Zestaw A 1. SYNTEZA 6-AP (KWASU 6-AMINOPENICYLANOWEGO;METODA ENZYMATYCZNA I CHEMICZNA). Kwas 6AP to półprodukt do wytwarzania penicylin półsynetetycznych. Można go otrzymać w wyniku bezpośredniej biosyntezy z użyciem mutantów P.chrysogenum. Wydajność tego procesu jest jednak niska dlatego w praktyce przemysłowej produkuje się go na drodze hydrolizy wiązania amidowego w penicylinie. Proces ten może być prowadzony metdoą chemiczną bądź enzymatyczną. Proces hydrolizy enzymatycznej prowadzi się w bioreaktorze. Biokatalizatorem jest acylaza penicylinowa. Reakcja enzymatyczna jest odwracalna, w śr zasadowym zachodzi hydroliza wiązania amidowego z odszczepieniem reszty fenyloacetylowej lub fenoksyacetylowej i uwolnienie kwasu 6AP, w śr kwaśnym zachodzi acetylacja kwasu. W przemyśle najczęściej stosuje się technologię wykorzystującą immobilizowaną amylazę penicylinową produkowaną przez konstytutywne mutanty lub zrekombinowane szczepy E.coli. U niektórych drobnoustrojów biosynteza amylazy polega na represji katabolicznej w obecności glukozy, fruktozy, maltozy, laktozy, glicerolu, kwasu octowego lub indukcji substratowej: induktorem: fenylooctan, fenoksyoctan. Reakcji poddaje się 6% r-r wodny soli sodowej lub potasowej penicyliny w temp 35 przez 2-4h. przebieg reakcji śledzi się na podstawie ilości r-ru NaOH zużytego do neutralizacji wydzielanego kwasu fenylooctowego. Odczyn środowiska reakcyjnego utrzymywany jest na poziomie 7-8 i decyduje o efektywności procesu, gdyż kwaśny hamuje hydrolizę, a zbyt zasadowy powoduje degradację penicyliny i kwasu 6AP oraz inaktywację enzymu. Wydajność95%. Preparaty enzymatyczne amylazy charakteryzuje wysoki czas operacyjny, dlatego mogą być wykorzystane kilkuset razy w cyklach produkcyjnych. Po zakończeniu procesu i oddzieleniu preparatu enzymatycznego roztwór zakwasza się kwasem siarkowym o pH 2,5, wiążąc 6AP w postaci siarczanu, a r.penicyliny i kw. Fenylooctowy usuwa się na drodze ekstrakcji np. z octanem butylu. Metoda chemiczna: W pierwszy etapie: R3SiCl i PCl5. Dalej R1-Cl,potem H+,H2O.Metoda chemiczna Stosuje się chlorowcowane rozpuszczalniki organiczne, chlorki kwasowe, mieszane bezwodniki, ciekły azot do chłodzenia. Korzyści z zastąpienia metody chemicznej enzymatyczną: eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia; prowadzenie r-cji w umiarkowanych war.; łatwa kontrola pH, temp.; zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych. 2. I ETAP BIOSYNTEZY SCIANY KOMÓRKOWEJ (+INHIBITORY). Zachodzi biosynteza mureiny. Głównym procesem jest przyłączenie kwasu Nacetylomuraminowego do pentapeptydu co zachodzi w ten sposób: D-fruktozo-6-fosforan, w reakcji katalizowanej przez syntazę glukozamino-6-fosforanu, przekształcany jest do D-glukozamino-6-fosforanu (donor: L-glutamina), który jest przekształcany do D-glukozamino-1-fosforanu prze mutazę fosfoglukozoaminową.. Następnie zachodzą dalsze modyfikacje przy udziale UTP i odłączeniem pirofosforanu. pO rekacji z PEP powstaje kwas UDP-N-acetylomuraminowy, do jego wolnej reszty COOH przyłączane są reszty : L-Ala, D-Glu, L-Lys, dipeptydu D-alanylo-D-Ala. Inhibitory I etapu syntezy mureiny: antykapsyna— działa na bardzo wczesnym etapie biosyntezy, hamując aktywność syntazy glukozamino-6-fosforanu. daptomycyna—hamuje biosyntezę w bardzo wczesnym stadium— miejsce działania antybiotyku jest pomiędzy syntazą glukozamino-6-fosforanu a syntazą UDP-N-acetyloglukozaminy. fosfomycyna— analog strukturalny fosfoenolopirogronianu , wiąże się z transferazą pirogronianową, tworząc nieodwracalny kompleks, który hamuje kondensację UDP-N-acetyloglukozaminy z fosfoenolopirogronianem. D- cykloseryna— działa jako kompetytywny inhibitor 2 enzymów niezbędnych do wytworzenia prawidłowych łańcuchów peptydowych mureiny— racemazy alaninowej (katalizującej przekszt. L-Ala w D-Ala) i syntetazy D-alanylo-D-alaninowej. bacytracyna – również działa na etapie syntezy peptydoglikanu; gł. na G(+). 3. SYNTEZA CHLORAMFENIKOLU. Jest analogiem L-Phe. Działa bakteriostatycznie - hamuje syntezę białka na rybosomach przez odwracalne wiązanie się z podjednostką 50S w kom. prokariotycznych. Ze względu na niepożądane działania uboczne, zastosowanie jest ograniczone. Możliwa jest biosynteza mikrobiologiczna, w której prekursorem jest kw. szikimowy. Produktem biosyntezy jest aktywny antybiotycznie izomer D- treo. Pozostałe trzy stereoizomery (dwa centra asymetrii) mają nieznaczną aktywn. antybiotyczną. Biosynteza chloramfenikolu jest jednak mniej opłacalna niż synteza chemiczna, dlatego nie stosuje się jej w przemyśle. Istnieje kilka metod syntezy chemicznej (etylobenzenu, styrenu lub p nitroacetofenonu). Synteza z wykorzystaniem p-nitroacetofenonu. Bromowanie p-nitroacetofenonu w środ. wrzącego kw. octowego. Produkty r-cji wydziela się przez dodanie wody i oczyszcza, a następnie łączy się addycyjnie z urotropiną. Połaczenie to rozkłada się Dodając alkoholow. r-ru HCl. Otrzymany związek poddaje się acetylacji, po czym kondensuje z formaldehydem w r-rze alkoholowym w obecności wodorowęglanu sodu a następnie redukuje selektywnie grupę ketonową(reakcja Merweeina-P przy pomocy izoproyplanu glinu w alk izoporpylowym). Wydzielający się w trakcie reakcji aceton oddestylowuje się, co zapobiega odwracalności reakcji. Rozdziela się mieszaninę na izomery optyczne pry zast kwasu d-KAMFOROSULFONOWEGO. Na końcu izoluje się chloramfenikol za pomocą np. estru metylowego. 