Sprawozdanie z charakterystyki badanych mikroorganizmów.

Opis izolowanych kolonii

Serratia marcescens – kolonie czerwone, okrągłe, o równych brzegach, wypukłe, drobne kolonie; komórki w kształcie pałeczek, w barwieniu Grama komórki wykazują charakter G-. Serratia marcescens nie wytwarza amylaz mogących trawić skrobię. Wykazuje aktywność proteolityczną i hydrolizuje białka. Produkuje enzymy lipolityczne. Jest zdolna do amonifikacji i po dodaniu odczynnika Nesslera roztwór przybiera kolor zielono-brunatny, świadczący o wysokim stężeniu jonów amonowych.

Żółte kolonie – kolonie żółte, okrągłe, wypukłe, o regularnym brzegu, drobne kolonie; komórki ziarniste, drobniutkie, w barwieniu Grama wykazują charakter G+. Produkują enzymy lipolityczne. Są zdolne do amonifikacji i po dodaniu odczynnika Nesslera roztwór przybiera kolor zielono-brunatny, świadczący o wysokim stężeniu jonów amonowych.

Białe kolonie – kolonie białe, małe, o nieregularnym kształcie, ostrej krawędzi, płaskie; komórki w kształcie pałeczek, w barwieniu grama wykazują charakter G-.

Bacillus subtilis wytwarza amylazy trawiące skrobię. Wykazuje aktywność proteolityczną i hydrolizuje białka. Produkuje enzymy lipolityczne.

Bacillus cereus wytwarza amylazy trawiące skrobię. Wykazuje aktywność proteolityczną i hydrolizuje białka. Produkuje enzymy lipolityczne.

Escherichia coli nie wytwarza amylaz trawiących skrobię. Nie wykazuje aktywność proteolityczną i nie hydrolizuje białka. Produkuje enzymy lipolityczne.

Pseudomonas aeruginosa wykazuje właściwości lipolityczne.

Wykrywanie amylaz produkowanych przez drobnoustroje

Materiały: płynne hodowle szczepów mikroorganizmów, probówki z podłożem zawierającym skrobię (20 ml)

Podłoże: Pepton 10g/l K2HPO4 0,3g/l NaCl 0,5g/l CaCO3 3g/l

MgSO4•7H2O 1g/l (NH4)2SO4 2g/l skrobia 10g/l agar 25g/l (pH 7,0)

1. Z hodowli płynnych pobrano dowolnie wybrane szczepy, pobrano po 5 ml i odwirowano przez 5 min w 6000 rpm.

2. Osady odrzucono a supernatanty pozostawiono do badań.

3. Wylano na płytki Petriego porcję podłoża ze skrobią i pozostawiono do zastygnięcia.

4. Po zastygnięciu poustawiano 3 wyjałowione cylinderki i wylano pozostałą część podłoża ze skrobią.

5. Po zestaleniu się podłoża wyjęto delikatnie cylinderki a do powstałych studzienek przeniesiono po 100µl supernatantów pozostałych po odwirowaniu mikroorganizmów.

6. Inkubowano płytki w temperaturze 28-30^oC

7. Po inkubacji zalano płytki płynem Lugola i obserwowano strefy przejaśnień wokół studzienek.

Na podstawie powyższych czynności ustalono, iż Bacillus subtilis i Bacillus cereus wytwarzają zewnątrzkomórkowe amylazy, a Escherichia coli i Serratia marcescens nie.

Wykazywanie aktywności proteolitycznej różnych drobnoustrojów

Materiały: płynne hodowle odpowiednich mikroorganizmów, szalki Petriego z agarem mlecznym i siarczanem wapnia lub kwasem trichlorooctowym.

Wykonanie:

1. Wykonano posiew ezą danego szczepu bakteryjnego na płytkę z agarem mlecznym (luźny zygzak)

Po inkubacji obserwowano występowanie jaśniejszych stref w otoczeniu wyrosłych kolonii.

Do odczytu naniesiono TCA na płytkę.

Na podstawie wyżej przeprowadzonych czynności ustalono, iż Bacillus cereus, Bacillus subtilis oraz Serratia marcescens hydrolizują białka, natomiast Escherichia coli nie.

