POLITECHNIKA POZNAŃSKA

WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ

Inżynieria chemiczna i procesowa

Inżynieria bioprocesów i biomateriałów 2014/2015

PROJEKT Z PRZEDMIOTU PODSTAWY BIOINŻYNIERII MEDYCZNEJ

Wytwarzanie osteoindukcyjnych bioorganicznych materiałów biozastępczych na bazie kości zwierzęcej

2. Wstęp

   1. Angiogenetyczna rekonstrukcja kości oraz czynniki odpowiedzialne za osteoindukcję

Gojenie kości obejmuje 2 zachodzące jednocześnie procesy resorpcję (degradacja) oraz odbudowę (osteogeneza) w zależności od przewagi jednego z tych procesów ostatecznie dochodzi do powstania nowej tkanki kostnej albo jej zaniku. W procesie angiogenetycznej rekonstrukcji kości bierze udział wiele czynników wzrostu, do podstawowych możemy zaliczyć VEGF (Vascular Enothelial Growth Factor), którego zadaniem jest pobudzenie angioblastów do podziałów i różnicowania w komórki śródbłonka, co powoduje powstawanie i wrastanie nowych naczyń do tworzącej się tkanki kostnej oraz dostarczanie jej niezbędnych do dalszego wzrostu składników. Innymi ważnymi czynnikami w tym procesie są TGF-beta (Transforming Growth Factor Beta) i białka morfogenetyczne kości BMP (Bone Morphogenetich Proteins), które działają na powstające z fibroblastów osteoblasty. Warunkują wytwarzanie kolagenowej matrycy pozakomórkowej kości. Ponadto ważną rolę w procesie odbudowy kości pełnią białka osteokalcyna, osteopontyna, zasadowa fosfotaza i sialoproteina kostna, które zapewniaja odpowiednie zmineralizowanie matrycy kostnej (1). Czynniki te uważa się za czynniki warunkujące osteoindukcję. Na szczególną uwagę zasługują białka morfogenetyczne kości, które są uważane za podstawowy czynniki odpowiedzialny za zapoczątkowanie procesu osteoindukcji. Białka morfogenetyczne kości są wyodrębnioną grupą glikoprotein zaliczanych do polipeptydowych czynników wzrostu, wywołują przekształcanie się komórek mezenchymy do osteoblastów, komórek odpowiedzialnych za kościotworzenie. Zastosowanie przy wszczepianiu materiałów in vivo znalazły tylko 2 spośród 20 zidentyfikowanych BMP- BMP-2 i BMP-7. Za czynniki odpowiedzialne za osteoindukcję można również uznać insulinopodobne czynniki wzrostu-I (Insuline-like Growth Factor- IGF-I), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (Platelet-derived Growth Factor-PDGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (Vascular Endothelial Growth Factor- VEGF) (1).

Podstawowe mechanizmy nowotworzenia kości za pomocą wszczepionych materiałów. Podział materiałów kościozastepczych.

Preparaty kościozastępcze ułatwiają tworzenie się nowej kości na kilka sposobów:

• Osteogeneza – dostarczanie wraz z materiałem kościozastepczym komórek zdolnych do wytworzenia nowej tkanki;

• Osteokondukcja – zapewnienie mineralnego, nieaktywnego rusztowania dla wzrostu nowej kości;

• Osteoindukcja – dostarczenie czynnika wywołującego różnicowanie komórek mezenchymalnych do osteoblastów, a co za tym idzie odbudowę kości. (2)

Ze względu na pochodzenie preparatu kościozastępczego wyróżnić można materiały autogeniczne, allogeniczne i ksenogeniczne.

Najkorzystniejszym z wyżej wymienionych przeszczepów jest przeszczep autogeniczny, gdzie dawcą i biorcą jest ta sama osoba. Zastosowanie materiału autogenicznego minimalizuje ryzyko przeniesienia chorób zakaźnych oraz wystąpienia reakcji immunologicznej. Wada jest jednak bardzo ograniczona ilość materiału, jaki można wykorzystać do implantacji. Przeszczepu autogenny wiąże się również z wysokim ryzykiem powikłań, takich jak: infekcja, powstanie krwiaka, uszkodzenia nerwów, wystąpienie przewlekłych pooperacyjnych dolegliwości bólowych w miejscu pobrania, a także częstych zniekształceń pooperacyjnych miejsca dawczego. Pod tym względem korzystniejsze jest stosowanie preparatów allogenicznych, pochodzących od innego osobnika tego samego gatunku. Istnieje jednak zagrożenie immunogenności takiego preparatu lub przeniesienia chorób zakaźnych.