4. ANTYBIOTYKI PRZECIWGRZYBOWE. Brak jest skutecznych i nietoksycznych lub mało toksycznych antybiotyków p/grzybowych. Stosowane leki p/grzybowe mają wiele wad: wąskie spektrum aktywności, mała aktywność, duża toksyczność, często działanie jedynie fungistatyczne, słaba rozpuszczalność, trudne wchłanianie, pojawianie się szczepów opornych oraz nie zawsze wygodna forma leku. Miejsca działania antybiotyków p/grzybowych: szlaki związane z biosyntezą ś. kom. grzyba ; sterole, bł. cytoplazm; synteza kw. nukleinowych; procesy podziału jądra. Antybiotyki polienowe. Budowa: zamknięty pierścień makrolidowy, z różną liczba gr. OH w części hydrofilowej i sprzężonymi wiązaniami podwójnymi w cz. hydrofob. Polienowe pierścienie antyb. powstają z jednostek octanowych i propionianowych w szlaku poliketydowym. Makrolidowy pierścień laktonowy, pełniący rolę aglikonu, łączy się najczęściej przez tlen z resztą aminocukrową— mykozaminą. Makrocykliczne antybiotyki polienowe łatwo łączą się ze sterolami bł. kom. org. eukariotycznych, powodując upośledzenie ich f-cji, wydostawanie się na zewnątrz skład. kom., śmierć kom. Np. amfoterycyna B— heptaen, metabolit Streptomyces nodosus. Podstawowy lek w terapii grzybic narządowych (układowych). Aby zmniejszyć jej toksyczność prowadzi się modyfikacje chem., których wynikiem jest np. ester metylowy amfot. B. Częściowe zmniejszenie toksyczności osiągnięto także na drodze techologii lipidowej formulacji antybiotyku. nystatyna i polifungina— tetraeny, STOSOANE W leczeniu grzybic skóry, błon śluzowych jamy ustnej, rpzewodu pokarmowego i narządów płciowych- candida.zapobiegawczo po antybiotykoterapii. Niepolienowe: Gryzeofulwina. Wyodrębniona z hodowli Pennicillum griseofulvum. Ma strukturę trzech połączonych pierścieni, w tym 1 aromat., jest przykładem związku o budowie). Dwa centra asymetrii. Biologiczną aktywność wykazuje związek optycznie czynny o konfiguracji absolutnej 2(S) i 6’(R). Jest związkiem trwałym i trudno rozpuszczalnym w wodzie. Dobra wchłanialność i stosunkowo mała toksyczność. Przypuszczalnie gryzeofulwina powoduje zaburzenia w syntezie chityny, ale może także hamować syntezę białek i replikację DNA, blokując podziały kom. Nukleozydowe: poioksyna D i U Lipopeptydowe: echinokandyny 5. MAKROLIDY NIEPOLIENOWE Są to przeważnie zasadowe antybiotyki lipofilowe o budowie laktonowej, mające kilkunastoczłonowy pierścień z podstawnikami metylowymi i hydroksylowymi oraz od 1 do 3 reszt cukrowych. syntetyzowane w układzie dwóch szlaków, których produktami są: pierścień makrolidowy— kondensowany z reszt różnych małocząsteczkowych KT, podstawniki cukrowe— pochodne 6-deoksyheksoz, powstające z D-glukozy. Są bakteriostatyczne. Blokują syntezę białka na rybosomach bakteryjnych, nie działają natomiast na rybosomy w kom. eukariotycznych. Należą do najmniej toksycznych ze stosowanych antybiotyków (chociaż są hepatotoksyczne). Ich ważną cechą jest brak działania na prawidłową mikroflorę przewodu pokarmowego. Antybiotyki makrolidowe stosowane w lecznictwie: Erytromycyna— jest makrolidem o 14-członowym aglikonie. Spośród 4 naturalnych erytromycyn A, B, C i D jako lek wykorzystywana jest erytromycyna A (główny składnik produktu biosyntezy). Stosuje się ją w postaci tabletek dojelitowych(bo: nietrwała w kwaś środow soku żołądk). Dvercin-na gronkowce Pochodne ertrom. A: roksytromycyna - bardziej aktywna w stosunku do niektórych bakterii G(+) i G(-) np.: Helicobacter pylori. Zwiększona odporność na działanie soku żołądkowego, szybkie wchłanianie i łatwe wnikanie do makrofagów i leukocytów. Stosuje się ją w zakażeniach dróg oddechowych, tkanek miękkich i skóry. klarytromycyna— trwała w środ. kw. żołądkowego, szybko wchłania się po podaniu doustnym, szybko przenika do tk. ukł. oddechowego. Stosowana w leczeniu zakażeń skóry i tk. miękkich oraz ukł. oddechowego. dirytromycyna, azytromycyna— ma większą aktywność w stosunku do niektórych G(-).Stosuje się w zakażeniach dróg oddechowych, chorobach przenoszonych drogą płciową oraz zakażeniach skóry i tkanek miękkich. Antybiotyki nie będące pochodnymi erytromycyny: Oleandomycyna— makrolid o 14-członowym aglikonie, będący produktem metabolizmu Streptomyces antibioticus. Używana w postaci fosforanu. W zakażeniach górnych dróg oddechowych bakteriami G(+). Antybiotyki grupy leukomycyny— o 16-członowym aglikonie, np.: kitasamycyna, spiramycyna 6. WYODRĘBNIANIE ANTYBIOTYKÓW. Dobór metod wyodrębniania, oczyszczania i rozdzielania antybiotyków po procesie biosyntezy zależy od wielu czynników, m. in. od lokalizacji produktu, jego właściwości oraz wrażliwości na warunki wyodrębniania. Etap I: oddzielenie komórek od cieczy pohodowlanej. Stosowane metody: Filtracja— podstawowy sposób rozdzielenia składników stałych i r-r. W celu ułatwienia filtracji zawiesinę pohodowlaną poddaje się cieplnej koagulacji białek (jeśli produkt