Oznaczanie lipolitycznych zdolności drobnoustrojów

Materiały: płynne hodowle odpowiednich mikroorganizmów, sterylne szalki Petriego, sterylne podłoże stałe Spirit blue, sterylny substrat - trójbutyryna.

Wykonanie:

1. Do 50 ml rozgrzanego do 50 ̊C podłoża stałego Spirit blue dodano sterylnie 1,5 ml tributyryny. Intensywnie wymieszano. Tak przygotowane podłoże lipolityczne wylano na dwie szalki Petriego.

2. Po zastygnięciu podłoży na jednej płytce wykonać posiew ezą szczepu kontrolnego, a na drugiej płytce posiew szczepu badanego. (kreska)

Po inkubacji obserwowano występowanie jaśniejszych stref w otoczeniu wyrosłych kolonii.

Na podstawie powyższych czynności ustalono, iż zarówno Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus subtilis i Pseudomonas aeruginosa wykazują właściwości lipolityczne.

Barwienie Grama wybranych szczepów

Materiały: hodowle płynne szczepów bakteryjnych, 0,5% roztwór fioletu krystalicznego, płyn Lugola, fuksyna, alkohol etylowy, woda destylowana, szkiełka: przedmiotowe i nakrywkowe.

1. przygotowano rozmazy hodowli izolantów bakteryjnych

2. barwiono roztworem fioletu krystalicznego przez około 3 minuty

3. spłukano preparat woda destylowaną

4. zalano preparat płynem Lugola na około 3 minuty

5. spłukano wodą destylowaną

6. zalano preparat alkoholem etylowym na około 30 s, w celu odbarwienia

7. spłukano wodą destylowaną

8. barwiono fuksynÄ… przez 15 s

9. spłukano woda destylowaną

10. wysuszono

11. oglądano pod mikroskopem, przy powiększeniu max 40 razy

Na podstawie powyższych czynności stwierdzono, iż Serratia marcescens oraz badane białe kolonie wykazują charakter G-, a badane żółte kolonie wykazują charakter G+.

Określenie zdolności izolantów do amonifikacji.

MateriaÅ‚y: kolby z podÅ‚ożem z mocznikiem (mocznik (20g), K₂HPO₄ (1g), CaCl₂ x 6 H₂O (0.1 g), MgSO₄ x 7H₂O (0.3g), NaCl (0.1g), FeCl₃ x 6H₂O (0.01g), wyciÄ…g z miÄ™sa woÅ‚owego (5g), H₂O dest. (1000ml)), odczynnika Nesslera

1. Dwie probówki zawierające po 5 ml podłoża z mocznikiem, zaszczepiono izolantami glebowymi.

2. Inkubowano w 37ºC przez 7 dni.

3. Po inkubacji sprawdzono ilość wydzielającego się amoniaku przy użyciu odczynnika Nesslera (natężenie barwy zależy od stężenia amoniaku).

Na podstawie powyższych czynności stwierdzono, iż zarówno Serratia marcescens, jak i badane żółte kolonie po dodaniu odczynnika Neslera zabarwiły się na zielono-brunatny kolor, co informuje o wysokim stężeniu jonów amonowych i dodatnim efekcie amonikalnym, czyli zdolności do amonifikacji.

Badanie aktywności lipolitycznej wybranych szczepów bakterii

1. Badanie aktywności lipolitycznej

1. Hodowle bulionowe z oliwą z oliwek przygotowane tydzień wcześniej odwirowano w objętości 5 ml przez 5 min przy 6000rpm.

2. Uzyskany supernatant przepipetowano do czystej próbówki.

3. Przygotowano 3 próbówki, w których umieszczono:

   1. 1300 µl 100 mM buforu fosforanowego o pH 7.25; 300 µl supernatantu, 15 µl substratu-pNPP (2 probówki)

   2. 1300 µl 100 mM buforu fosforanowego o pH 7.25; 300 µl woda, 15 µl substratu (kontrola)

4. Następnie próbówki inkubowano przez 15 minut w temperaturze 37°C w łaźni wodnej.

5. Zmierzono absorbancję prób (λ=410 nm) wobec próby kontrolnej.

1. Obliczenie aktywności lipolitycznej na podstawie wzoru:

$$x = \frac{\left( A_{probki} - A_{\text{kontrola\ }} \right) + b}{a*0,3*15}$$

$x_{1} = \frac{\left( A_{probki} - A_{\text{kontrola\ }} \right) + b}{a*0,3*15} = \frac{0,119 + 0,01}{0,0832*0,3*15} = 0,344$, gdzie x1 to hodowla mikroorganizmu o żółtym zabarwieniu kolonii.