Trzecią grupą materiałów kościozastepczych są preparaty ksenogeniczne, pochodzące od dawcy będącego przedstawicielem innego gatunku niż biorca. Przeszczepy obcogatunkowe zapewniają odpowiednia ilość materiału, jednak niosą ze sobą ryzyko przeniesienia chorób odzwierzęcych oraz, wyższe niż w przypadku przeszczepów allogenicznych, zagrożenie wystąpienia reakcji immunologicznej. (1)

Warunki prawidłowej regeneracji kości. Cechy idealnego substytutu.

Aby regeneracja kości po przeszczepie przebiegła prawidłowo, konieczne jest oddziaływanie czterech elementów:

• Komórek osteogennych (osteoblastów lub komórek macierzystych);

• Sygnałów osteoindukcyjnych przekazywanych przez czynniki wzrostu

• Macierzy osteokondukcyjnej

• Zaopatrzenia w krew i składniki odżywcze

Najlepiej warunki te spełnione są w przypadku przeszczepów autogennych, odznaczających się dobrymi właściwościami osteogennymi, osteoindukcyjnymi i osteokondukcyjnymi.

Aby regeneracja kości po implantacji przebiegała prawidłowo, konieczne jest czterech podstawowych elementów – osteogenności, osteoindukcji, osteojkondukcji oraz dostarczenie krwi i składników odżywczych. Najlepiej warunki te spełnione są w przypadku przeszczepów autogenicznych.

Oprócz wyżej wymienionych, preparaty kościozastępcze powinny odznaczać się takimi cechami jak biokompatybilność, bioresorbowalność (przy czym materiał powinien być resorbowany w sposób kontrolowany) i wytrzymałość mechaniczna. Muszą także poddawać się sterylizacji oraz łatwemu i długiemu przechowywaniu, ich wytwarzanie nie może być kosztowne, a użycie kliniczne zbyt skomplikowane. (3)

Etapy regeneracji tkanki kostnej

Proces regeneracji tkanki kostnej składa się z kilku następujących po sobie etapów. Przeszczepiona, demi­neralizowana macierz kostna poprzez przyłą­czanie fibronektyny z osocza staje się miej­scem wiązania dla okolicznych komórek me­zenchymalnych. Zawarte i uwalniane z ma­cierzy czynniki morfogenetyczne pełnią czyn­ność chemotaktyczną i mitogenną, powodując w trzecim dniu od przeszczepienia wzmożoną proliferację komórek mezenchymalnych.

Około 5 dnia można już obserwować pro­ces różnicowania się chondroblastów, który osiąga apogeum około 7-8 dnia. Następnie hipertroficzna tkanka chrzęstna zaczyna ulegać mineralizacji. Dochodzi wówczas do angio­genezy i wnikania okolicznych naczyń. Około 10-11 dnia obserwuje się najbardziej wzmo­żony proces różnicowania i proliferacji oste­oblastów oraz zastępowania tkanki chrzęstnej kością. Powstała tkanka kostna ma początko­wo charakter kości splotowatej, pozbawionej tradycyjnej dla tkanki struktury. Z czasem jest ona przebudowywana i zastępowana tradycyj­ną dojrzałą tkanką o charakterystycznej budo­wie, złożonej z systemów Haversa. (1)