jest termostabilny) lub zakwaszeniu (w celu osiągnięcia pI), stosuje się także detergenty, rozp. org., ziemię okrzemkową. Prowadzi się najczęściej na próżniowych obrotowych filtrach bębnowych. Wirowanie- pozwala usunąć najdrobniejsze cząstki z przesączu po filtracji lub jako proces samodzielny ( np. w przypadku małych kom, gdy filtracja jest utrudniona).W przemyśle: separatory talerzowe, wirówki rurowe lub wirówki bębnowe. W celu wyodrębnienia antybiotyków gromadzonych we wnętrzu kom. konieczne jest uszkodzenie błony (często również ściany) kom., w celu uwolnienia antybiotyku. Zniszczenie bł. można uzyskać przez: mechaniczne rozrywanie kom, np. ucieranie, mielenie, działanie czynn. fiz. np. ultradźwięki, szok osmotyczny, zamrożenie i rozmrożenie; działanie czynn.chem. np. rozp.org., detergentami, kwasami. W kolejnym etapie najczęściej stosuje się techniki separacyjne takie jak: Ekstrakcja— met. bardzo wydajna i selektywna. Powszechnie stosow. rozp.: wodne r-ry buforowe, r-ry soli, rozp. org. (EtOH, MeOH, aceton). Butanol i octan butylu to rozp. nie mieszające się z wodą, można stosować je do ekstrakcji antybiotyków z biomasy, jak i r-rów wodnych. Stosując mieszalniki i rozdzielacze, proces można prowadzić okresowo lub w sposób półciągły. Metodę ekstrakcji ciecz- ciecz stosuje się często do erytromycyny, tetracykliny czy penicyliny. Chromatografia kolumnowa— wykorzystuje różnorodne właściw. chem. i fiz. substancji, b.efektywna met. rozdziału i oczyszczania. W BT antyb. najczęściej stosuje się chrom. jonowymienną (np. do cefalosporyny C, streptomycyny) i adsorpcyjną (np. na żelu krzemionkowym). Na kolumnach można wiązać zarówno antybiotyki, jak i zanieczyszczenia. Do szczególnie efektywnych, ale drogich metod oczyszczania i rozdzielania mieszanin bioproduktów należy HPLC, stosowana do wydzielania i rozdzielania mieszanin szczególnie cennych antybiotyków. Ekstrakcja jonowowymienna— połączenie met. jonowymiennej z techniką ekstrakcyjną, w której wykorzystuje się ciekłe wymieniacze jonowe. W końcowych etapach wydzielania czystego antybiotyku stosuje się często jego zatężanie, krystalizację z zatężonych r-rów wodnych lub org., a następnie odsączanie lub wirowanie i suszenie/liofilizację czystego produktu.	1. ŚCIANA KOM. BAKTERII G(-) - BUDOWA, F-CJE. Ściana G (–) posiada cienką w-wę mureiny, połączoną za pomocą lipoprotein z bł. zew. Jeden koniec lipoproteiny jest kowalencyjnie związany z mureiną, a drugi tkwi w bł. zew. Nie jest to 2warstwa fosfolipidowa, choć w jej skład wchodzą fosfolipidy. Wewnętrzna w-wa bł. zewn. składa się z fosfolipidów, a zewnętrzna z cząst. polisacharydowo-lipidowej zwanej lipopolisacharydem LPS. Lipidowa część LPS tworzy wewnętrzną część tej bł., a wielocukrowa część położona jest na powierzch. kom. LPS odgrywa tą samą rolę co LTA. Bł. zew. G(-) poprzetykana jest porami, utworzonymi prze białka poryny. Umożliwia to przenikanie składników odżyw. ze środow. zew. do przestrzeni między błoną zew. a cytoplazmatyczną (peryplazmą). W bł. zew. znajdują się także białka, które łączą i przyswajają wit. czy Fe. Rzęski i fimbrie przechodzą przez bł. zew. Błona zew. zapobiega przenikaniu do peryplazmy niektórych wielocząsteczkowych antybiotyków. Większość innych antybiotyków jest stosunkowo mała (cząsteczki), dzięki czemu przenikają przez błony zew. Poryny na skutek presji antybiotyków mogą w wyniku mutacji stać się mniej przepuszczalne, przez co antybiotyki nie mogą przeniknąć nawet do peryplazmy. W peryplazmie obecne są także enzymy m.in. alkaliczna fosfataza, która bierze prawdopodobnie udział w degradacji fragmentów DNA pochodzących od innych bakterii. W peryplazmie obecne są też oligosacharydy, które pomagają dostosowywać się do zmian osmolarności w podłożu. 2. III ETAP BIOSYNTEZY ŚCIANY KOMÓRKOWEJ. W ścianie kom. Etap II kończy się tym, że baktoprenol przenosi nowo powstałą disacharydopeptydową jednostkę przez błonę cytoplazmatyczną. Jednostki prekursora są przyłączane do łańcucha mureiny w miejscu wydłużania istniejącej cząsteczki. Łańcuchy cukrowe są wydłużane w reakcji transglikozylacji, a także tworzone są wiązania i mostki peptydwe odpowiedzialen za usieciowanie, prowadząc do usztywnienia mureiny. Katalizowane prze białka wiązące penicylinę. Towarzyszy temu wzrost komórki i wytworzenie przegrody wewnątrzkomórkowej. Powstaje duża czsteczka-sakulus, która nie jest stałą strukturą. Podczas cyklu życiowego komórki następuje ciągłe zrywanie powstałych wiązań i włączanie nowych prekursowró. Bakterie posiadają układy enzymatyczne pomagające w usieciowaniu mureiny np. karboksypeptydazu, transpeptydazy usuwają ostatnią dalaninę pentapeptydu tworząc wiązanie peptydowe z drugim łańcuchem. Dwucukrowe części podjednostki są dołączane jako pierwsze do końca łańcucha cukrowego w rosnącym szkielecie mureiny. Przecinane jest za pomocą enzymów wiązanie między dwiema cząst. D-Ala na końcu peptydu i doczepiany jest ten peptyd do innego peptydu przyległej części szkieletu cukrowego. Tworzenie poprzecznych wiązań peptydowych między bocznymi peptydami sąsiednich łańcuchów cukrowych służy wzmocnieniu warstwy mureiny. INHIBITORY