzymatycznej, ale po przyłączeniu do kinaz cyklu komórkowego, mogą uzyskać aktywność enzymatyczną. Stąd kinazy układu kontroli cyklu komórkowego nazywane są kinazami białkowymi zależnymi od cyklin (Cdk). Nazwa cyklin przeciwnie do Cdk sugeruje ich cykliczne zmiany stężenia podczas cyklu komórkowego. Różne geny kodujące Cdk i cykliny są bardzo konserwatywne. Początkowo zmodyfikowano je u drożdży piekarniczych( nadano tym genom nieoficjalną nazwę cdc).

Cykliny i Cdk formują razem aktywny heterodimer, w obrębie którego cykliny tworzą jednostkę regulatorową, a Cdk pełnią rolę katalityczną. Cdk po związaniu się z cyklinami ulegają aktywacji, w wyniku której zdolne są do prowadzenia reakcji fosforylacji białek docelowych. Zaktywowane kinazy przenoszą grupy P-fosforanowe z ATP na odpowiednią resztę aminokwasową białka docelowego. W stanie nieaktywnym miejsce aktywne białek Cdk jest sferycznie zasłonięte, tzw. „pętla T”. Związanie cykliny z Cdk odciąga pętlę T i odsłania związaną cząsteczkę ATP, umożliwiając jej kontakt z białkiem. Do pełniej aktywności Cdk potrzebne jest jeszcze jedno białko- kinaza aktywująca Cdk, która fosforyluje Tre w pętli T, a to umożliwia dalsze wiązanie i fosforylację białek docelowych. Inhibitory Cdk nazywane CKI regulują aktywność kinazy poprzez wiązanie się z centrum aktywnym enzymu, co utrudnia dostęp do ATP.

2.2.CYKLINY

Tworzą kilka grup cyklin:A,B oraz, C,D i E. W czasie cyklu komórkowego cykliny A,C, D i E są syntetyzowane de novo i ich stężenie w komórce rośnie w miarę upływu cyklu. Cyklina B syntetyzowana jest w fazie G2. Maksymalne stężenie cyklin jest w metafazie/anafazie mitozy, po czym ulega ono obniżeniu, na skutek trawienia ich przez proteazy.
Aktywacja kinaz zachodzi w 2 krytycznych przedziałach czasowych(punktach kontrolnych) cyklu komórkowego: -pod koniec fazy G2 co prowadzi do przejścia do fazy M, czyli zapoczątkowania mitozy - w końcowej fazie G1 co prowadzi do przejścia do fazy S, czyli do zapoczątkowania syntezy DNA.

Każdy rodzaj kompleksu cyklina-Cdk fosforyluje różne białka docelowe.

Stężenie różnych typów cyklin: -okresowo zwiększa się, po czym maleje na skutek degradacji na drodze ubiktywinacji, w określonym czasie cyklu komórkowego. -wzrost stężenia każdego typu cykliny wspomaga aktywację odpowiadającej jej kinazy Cdk, zaś nagły jej spadek przywraca Cdk do stanu nieaktywnego. -Powolne gromadzenie się cyklin, aż do poziomu krytycznego, jest jedną z metod pomiaru odstępów czasu miedzy kolejnymi etapami cyklu komórkowego.

2.3.PRZEJŚCIE Z PÓŹNEJ FAZY G2 DO FAZY M Dokonuje się przez aktywację kinazy fazy M znanej jako czynnik wywołujący dojrzewanie (MPF). Jest ona heterodimerem białkowym składającym się z białka o masie 34 kDa i białka o masie 45 kDa(cyklina). W kompleksie tym białko p34 jest kinazą fosforylującą reszty Ser i Tre wielu białek, a kompleks cyklina-białko p34, nadaje aktywnemu kompleksowi powinowactwo do odpowiedniego substratu, czyli białka które ma być ufosforylowane.