Przegląd preparatów handlowych o właściwościach osteoindukcyjnych

Preparaty o właściwościach osteoindukcyjnych możemy podzielić na dwie główne grupy: przeszczepy allogeniczne oraz preparaty zawierające zrekombinowane białka morfogenetyczne kości (BMP- ang. Bone Morphogenetic Proteins), których głównym zadaniem jest przekształcanie komórek mezenchymy do osteoblastów, komórek odpowiedzialnych za kościotworzenie, występujących w miejscach wzrostu lub przebudowy tkanki kostnej (4). Tylko 2 spośród 20 zidentyfikowanych białek morfogenetycznych kości znalazły zastosowanie wśród komercyjnych preparatów handlowych- BMP-2 i BMP-7. Do preparatów handlowych zawierających BMP zalicza się OP-1®Putty/Implant i INFUSE®Bone Graft. Natomiast wśród preparatów allogenicznych możemy wyróżnić: Accell®, DBX®, Osteocel®plus, PROGENIX®Family, GRAFTON®Family, MAGNIFUSE®Family, XPANSE®Bone Insert. Skład komercyjnych preparatów allogenicznych opiera się głównie na demineralizowanej macierzy kostnej (DBM- ang. demineralized bone matrix), w której wzmożona aktywność biologiczna białek kości jest odpowiedzialna za osteoindukcyjne właściwości. Preparaty te ze względu na dużo łatwiejszą produkcję oraz aplikację zdominowały rynek światowy.

Firma Integra® w swoim katalogu proponuje preparat Integra®Accell Connexus® Demineralized. Charakteryzuje się on zróżnicowanym składem, ponieważ oprócz cząsteczkowej i rozproszonej formy DBM zawiera ABM- Accell Bone Matrix (4). Jako nośnik macierzy wykorzystano poloksamer. W temperaturze pokojowej preparat posiada postać plastyczną oraz umożliwiającą formowanie w dowolny kształt, natomiast w temperaturze ciała staje się bardziej lepki i uniemożliwia migrację przeszczepu. Występuje w postaci specjalnie przygotowanych (sterylizowanych) strzykawkach. Znalazł zastosowanie w chirurgii kręgosłupa. Wyróżnia się spośród innych preparatów wzbogaceniem w ABM- Accell Bone Matrix (5). Stosowanie samej demineralizowanej macierzy kostnej skutkuje wydłużeniem czasu, potrzebnym do zapoczątkowania procesu indukcji. Dodatkowo obecność ABM ułatwia przeszczepowi dostęp do naturalnie występujących białek kości. ABM jest strukturalnie otwartą, rozproszoną formą DBM, umożliwiającą łatwy dostęp białek kości, tworząc środowisko sprzyjające procesowi kościotworzenia. Połączenie obu tych macierzy umożliwia trwały i natychmiastowym dostępem białek ważnych dla procesu osteogenezy (6).

Preparat ten wytwarzany jest na bazie kości króliczej w sposób objęty patentem. Cząsteczkowa forma DBM jest mineralizowana przy użyciu kwasu chlorowodorowego (0,5M), natomiast rozproszona forma DBM jest otrzymywana przez dalsze traktowanie kwasem cytrynowym (3M). Etap ten jest połączony z jednoczesnym mieszaniem, celem którego jest zakłócenie gęstej organizacji macierzy. Uzyskaną dyspersję neutralizuje się przez diafiltrację oraz liofilizuje przed połączeniem z nośnikiem i cząsteczkową formą DBM (4).

Inną popularną marką preparatów o właściwościach osteoindukcyjnych opartych o przeszczepy allogeniczne jest GRAFTON® FAMILY. Marka ta w swoim katalogu proponuje bardzo popularne materiały o właściwościach osteoindukcyjnych, do których m.in. należą Grafton® DBM i Grafton® DBM PLUS. Zawierają one demineralizowaną ludzką tkankę kostną połączoną z zdemineralizowaną macierzą kostną (DBM) (7). Firma proponuje różnorodne formy aplikacyjne, obejmujące m.in. żele, kity, pasty oraz proszki. Preparaty te są plastyczne i mogą być formowane oraz cięte w różne kształty i rozmiary co ułatwia proces aplikacji. Przeznaczone są głównie jako wypełniacze przeszczepów kostnych, jako substytuty kości, jako wypełniacze pustych przestrzeni w kościach oraz do uzupełniania ubytków szczękowo-twarzowych (8).

W tych preparatach baza kostna jest pozyskiwana od martwych dawców, następnie oczyszczana 70% alkoholem i sterylizowana w celu wyeliminowania potencjalnego źródła wirusów oraz bakterii związkami powierzchniowoczynnymi oraz ultradźwiękami. Demineralizacja tkanki kostnej jest prowadzona przy zastosowaniu D-MINI®- ........................ Zdemineralizowaną tkankę kostną łączy się z nośnikiem, którym w Grafton ® DBM jest bezwodna gliceryna, natomiast w Grafton ® DBM PLUS wykorzystano skrobię (7;8).