III ETAPU BIOSYNTEZY Wankomycyna tak jak inne antybiotyki glikopeptydowe hamuje syntezę mureiny wyłącznie u G(+), gdyż w przypadku G(-) napotyka na zewnętrzną osłonkę. Wankomycyna wiąże się do wczesnego prekursora mureiny.. Powstanie kompleksu uniemożliwia tworzenie wiązań poprzecznych pomiędzy peptydami bocznymi mureiny. Równocześnie zahamowane zostają reakcje transglikozylacji – wydłużania łańcucha cukrowego. Mersacydyna (antybiotyk peptydowy) wiąże się do prekursora, hamując r-cje transpeptydacji i transglikozylacji. Meonomycyna (antybiotyk glikolipidowy) hamuje biosyntezę mureiny na poziomie transglikozylacji. Bulgecyna specyficznie hamuje aktywność jednej z transglikozylaz G(-) poprzez wiązanie się z tym enzymem. β-laktamy-powinowactwo do białek wiążących penicylinę, inaktywują je i powodują śmierć komórki. 3. SYNTEZA AMIKACYNY. Jeden z pierwszych antybiotyków półsyntetycznych wprowadzonych do lecznictwa. Zawiera w pozycji C-1 gr. NH2 podstawioną resztą kw. (S)-4-amino-2-hydroksymasłowego. Półproduktem do jej wytwarzania jest kanamycyna A, w której występują 4 gr. NH2, oraz 7 gr. OH. Surowcem przemysłowym jest siarczan kanamycyny A - w środ. zasadowym przeprowadzany w kanamycynę. Problemem jest selektywne zablokowanie odpowiednich reaktywnych grup. Najpierw: blokowanie grup reaktywnych w Kanamycynie A, po czym selektywnie uwalnia się gr. przy C-1 w celu arylowania resztą kwasu (S)-4-amino-2-hydroksymasłowego. Większość r-cji zachodzi bez wyodrębniania produktów pośrednich. Gr. NH2 przy C-1 i C-3” kompleksowane są cynkiem, po czym reszty przy C-3 i C-6 blokuje się resztą benzylokarboksylową. Następnie: polisilowanie pozostałych grup reaktywnych w półprodukcie. Półprodukt poddaje się łagodnej hydrolizie uwalniając sililanową grupę przy C-1. W końcowych etapach usuwa się grupy ochronne: najpierw sililowe (zakwaszając środowisko 1 mol/l HCl). Amikacynę wyodrębnia się i oczyszcza metodą chromatografii kolumnowej. Produkt wytrąca się metanolem, a końcowa wydajność wynosi ponad 80%. 4. ANTYBIOTYKI PEPTYDOWE. Dużą grupa związków, zróżnicowanych pod względem struktury chem., często cykliczne. Mogą być wytwarzane przez drobnoustroje albo org. wyższe, gdzie odgrywają istotną rolę w obronie przed zakażeniami, np. lizozym we łzach. Znalazły zastosowanie w medycynie: Leczenie zakażeń bakteryjnych; Leki immunosupresyjne (cyklosporyna A) – ochrona przed odrzuceniem przeszczepu; Leki przeciwnowotworowe. Wady: duża toksyczność, źle/wcale nie wchłaniają się z przewodu pokarm., więc ich zastosowanie jest ogranicz. Budowa chemiczna i aktywność biologiczna: Zbudowane z łańc. peptydowego L- i D- aminokwasów oraz często z części nieaminokwasowej, np.: KT lub węglowodanu. Dzielimy je na 5 klas: Peptydy liniowe, P. klasyczne, Glikopeptydy, Lipopeptydy, Depsypeptydy. Liniowe: posiadają ahelikalną konformacje. Np. cekropiny magaininy, katelicydyny. Najbardziej znaną katelicydyną ludzką jest LL-37. Wykazuje aktywność wobec streptococcus, aureus, coli. Glikopeptydowe – duża grupa antybiotyków, otrzymywana z promieniowców rodzaju Actinomyces; mieszanina związków o podobnej bud. chem.; cykliczny polipeptyd plus reszta cukrowa. Np.: wankomycyna, aktynomycyna, cyklosporyny, przeciwnowotworowe bleomycyny - hamują końcowy etap syntezy peptydoglikanu, ze względu na toksyczność ograniczone stosowanie; daptomycyna - półsyntetyczny lipodensypeptyd o działaniu p/bakteryjnym przypominającym wankomycynę; nizyna – produkt metabolizmu bakterii kw. mlekowego, stosowana jako konserwant żywności; dezintegruje bł. kom. Cykliczne oligopeptydy: Bacytracyna, gramicydyna ,tyrocydyna – przeciw ziarenkowcom G(+). Kapreomycyna, wiomycyna, polimyksyna –przeciw ziarenk G(+) oraz prątkom. Duża toksyczność; stosowane w postaci maści w leczeniu zakażeń skóry ziarenkowacmi G(+). Bacytracyna: mieszanina 7 peptydów otrzymanych z rodz. Bacillus; działa głównie na bakt.G(+) słabiej na G(-) i krętki; składnik wielu miejscowo stosowanych maści; Gramicydyna: mieszanina co najmniej 4 gramicydyn produkowany przez szczepy Bacillus brevis; działają na wiele tlenowych i beztlenowych G(+) także na Mycobacterium; jest jonoforem zdolnym do transportu jonów przez błonę cytoplazmatyczną tworzącym kanał jonowy. Kanał ten powstaje z dwóch cząsteczek gramicydyny. Polimyksyny różnią się od innych oligopeptydowych antybiotyków tym, że posiadają łańcuch kw tłuszczowego: zmodyfikowane wodorosiarczynem sodu lub formaldehydem są mniej toksyczne ale mniej aktywne; hamują jony Mg i Ca Depsypetydy duża grupa cyklicznych oligopeptydów; obok wiązań amidowych zawierają wiązania estrowe; przedstawiciel – walinomycyna – antybiotyk jonoforowy ułatwia transport jonów nieorg. przez błony. Podstawowym problemem tych związków jest ich cytotoksyczne oddziaływanie na struktury i procesy komórkowe, które są takie same w zdrowych jak i nowotworowych komórkach. 