2.4.KINAZA FAZY M Powstaje w fazie G2 w wyniku utworzenia kompleksu białko p34-cyklina B(kinaza MPF). Kinaza MPF fosforyluje wiele kluczowych białek, zmieniając ich właściwości, np.: -rozpad otoczki jądrowej poprzez fosforylację i demontaż biegnących pod otoczką jądrową filamentów laminy. -fosforyluje białka towarzyszące mikrotubulom, co zmienia ich właściwości na zdolne do tworzenia wrzeciona podziałowego. -fosforyluje również histon H1, co powoduje kondensację chromosomów.

Aktywne kompleksy cyklina-Cdk fazy S fosforylują, tzw. kompleksy prereplikacyjne, przyłączające się w fazie G1 do sekwencji DNA, od których rozpoczyna się replikacja. Fosforylacja ta ma dwa cele: uaktywnić już przyłączone do DNA kompleksy prereplikacyjne oraz zapobiec tworzeniu nowych kompleksów. Działanie takie zapewnia, że każda część genomu komórki ulegnie replikacji tylko jeden raz.

Kluczowym kompleksem aktywowanym w czasie tego procesu jest ligaza ubikwityny, zwana kompleksem sprzyjającym w anafazie (APC), która kieruje degradację białek strukturalnych chromosomalnego kinetochoru. APC wyznacza również cykliny mitotyczne, które mogą ulec degradacji, zapewniając postęp telofazy i cytokinezy.

2.5.UBIKWITYNA Białko obojętne o tworzy 2 typy połączeń z innymi białkami: -odwracalne- w modyfikacjach postranslacyjnych -selektywne, nieodwracalne połączone z destrukcją.

DEGRADACJA BIAŁEK ZALEŻNA OD UBIKWITYNY Sygnałem proteolizy jest przyłączenie ubikwityny przez glicynę na C-końcu, do grupy –NH2 lizyny białka przeznaczonego do proteolizy. Reguła N-końca mówi, że: Rodzaj aminokwasu na N- końcu białka jest sygnałem kontrolującym aktywność enzymów proteolitycznych, np. Arg, Lys, Phe, Leu, Trp powodowały bardzo szybką degradację beta-galaktozydazy ( u bakterii i drożdży). Ubikwityna wstępnie jest aktywowana przez 3 różne enzymy: E1, E2, E3.

AKTYWACJA UBIKWITYNY 1.Aktywacja ubikwityny i przyłączenie jej do białka E1- terminalną grupą COOH UB. Tworzy się wiązanie tioestrowe z gr. SH enzymu E1 w reakcji kierowanej przez ATP. 2.Reakcja przeniesienia tioestru zaktywowanej ubikwityny na enzym E2 3. Enzym E3 katalizuje transfer ubikwityny na aminową grupę Lys docelowego białka. E3 jest ligazą (izopeptydazą) która rozpoznaje proleolityczne substraty.
Schemat budowy proteasomu(centrum degradacji białek)

Ubiktywina + białko (koniugat) aminokwas

Proteasom- jest to białkowy wielkocząsteczkowy agregat enzymatyczny o masie cząsteczkowej ok. 2 MDa utworzony z białek (kilku rodzajów proteaz) tworzących kształt cylindra. W proteasomie zachodzi degradacja białek „oznakowanych” ubikwityną.

Aktywne kompleksy cyklina-Cdk są motorem napędowym przebiegu cyklu komórkowego. Cyklina D jest pierwszą cykliną wytwarzaną w przebiegu cyklu w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe (np. czynniki wzrostu). Wiąże się ona z Cdk4 (kinazą) tworząc aktywny kompleks cyklina D-Cdk4, który z kolei fosforyluje białko RB. Ufosforylowane białko RB opuszcza kompleks, który był związany z genem E2F zapobiegając jego transkrypcji. Rozpad kompleksu E2F/DP1/RB powoduje aktywację enzymu E2F, co skutkuje transkrypcja różnych genów : cykliny E, cykliny A, polimerazy DNA, kinazy tymidynowej i innych. Utworzona cyklina E wiąże się z kolejną kinazą Cdk2, tworząc kompleks cyklina E-Cdk2. To powoduje przejście komórki z gazy G1 do fazy S. Cyklina A razem z Cdk2 tworzy kompleks cyklina A- Cdk2, który inicjuje przejście z fazy G2 do M. Aktywacja kompleksu cyklina B-Cdk1 powoduje rozpad błony jądrowej oraz rozpoczęcie profazy, a następnie jego inaktywacje- wyjście komórki z mitozy.