Preparatem, zawierającym zrekombinowane białka morfogenetyczne jest INFUSE^® Bone Graft, który jest mieszaniną, zwierającą rekombinowane ludzkie białka morfogenetyczne kości-2 połączone z przyswajalnym nośnikiem kolagenowym (9). Nośnik ten jest kolagenem typu I, pochodzenia bydlęcego, który z solami wapnia i fosforanem stanowi budulec kości, w 95% jest twórcą macierzy kostnej. W tym preparacie kolagen stanowi tylko nośnik, nie pełni funkcji rusztowania. Przeznaczony głównie do urazów kręgosłupa (choroba zwyrodnieniowa dysków) oraz w mniejszym stopniu w stomatologii (10).

Innym preparatem handlowym, bazującym na zrekombinowanych białka morfogenetycznych jest OP-1® Putty/Implant. Składa się on z rekombinowanego białka osteogennego (BMP-7) oraz macierzy kolagenowej, pochodzącej od bydła. Wzbogacony jest w dodatek soli karboksymetylocelulozy (CMC). Przed użyciem OP-1® Putty musi zostać rozpuszczony w roztworze soli fizjologicznej (0,9%). Przeznaczony dla osób ze zmianami zwyrodnieniowymi stawów tylnej kolumny kręgosłupa w odcinku lędźwiowym (11;12).

Demineralizowana macierz kostna

Demineralizowana macierz kostna (ang. Demineralized Bone Matrix – DBM) jest to osteoindukcyjny biomateriał, używany do wypełniania ubytków kostnych. Jak wskazuje nazwa jest to materiał pozbawiony części mineralnej, co odbywa się na drodze ekstrakcji kwasem. Demineralizowana macierz kostna zachowuje składniki białkowe, przy małej zawartości substancji stałych na bazie wapnia, fosforanów nieorganicznych i śladowych ilości resztek komórkowych.

Wiele składników zawartych w DBM (np. czynniki wzrostu) posiada silne właściwości osteogenne. Zawiera ona również ulegająca degradacji macierz ułatwiająca endogenne uwalnianie tych związków w miejscu ubytku, co indukuje tworzenie się nowej kości i przyspiesza gojenie.

Ze względu na dostępność i łatwość w stosowaniu, demineralizowana macierz kostna jest jednym z najatrakcyjniejszych środków stosowanych w procesach leczenia ubytków kostnych. (13)

Nośniki demineralizowanej macierzy kostnej

Ponieważ czysty DBM otrzymuje się w postaci drobnego proszku należy umieścić go w nośniku ułatwiającym jego aplikacje i formowanie.

Najpopularniejsza formą wprowadzania DBM do ubytku jest plastyczny kit aplikowany za pomocą strzykawki. Otrzymywany jest poprzez wytworzenie zawiesiny cząstek demineralizowanej macierzy kostnej w nośniku. Nośnikami mogą być rozpuszczalne w wodzie polimery (np. hialuronian sodu, karboksymetyloceluloza) a także bezwodne rozpuszczalniki mieszające się z wodą (np. gliceryna, glicerol). Stosuje się również w tym celu żelatynę, lecytynę lub termoplastyczny hydrożel na bazie kolagenu.

Demineralizowana macierz kostna występuje również w postaci proszku, bloczków o różnych kształtach lub cienkich arkuszy. Wszystkie te formy są plastyczne, dają się łatwo formować i dopasowują się do kształtu ubytku. (13)

Aby móc stosować DBM w ubytkach gdzie wymagana jest wytrzymałość mechanicz­na przeszczepu, łączy się zdemineralizowa­ną macierz z tradycyjnym uwapnionym kost­nym przeszczepem allogenicznym lub z auto­genicznym co dodatkowo dodaje przeszcze­powi właściwości osteogennych. Osteogenny charakter można także zapewnić poprzez połą­czenie tkanki kostnej z wcześniej pobranym i przygotowanym szpikiem kostnym pacjenta.