5. RYFAMYCYNY - BUDOWA, AKTYWNOŚĆ, POCHODNE PÓŁSYNTETYCZNE. Należą do ansamycyn. Budowa: alifatyczny mostek "ansa", łączący dwie przeciwległe pozycje centralnego aromatycznego układu naftalenu, połączonego z pierścieniem furanonu. Pięć pierwszych ryfamycyn; A, B, C, D i E wykryto w przesączu hodowli promieniowca wyizolowanego z gleby Nocardia mediterranea. Obecnie znanych jest kilkanaście ryfamycyn, znaczenie przemysłowe mają ryfamycyny: B, S. Mechanizm działania: zahamowanie syntezy mRNA. Działanie to jest uwarunkowane występowaniem w strukturze związku: •Pierścienia naftalenowego z gr. OH lub ketonową przy C-1 i gr. OH przy C-8.; •Gr. OH przy C-21 i C-23 w mostku ansa; •Określonej orientacji przestrzennej grup OH przy C-21 i C-23. Ryfamycyna SV była przez pewien czas stosowana jako lek przeciwgruźliczy. Ryfamycyny: B i SV stały się punktem wyjścia do otrzymania półsyntetycznych pochodnych: ryfamidu (nie ma obecnie zastosowania), ryfampicyny (które są bardziej aktywne p/bakteryjnie, a także mają zwiększoną wchłanialność oraz mniejszą toksyczność). Mimo szerokiego zakresu działania ryfampicyny, jest ona w większości stosowana tylko w leczeniu gruźlicy. Jest to spowodowane wystąpieniem oporności zwalczanych patogenów na ten lek w skutek zbyt szerokiego stosowania. Przeciwdziała się temu stosując leczenie skojarzone w połączeniu np.: z wankomycyną. Ryfamycyny oprócz aktyw. p/bakteryjnej mają akt. p/wirusową i hipolipidemiczną (obniżającą zawartość lipidów we krwi). Pomimo możliwości otrzymania zarówno ryfamycyny B, S i SV w wyniku biosyntezy, tylko ryfamycyna B jest otrzymywana tą metodą (trudności w izolacji pozostałych dwóch antybiotyków). Ryfapentyna – lepiej przenika do komórek niż ryfamycyna, ma także dłuższy biologiczny okres półtrwania (ok. 20 h). Ryfabutyna – jest bardziej reaktywna od ryfamicyny w leczeniu gruźlicy i trądu, 6. BIOREAKTORY - BUDOWA, PARAMETRY PROCESOWE. Bioreaktory (fermentory) – urządzenia wykonanie ze stali kwasoodpornej, zapewniają właściwe warunki procesu, monitorowanie, regulację parametrów technologicznych oraz ochronę przed zakażeniem. Powiększenie skali hodowli prowadzi się w bioreaktorach o pojemności od kilkunastu litrów do kilku m3. W produkcji stosuje się bioreaktory o pojemności od kilkudziesięciu do 200 m^3 a nawet do 400 m^3. Monitorowanie i regulacja parametrów takich jak: temp., prężność O2 rozpuszczonego w powietrzu, pH,. Zasilanie bioreaktora substratami- z wykorzystaniem komputerów. W BT antybiotyków używane są BR z mieszadłem mechanicznym i doprowadzaniem powietrza przez rurę perforowaną. Na warunki mieszania i napowietrzania wpływają: konstrukcja bioreaktora, szybkość obrotów mieszadła, szybkość doprowadzania powietrza i stopien jego dyspersji, sposób wzrostu drobnoustrojów i stężenie biomasy. Mieszanie musi zapewnić dobre warunki natleniania. Piana jest niekorzystna. Jej powstanie i dalsze utrzymywanie się zależy od skł. chem. i właściwości fizycznych środowiska. Sprzyjają jej szybkie obroty mieszadła i intensywne napowietrzanie hodowli. Środki przeciwpianowe: różne produkty syntetyczne np. wyższe alkohole. Najlepszym sposobem są procesy ciągłe, polegające na tym, że po wstępnym okresie rozmnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli strumieniem świeżego podłoża oraz jej ciągłe odbieranie. Szybkość i wydajność są najwyższe, możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury; możliwość regulacji stanu fizjologicznego kom. przez dobór szybkości zasilania hodowli podłożem, prowadzenie procesu w ustalonych warunkach. Wyróżnia się także procesy okresowe i okresowe z zasilaniem. Procesy okresowe: podłoże szczepione jest drobnoustrojami, które rozmnażają się i w czasie wzrostu lub po jego zakończeniu tworzą określony produkt, który po procesie biosyntezy może być izolowany. Jest to sposób prosty, nie pozwala jednak na maxymalne wykorzystanie aparatury i urządzeń, czy potencjału metabolicznego komórek. Procesy okresowe z zasilaniem: po zakończeniu intensywnego namnażania komórek w fazie tworzenia produktu hodowlę w bioreaktorze zasila się strumieniem odpowiednio dobranej pożywki. Skład pożywki zasilającej zapewnia ograniczenie syntezy masy komórkowej, a sprzyja biosyntezie produktu.	1. ŚCIANA G(+). Ś. kom. bakterii składa się gł z mureiny, rodzaju peptydoglikanu. Mureina skł. się z długich, nierozgałęzionych łańc. polisacharydowych, połączonych ze sobą krótkimi peptydami. Łańc. polisacharydowe mają, w przypadku mureiny, zawsze taki sam skład chem.: połączone wiązanie β-1,4-glikozydowe cząst. N-acetyloglukozoaminy i kw. N-acetylomuraminowego. Cząst. tych cukrowców są ułożone na przemian (regularna struktura). Peptydy, związane z resztami kw. N-acetylomuraminowego, mogą łączyć się ze sobą, ale muszą zawierać AA zawierające 2 reszty NH2, np L-lizyna. B. G(+) mają wielowarstwową ś. kom. Wszystkich warstw jest ok. 40 i są one ze sobą połączone poprzecznymi wiązaniami. Grubość takiej ściany to 20-80 nm. Mureina stanowi 40- 90% suchej masy ściany kom.. Jednak oprócz mureiny w ścianie kom. G(+) znajdują się także inne związki chem. Najważniejsze z nich to kwasy tejchojowe, będące polimerami glicerolu i rybitolu. Ze względu na duże ilości fosforu zgromadzonego w kwasach tejchojowych, brak tego pierwiastka nie pozwala na syntezę tych związków. Wytwarzane są wtedy kwa. tejchuronowe, złożone z utlenionych form cukrów. Kw. tejchojowe i tejchuronowe przechodzą w poprzek ściany kom. - są "wplecione" w mureinę. Podobnie rozmieszczone są kw. lipotejchojowe, zawierają one jednak dodatkowy komponent tłuszczowy, który zakotwicza je w błonie kom. Mimo że kw. tejchojowe stanowią nawet do 50% suchej masy ściany kom. G(+), bardzo ważną rolę pełnią polisacharydy oraz białka w niej zawarte. Jest to szczególnie istotne w przypadku bakterii chorobotwórczych, gdyż zarówno białka, jak i powierzchniowe cukry, są silnymi antygenami. Białka znajdują się głównie na zewnętrznej pow. ściany kom. G(+) i mogą pełnić f-cję adhezyn (pozwalając na przyleganie komórki do podłoża lub komórek gospodarza), enzymów i inwazyn (dając bakterii zdolność do wnikania do kom. gospodarza) oraz mogą chronić bakterie przed zlizowaniem. 