$x_{2} = \frac{\left( A_{probki} - A_{\text{kontrola\ }} \right) + b}{a*0,3*15} = 3,01$ lecz ta próba z powodu zmętnienia spowodowanego najprawdopodobniej uwolnieniem aminokwasów, nie wyszła prawidłowo, hodowla Serratia marcescens.

1. Wyznaczenie krzywej standardowej

   1. Do 10µl roztworu pNP dodano 10 ml buforu fosforanowego, by uzyskać roztwór o stężeniu 10µg/ml.

   2. Sporządzono kolejne roztwory o następujących ilościach związku: 2.5µg; 5µg; 7.5µg; 10µg; 12.5µg. Aby je uzyskać pobrano po 0.25ml; 0.5ml; 0.75ml; 1ml; 1.25ml roztworu uzyskanego w podpunkcie powyżej i uzupełniono buforem fosforanowym do objętości 5 ml.

Ze stężenia 10µg/ml pobierano kolejno 0.25ml; 0.5ml; 0.75ml; 1ml; 1.25ml i uzupełniano do 5ml co dało stężenia kolejno 0,5µg/ml, 1,0µg/ml, 1,5 µg/ml, 2,0 µg/ml i 2,5 µg/ml.

1. Zmierzono absorbancję wobec buforu fosforanowego. Wyniki podane są w tabeli poniżej:

Ls.	Stężenie pNP [µg/ml]	Absorbancja
1.	0,5	0,057
2.	1,0	0,086
3.	1,5	0,134
4.	2,0	0,178
5.	2,5	0,219

Wykres krzywej standardowej prezentuje się następująco:

- Kolonia żółta:

y=0,0832x+0,01

0,0832x=y-0,01

- 0,0832x=0,119-0,01

0,0832x=0,109

X=1,31 µg/ml pNP

Jeżeli inkubacja trwała 15 minut to w ciągu minuty uwalniało się 0,087 µg na każdy mililitr.

- Dla Serratii marcescens nie byliśmy w stanie zmierzyć stężenia pNP z powodu zmętnienia i absorbancji poza naszą krzywą standardową.

Badanie zdolności do produkcji antybiotyków przez izolanty

Na dwóch płytkach z podłożem Miller-Hintona posiano dwa badane szczepy w formie pionowych posiewów, oraz prostopadle do nich szczepy, których strefy zahamowania wzrostu powinno się obserwować.

Na jednej z płytek posiano badany szczep żółtej kolonii, a prostopadle do niego szczepy Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus oraz Bacillus cereus. Niestety najprawdopodobniej z powodu nieprawidłowego pobrania lub zbyt gorącej ezy żółty szczep nie wyrósł na płytce i niemożliwe było sprawdzenie jego właściwości wytwarzania antybiotyków oddziałowujących na inne szczepy. Wszystkie wyżej wymienione szczepy wyrosły na całej długości ich posiewu, a sam Bacillus cereus wykazuje się dużą ekspansywnością i jego kolenie rozmiarami znacząco przewyższają rozmiary innych kolonii.

Na drugiej płytce posiano szczep Serratia marcescens i prostopadle do niego szczepy Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus oraz Bacillus cereus. Serratia marcescens nie wytwarza antybiotyków hamujących wzrost Escherichia coli, Micrococcus luteus czy Staphylococcys auerus, gdyż wyrosły one na całej długości posiewu. Serratia marcescens zahamowała całkowicie wzrost Bacillus cereus, gdyż ten nie wyrósł wcale na całej długości posiewu, a bardziej prawdopodobne jest to, iż nie został on posiany prawidłowo i mógł być tam wcale nienaniesiony, bądź uśmiercony zbyt wysoką temperaturą ezy, którą go posiewano.

Niestety to ćwiczenie w większości nie wyszło prawidłowo i uniemożliwia to wysnucie prawidłowych wniosków do ćwiczenia.