Kolejnym preparatem dodawanym do prze­szczepu kostnego w celu wzmocnienia z kolei osteoindukcyjnego charakteru całości jest pla­zma bogatopłytkowa (ang. Platelet Rich – PRP Plasma). Uzyskiwany z autologicznej krwi żel posiada płytki krwi oraz zawarte w nich, po­budzające miejscowo regenerację czynniki wzrostu. (14)

Etapy przygotowania DBM

Ze względu na duże ryzyko zakażenia, przygotowanie kości rozpoczyna się od badań, mających na celu zweryfikowanie, czy materiał przeznaczony do implantacji może być przyczyną przeniesienia wirusów lub bakterii chorobotwórczych takic jak HIV czy wirus WZW, a w przypadku przeszczepów ksenogenicznych, również chorób odzwierzęcych (choroba wściekłych krów, świńska grypa).

Kolejnym etapem przygotowania DBM jest usuwanie tkanek miękkich oraz odtłuszczanie w mieszaninie chloroformu z etanolem w stosunku 3:1, w dwóch cyklach po dwie godziny. Tak przygotowaną kość tnie się za pomocą piły na kawałki o grubości od 1 do 1,5 cm, przy jednoczesnym płukaniu ich w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Następnie kawałki kości zamraża się w -70^oC. Po rozmrożeniu, płukane są w czystym etanolu i suszone w suszarkach próżniowych.

Po tym procesie kawałki kości rozdrabnia się w młynkach mechanicznych a otrzymany proszek przesiewa się przez sito w celu odseparowania cząstek o odpowiedniej wielkości.

Rozdrobnioną kość odwapnia się w 0,-0,6M HCl, a następnie płucze w sterylnej wodzie w celu usunięcia nadmiaru kwasu. Drobinki umieszczane są w buforze fosforanowym na 24 godziny, po czym płukane są w etanolu i suszone w procesie podwójnej liofilizacji. (15)

Gotowy produkt sterylizuje się za pomocą promieniowania jonizującego, pakuje w warunkach aseptycznych i przechowuje w warunkach chłodniczych. (14)

Wybrane etapy przygotowania demineralizowanej macierzy kostnej opisano w kolejnych podrozdziałach.

Odwapnianie kości

Proces prowadzi się w temperaturze 4^oC przez 8 dni w trakcie ciągłego mieszania, najczęściej w 0,5-0,6M HCl (21 cm³ kwasu potrzeba do zdemineralizowania 1g kości). Użycie silniejszych kwasów może prowadzić do zwiększenia porowatości kości, zmniejszenia jej twardości i odporności na ściskanie.

W wyniku działania kwasu na kość, znajdujący się w niej hydroksyapatyt ulega rozpadowi na fosforan jednowapniowy i chlorek wapnia.

Mrożenie kości

Popularnym typem mrożenia kości jest mrożenie prowadzone w temperaturze od -15 do -20 ° C. Mrożenie w niskich temperaturach jest łatwym procesem oraz niska temperatura mrożenia umożliwia prowadzenie tego procesu w ogólnodostępnych zamrażarkach. Proces ten posiada jednak wady, często uniemożliwiające stosowanie tego typu mrożenia materiałów żywych, ponieważ wzrost kryształów lodu podczas zamrażania powoduje niszczenie komórek kości. Wadą jest również ograniczony czas przechowywania. Dlatego przy mrożeniu demineralizowanej macierzy kostnej wykorzystuje się skroplone gazy, zwykle ciekły azot, który zapewnia długotrwałe przechowywania w niskiej temperaturze (16).

Suszenie DBM przez liofilizację

Liofilizacja jest procesem suszenia sublimacyjnego zamrożonych substancji. Polega na usuwaniu rozpuszczalnika w obniżonej temperaturze oraz pod zmniejszonym ciśnieniem. Proces ten znalazł wykorzystanie przy suszenia materiałów allogenicznych już kilkadziesiąt lat temu. Obecnie jest najpopularniejszą metodą suszenia DBM. Proces suszenia prowadzano jest w liofilizatorze, w którym umieszcza się zmrożoną kość. Następnie temperaturę panującą wewnątrz urządzenia zwiększa się etapami, od -40°C do 0°C w ciągu trzech dni. Temperatura skraplacza utrzymuje się na poziomie między -60°C, a -70°C, w tym czasie podciśnienie wynosi około 10-20mTorr. Długość cyklu uzależniona jest od wydajności urządzenia oraz ilości suszonego materiału i waha się od 2 do 14 dni (16).

Komórki macierzyste jako materiał osteoindukcyjny stosowany w regeneracji zębów.