2. PÓŁSYNTETYCZNE CEFALOSPORYNY 3 etapy: biosynteza produktów naturalnych(cefalosporyn lub penicylin)(chemiczne wytwarzanie półproduktów poprzez odszczepienie łańcucha bocznego od cefalosporyny C, bądź biologiczne wytwarzanie półproduktów przez enzymatyczną deaminację utleniającą, następnie dekarboksylację a na końcu enzymatyczne odszczepienie reszty znajdującej się przy C7 cefalosporyny C do kwasu 7AC), ich modyfikacja (chemiczna lub enzymatyczna np. synteza cefamandolu z kwasu 7Ac. Otrzymuje się sól sodową mrówczanu cefa, która jest prolekiem)), wprowadzenie nowych podstawników bocznych ( w pozycje C7 lub C3). Surowcami do produkcji półsyntetycznych cefalosporyn są: cafalosporyna C, cefamycyna C, penicylina G i V. Najkorzystniejsze byłoby zastosowanie bezpośredniej hydrolizy enzymatycznej Cefalosporyny C do 7-AC przy użyciu enzymu analogicznego do acylaz penicylanowych, który odszczepiałby łańcuch boczny od cefalosporyny C. Jednak taki enzym nie został odnaleziony. Dlatego łańcuch boczny odszczepia się za pomocą metod chemicznych przy użyciu chlorku nitrozylu lub pentachlorku fosforu. Najwyższą wydajność deacylacji w pozycji C7 cefalosporyny C zapewnia metoda iminoeterowa. Sól sodową cefalosporyny C poddaje się sililowaniu w celu osłonięcia grup karboksylowych. Uzyskany dieter przekształca się pod działaniem pentachlorku fosforu w iminochlorek, a ten następnie pod działaniem metanolu w iminoester. Po hydrolizie iminoestru wyodrębnia się 7AC w pI=3,5. Po utworzeniu 7-AC trzeba go zmodyfikować wprowadzając w pozycję (C7) odpowiednią grupę acylową. Używa się do tego celu bezwodników mieszanych lub chlorków kwasowych. Uzyskuje się w ten sposób cefalotyny, cefalopiryny, cefaloglicyny, cefotaksymy. Kwas 7-AC ma w pozycji C3 grupę acetoksymetylową, którą też można wymienić na inną. 3. SYNTEZA KLARYTROMYCYNY. Klarytromycynę stosuje się w leczeniu różnych zakażeń górnych i dolnych dróg oddechowych. Lek ten powstałw wyniku braku stabilności erytromycyny poprzez zablokowanie gr OH przy C6 przez metyl. Przebieg syntezy: R-cja erytromycyny A z nadmiarem chlorku benzyloksykarbonylowego w celu osłonięcia grup reaktywnych- NH2i OH w reszcie D-dezozaminy •Gr. dimetyloaminowa ulega częściowej demetylacji. R-cja CH3I prowadzi do przekształcenia grupy OH przy C6 w metoksylową. •R-cja uwodornienia produktu w EtOH na czerni palladowej w środowisku buforu octanowego przy pH=5,0 prowadząca do usunięcia grup benzyloksykarbonylowych. •R-cja redukcyjnego metylowania wodorem i formaldehydem- przywrócenie drugiej grupy metylowej do azotu w dezozaminie. •Odzielenie produktu ubocznego. •Oczyszczenie klarytromycyny (6-O-metyloerytromycyny) przez krystalizację z EtOH. 4. BIOSYNTEZA ANTYBIOTYKÓW (PODŁOŻA, PREKURSORY) Biosynteza antybiotyków odbywa się na drodze metabolizmu wtórnego drobnoustrojów. Metabolizm pierwotny obejmuje podstawowe przemiany materii, podstawowe szlaki metaboliczne. Natomiast metabolizm wtórny, który jest charakterystyczny dla danego mikroorganizmu obejmuje r-cje specyficznego sprzęgania metabolitów pierwotnych i jest źródłem antybiotyków, czyli metabolitów pierwotnych. Regulacja biosyntezy prowadzi do nadprodukcji antybiotyków. U szczepów dzikich, które przebywają w warunkach optymalnych dla rozwoju, dominują procesy związane ze wzrostem i rozmnażaniem komórek nad tymi, które prowadzą do gromadzenia się antybiotyków. Dopiero niewielkie ilości antybiotyków są produkowane w warunkach ograniczenia procesów wzrostu. Przykładem jest biosynteza penicyliny. Pierwszym etapem jest kondensacja 3 prekursorów aminokwasowych: L-Cys, L-Val i L‑aminoadypinianu. Są one zużywane w syntezie białek, dlatego do podłoża dodaje się cykloheksimid, który blokuje syntezę białek. Przez to jest większa dostępność prekursorów, co za tym idzie wyższa produkcja penicyliny. Znając mechanizmy regulacji, umiejętnie dobierając warunki środowiskowe oraz skład podłoża można doprowadzić do dominacji biosyntezy idiolitów. Biosynteza antybiotyków podlega w wielu miejscach kontroli: powstawanie prekursorów, zużywanie prekursorów, dostarczanie energii metabolicznej i transport antybiotyku poza komórkę. Mechanizmy kontroli: represja wywołana przez metabolity, represja kataboliczna (regulacja kataboliczna źródłem węgla), indukcja substratowa, indukcja przez efektory metaboliczne, indukcja przez związki azotu, regulacja