3.KONTROLA CYKLU KOMÓRKOWEGO

Cykl komórkowy obejmuje: replikację DNA, podział jądra komórkowego i cytoplazmy, interfazę. Prawidłowy przebieg cyklu w komórce zapewnia złożony układ kontroli. Układ ten w odpowiednim czasie uaktywnia enzymy i inne białka uczestniczące w kolejnych etapach cyklu, a po ich zakończeniu składniki te dezaktywuje.

3.1.REGULACJA FAZY S

Zachodzi poprzez kontrolę przechodzenia komórki z fazy G1 do S oraz zakończenia syntezy DNA. Białko p34 w fazie G1łaczy się kolejno z cyklinami D, A, E dając kompleks kinazy podobny do kinazy fazy M, nazywany kinazą fazy S. Aktywność tej kinazy prowadzi komórki przez punkt startowy = restrykcyjny ( w późnej gazie G1). Półokres trwania fazy G1 wynosi zaledwie 15 minut, co odpowiada klasie białek niestabilnych(białek U), które znane są od dawna i których nagromadzenie w komórce jest warunkiem przejścia z fazy G1 do S.

Uszkodzenie DNA powoduje zwiększenie stężenia i aktywności białka regulatorowego genów, nazwanego białkiem- p53.Zaktywowane białko- p53 zwiększa transkrypcję genu kodującego białkowy inhibitor Cdk, nazywanego p21. To zwiększa stężenie białka p21, które wiąże się z kompleksami cyklina-Cdk fazy S, odpowiedzialnymi za wprowadzenie komórki do fazy S i blokuje ich działanie.

Zatrzymanie cyklu w fazie G1 naje komórce czas na naprawienie uszkodzonego DNA przed replikacją. Gdy brak jest białka p53 albo jest nieaktywne, zachodzi nieorganiczna replikacja uszkodzonego DNA, co zwiększa częstość mutacji i możliwości pojawienia się komórek nowotworowych. Mutacje genu p53, które pozwalają dzielić się komórkom z uszkodzonym DNA, stanowią ważny element w rozwoju większości nowotworów u człowieka.

Komórki mogą również całkowicie przerwać cykl przez zdemontowanie układu kontroli, np. u człowieka komórki nerwowe i mięśni szkieletowych muszą przetrwać przez całe życie organizmu bez podziałów, wchodzą wtedy w fazę G0
APOPTOZA

Apoptoza reguluje także liczbę komórek. Programowa śmierć komórki zachodzi z udziałem śródkomórkowej kaskady proteaz. Komórki, które giną przez nekrozę (martwicę), uwalniając swoją zawartość do otoczenia komórek sąsiednich, wywołują stan zapalny. Komórki zwierzęce podlegające programowej śmierci- apoptozie kurczą się, oddzielają się od komórek w tkance, ich cytoszkielet podlega zniszczeniu, otoczka jądrowa rozpada się a jądrowe DNA ulega fragmentacji; błona komórkowa wpukla się do wewnątrz, odcinając fragmenty cytoplazmy – ciałka apoptotyczne, zawierające organelle i podzielony, skondensowany DNA jądrowy. Ciałka te są następnie fagocytowane przez sąsiednie komórki albo przez makrofagi, w efekcie czego zawartość komórki nie uwalnia się do otoczenia.