Ze względu na swoje charakterystyczne właściwości komórki macierzyste wykorzystuje się do przyspieszenia odbudowy ubytków kostnych, stosowane są szczególnie w stomatologii. Charakterystyczne cechy tych komórek obejmują m.in. klonogenność, czyli możliwość podziałów, w wyniku których tworzą się zespoły identycznych komórek wchodzących w skład określonych wyspecjalizowanych tkanek, samoodnawialność, czyli zdolność do nieograniczonej liczby podziałów oraz plastyczność, czyli zdolność do różnicowania w komórki 3 listków zarodkowych (endodermy, ektodermy oraz mezodermy) (17). Wyróżnia się 2 podstawowe typy komórek macierzystych: embrionalne (ang. Embryonic Stem Cells) oraz somatyczne (ang. Adult Stem Cells). Embrionalne komórki macierzyste mogą się różnicować we wszystkie typy komórek tzn. mają charakter totipotencjalany, natomiast komórki somatyczne wykazują ograniczony potencjał różnicowania. Ich rolą jest możliwość ciągłego samoodtwarzania oraz naprawy uszkodzonych tkanek (11). W tkankach dojrzałego zęba oraz więzadła ozębnowego występują komórki macierzyste. Komórki te są odpowiedzialne za naturalne procesy naprawcze. Mogą być one pobrane, hodowane na odpowiednich podłożach komórkowych i wykorzystane do indukowania regeneracji więzadła ozębnowego, miazgi zęba podobnie jak preparaty o właściwościach osetoindukcyjnych, a w przyszłości nawet wytwarzania biologicznych zębów zastępczych. Obecnie wykorzystuje się m.in. komórki macierzyste miazgi zębam komórki macierzyste z ludzkich zębów mlecznych, komórki macierzyste woreczka zębowego oraz komórki macierzyste więzadła ozębnowego (11).

Bibliografia

Bibliografia

1. Koźlik M., Wójcicki P., Rychlik D., Preparaty kościozastępcze, Dent. Med. Probl. 2011, 48, 4, 547–553

2. „Bone graft substitutes”, The Lancet; 1999, 353 (suppl I); 28-29

3. M. Łobacz, “Rys historyczny, przegląd I klasyfikacja materiałow kościozastepczych oraz przeszczepów tkanki kostnej”.

4. Khaliq, S; Lollis, R; Evaluation of a Next Generation DBM Putty in a Posterolateral Spinal Fusion Model

5. http://infusebonegraft.com/hospital-administrators/index.htm

6. http://www.biohorizons.com/grafton-study.aspx BIOHORIZONS GRAFTON DBM

7. Alexander R. Vaccaro Tushar Patel Jeffrey Fischgrund A pilot safety and efficacy study of OP-1 putty (rhBMP-7) as an adjunct to iliac crest autograft in posterolateral lumbar fusions

8. http://www.ele.uri.edu/courses/bme281/F08/Erin_2.pdf OP-1 putty, Erin LaBarge, Biomedical Engineering

9. http://www.biohorizons.com/grafton-study.aspx BIOHORIZONS GRAFTON DBM

10. http://www.biohorizons.com/grafton.aspx BIOHORIZONS GRAFTON DBM

11. Olender E., Kamiński A.; Komórki macierzyste tkanek zęba i możliwości odtwarzania struktur zęba

12. Malinin TI, Temple HT, Bone Allografts in Dentistry: A Review

13. Demineralized bone matrix in bone repair: History and use; Elliott Gruskin, Bruce A. Doll , F. William Futrell , John P. Schmitz, Jeffrey O. Hollinger; Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1063–1077

14. Demineralizowana macierz kostna – przygotowanie i zastosowanie w leczeniu stomatologicznym; Czas. Stomatol., 2007, LX, 9, 601-610

15. Preparation and Characterization of a Composite of Demineralized Bone Matrix Fragments and Polylactide Beads for Bone Tissue Engineering; Chuck B. Thomas a , Scott Maxson b & Karen J. L. Burg; Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 22:4-6, 589-610

16. Malinin TI, Temple HT, Bone Allografts in Dentistry: A Review

17. Szyszkowska A., Krwaczyk P., Materiały stosowane do odbudowy ubytków kostnych w stomatologii – praca poglądowa, Implantoprotetyka, 2008, tom IX, nr 4 (33)