fosforanowa, hamowanie w sprzężeniu zwrotnym, regulacja z udziałem pierwiastków śladowych lub temperatury, pH, natlenienia. Regulacja kataboliczna źródłem węgla polega na szybkim metabolizowaniu łatwo przyswajalnych źródeł węgla takich jak glukoza. Ten typ regulacji zaobserwowano m.in. przy produkcji penicyliny czy cefalosporyny. Regulacja uwarunkowana związkami azotu funkcjonuje niezależnie od powyższego mechanizmu regulacyjnego. Drobnoustroje łatwo przyswajają takie formy azotu jak jon amonowy, mocznik i niektóre aminokwasy. Jednak to dostępność jonu amonowego jest gł. czynnikiem regulacyjnym. Wysokie jego stęż. z reguły hamuje produkcję antybiotyków. Regulacja fosforanowa obejmuje zmiany stężenia jonu fosforanowego w podłożu, którego dodatek jest ważny w syntezie nukleotydów oraz fosforylowaniu metabolitów. Drobnoustroje dobrze rosną w szerokich przedziałach stężenia jonu fosforanowego, ale biosynteza antybiotyków charakteryzuje się niską tolerancją na duże stężenie jonu PO4^3-. Limitacja fosforanowa jest głównym warunkiem biosyntezy idiolitów, ale może prowadzić do niekorzystnego całkowitego zahamowania wzrostu komórek w fazie produkcji. W związku z tym do podłoży dodaje się organiczne źródło fosforanu lub w sposób kontrolowany zasila się hodowlę roztworem o bardzo małym stężeniu jonu PO4^3-. Można otrzymać mutanty szczepów, w których działanie powyższych mechanizmów jest eliminowane lub ograniczone. Uzyskuje się wtedy dużą nadprodukcję antybiotyku i rozciąga fazę produkcji w czasie hodowli. Jednak mutanty takie są upośledzone biologicznie. W związku z tym dąży się do uzyskania nadprodukcji bez nadmiernego zakłócania podstawowych procesów przemiany materii. Prekursory: •Acetylo - CoA - gryzefluwina, •Acetylo - CoA - antracykliny, •Malonylo - CoA - cykloheksimid, •Amidomalonylo – CoA - tetracykliny, •Propinylo - CoA - erytromycyna. Proces biosyntezy antybiotyków polega na prowadzeniu hodowli drobnoustrojów w bioreaktorze w podłożu o zoptymalizowanym składzie chemicznym, zapewniającym pełne wykorzystanie metabolicznego potencjału szczepu produkcyjnego. Należy stworzyć jak najlepsze, optymalne warunki (pamiętając, żeby nie było zbyt kosztowne - zużycie surowców) rozwoju aktywnej biomasy i biosyntezy produktu. Podłoża produkcyjne przygotowuje się z wystandaryzowanych surowców kompleksowych: mąka sojowa lub kukurydziana, namok kukurydziany, wyciągi mięsne. Podstawowym składnikiem podłoża jest źródło węgla i energii: glukoza, sacharoza, laktoza. Jeżeli używane są drobnoustroje wytwarzające enzymy amylolityczne (np.: Bacillus, czy promieniowce) - wykorzystuje się skrobię ziemniaczaną lub kukurydzianą, - źródłami węgla i równocześnie środkami przeciwpianowymi mogą być oleje roślinne lub tłuszcze zwierzęce, - źródłem azotu mogą być sole amonowe, woda amoniakalna. Wprowadza się odpowiedni zestaw soli mineralnych potrzebnych do wzrostu komórek i biosyntezy antybiotyków oraz CaCO3 (czynnik neutralizujący powstające kwasy org). Podłoża produkcyjne mogą zawierać składniki t.j. czynniki wzrostowe (wybrane AA i wit.) i prekursory produktu końcowego. 5. PROMIENIOWCE, GRZYBY, BAKTERIE. Głównym źródłem antybiotyków są promieniowce. Wytwarzają ponad 6 000 antybiotyków. O wiele mniej antybiotyków produkują grzyby – ponad 2 000 oraz bakterie – ponad 1 000. Grzyby stanowią zróżnicowana grupę eukariontów jedno- i wielokomórkowych o heterotroficznym sposobie odżywiania. Uczestniczą w degradacji materii org. i występują w wielu środowiskach: w glebie, w wodzie, szczątkach roślin. Mogą rozwijać się w szerokim zakresie temp. od 0 do 60°C, pH 2 do 8,5 , w warunkach tlenowych lub beztlen. Mogą współżyć w symbiozie z roślinami lub zwierzętami. W BT wykorzystuje się grzyby strzępkowe do biosyntezy antybiotyków, enzymów, kw. org. Tworzą one w czasie rozwoju wegetatywnego wielokomórkową, rozgałęzioną grzybnię. Podczas rozmnażania wegetatywnego powstaje dużo konidiów. Grzyby strzępkowe mogą rozmnażać się przez fragmentację strzępek lub płciowo tworząc worki, w których powstają zarodniki. Najważniejsze antybiotyki wytwarzane przez grzyby to: cefalosporyna C (Cephalosporium acremonium), penicylina G i V (Penicillium chrysogenum). Promieniowce wykorzystywane w BT są saprofitami bytującymi w glebie i kompoście. Wytwarzają większość antybiotyków o różnej aktywności: p/bakteryjne (gentamycyny, tetracykliny, ryfamycyny, erytromycyny, streptomycyny, wankomycyny), p/grzybowe (amfoterycyny, nystatyna), p/nowotworowe (aktynomycyna, mitomycyna, daunorubicyna). Mają budowę prokariotyczną ale morfologią, cyklem rozwojowym i sposobem rozmnażania przypominają grzyby strzępkowe. W hodowli wgłębnej promieniowce rosną w postaci grzybni nitkowatej. Dojrzałe komórki strzępek mogą tworzyć egzospory nazywane artrosporami - wrażliwe na wysoką temp. – giną w 70°C ale dojrzałe mogą przetrwać w stanie uśpienia kilkanaście lat. W podłożu potrzebne są składniki stymulujące kiełkowanie: L-Ala, L-Glu, LTyr, puryny i pirymidyny, dwutlenek węgla, Ca, Mg. Potem następuje okres intensyw. rozwoju grzybni strzępkowej. Po kilkunastu godzi. grzybnia ulega zróżnicowaniu. Procesy kom. ulegają zahamowaniu i z grzybni substratowej wykształca się grzybnia generatywna. Wśród bakterii produkujących antybiotyki najważniejsze są te z rodzaju Bacillus. Są to bakterie G(+) o złożonym cyklu rozwojowym, których częstą cechą jest ruch czynny komórek. Te tlenowe bakterie wytwarzają liczne antybiotyki peptydowe, enzymy przemysłowe, preparaty owadobójcze. U bakterii z rodzaju Bacillus znane są powiązania pomiędzy sporulacją a biosyntezą antybiotyków – antybiotyki peptydowe mogą pełnić funkcję efektorów procesów sporulacji. Natomiast inhiibitory procesu sporulacji hamują również biosyntezę antybiotyków. 6. INHIBITORY BETA-LAKTAMAZ Antybiotyki β-laktamowe z założenia mają działanie bakteriobójcze. Ich mechanizm działania opiera się na hamowaniu syntezy ś. kom. bakterii, której podstawą jest mureina. Drobnoustroje w celu obrony przed antybiotykami β-laktamowymi wytwarzają β-laktamazy - enzymy hydrolizujące wiązanie β-laktamowe. Wiązanie amidowe ulega rozpadowi. Tworzy się kw. karboksylowy i amina, a następnie wskutek dekarboksylacji niemożliwe jest odbudowanie układu β-laktamowego. Aby zapobiec procesowi opisanemu powyżej stosuje się inhibitory β-laktamaz. Pierwszym wykrytym inhibitorem jest kwas klawulanowy, naturalny metabolit Streptomyces clavuligerus. Wykazuje słabe właściwości antybiotyczne. Stosuje się go w połączeniu z penicylinami i cefalosporynami wrażliwymi na działanie β-laktamaz. Powoduje znaczne zmniejszenie wartości MIC tych antybiotyków wobec szczepów bakterii opornych. Odkrycie kwasu klawulanowego zainicjowało koncepcję w technologii polegającą na połączeniu antybiotyku ze związkiem, który zabezpiecza jego aktywne działanie. Inny inhibitor β-laktamaz to sublaktam. Stosuje się w lecznictwie np. 1 część sublaktamu+2 części ampicyliny. Kolejny inhibitor to tazobaktam podawany z piperacyliną. Kolejny przykład: tienamycyna. Niestety pojawił się nowy typ oporności bakterii skierowany przeciwko inhibitorom β-laktamaz. Polega on na enzymatycznej inaktywacji cząsteczki inhibitora lub na nadprodukcji typowych β-laktamaz do poziomu przekraczającego liczbę cząsteczek inhibitora.	1.BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA - BUDOWA I FUNKCJE Dwuwarstwa fosfolipidowa, w której zatopione są cząst. białek. Wyróżnia sie 2 zasadnicze rodz. białek budujących bł.: są to białka integralne – zakotwiczone, przechodzące 2-warstwę na wylot – nie mające zdolności do przemieszczania się oraz białka peryferyjne, znajdujące sie na pow. dwuwarstwy – mogące się swobodnie przemieszczać po pow. bł. Białka pełnią oprócz f-cji strukturalnych także f-cje enzymatyczne, receptorowe i transportowe. Funkcje bł:• Transport skł. pokarmowych przez bł. za pomocą białek transportujących. •Synteza mureiny i jej przemiana: odpowiedzialne za to są tzw. białka wiążące penicylinę. •Sekrecja: zespół białek umiejsc. w bł. zwany systemem sekrecyjnym. Białka przeznaczone do sekrecji są rozpoznawane przez występującą na ich końcu aminowym, krótką sekwencję aminokw. •Regulacja: białka wyczuwają zmiany w środow. zewn. i przekazują sygnały do białek we wnętrzu kom. - synteza białek, która właśnie trwa, zostaje ukierunkowana w odpowiedni sposób. •Transport elektronów. W bł. oprócz białek i lipidów (gł. fosfolipidy; mogą też być sterydy) mogą znaleźć się niewielkie ilości węglowodanów. 2.BIOSYNTEZA ŚCIANY KOMÓRKOWEJ- ETAP II 3 etapy: w cytoplazmie, w bł. cytoplazm., w ścianie kom. Etap2. - w bł. cytoplazm. Utworzony w cytoplazmie kom. bakteryjnej muramoilopentapeptyd (etap I) łączy się ze specyficznym przenośnikiem – fosforanem baktoprenolu. Utworzony w ten sposób związek nosi nazwę LIPID I. Następnie do powstałego kompleksu przyłączona zostaje cząst. UDP-N-acetyloglukozoaminy, tworząc LIPID II. Po odłączeniu UDP i utworzeniu wiązania β-1,4-glikozydowego powstaje disacharopentapeptyd, związany nadal z baktoprenolem. Następnie za pomocą białka flipazy, dochodzi do przerzucenia otrzymanego prekursora na zewnętrzną str. bł. cytoplazm. z jednoczesnym odłączeniem przenośnika baktoprenolowego. 3.AMINOGLIKOZYDY - BUDOWA,ZALETY,WADY Budowa: Część niecukrowa-aglikon i część cukrowa. Rdzeń aglikonu najczęściej stanowi aminocyklitol, połączony jest on wiąz. glikozyd. z 1 lub więcej reszt cukrowych/aminocukr., pochodnych glukozy, frukt, mannozy, rybozy. Prekursorem części aglikonowej jest mioinozytol. Ant.aminoglik. można podzielić an 3 gr: 1. Streptomycyny - zaw. streptydynę. Streptomycyna A to pseudotripeptyd, zaw. resztę α-D-mannozy połączoną z N-metylo- α -glukozaminą. 2. Neomycyny - zaw. 2-deoksytreptaminę podstawioną w poz C4, C5 3. Kanamycyny - zaw. 2-deoksytreptaminę podst. w C4, C6. Zalety: silne działanie bakteriobójcze wobec wielu tlen pał G(-), gronkowców oraz niektórych prątków; szybkie wchłanianie i dobre działanie po pod domięś. lub dożylnym; szybko przenikają do zewnątrzkom. płynów ustr.; wydalane z moczem w ciągu doby. Wady: złe wchłanianie po podaniu doustnym, nieakt. wobec bakterii beztlenowych, bariera transportu przez bł. biol., zła dystrybucja; duża toksyczność; uczulenia; narastająca oporność bakterii; nefro- i ototoks. 4.SYNTEZA AMOKSYCYLINY Amoksycylina jest półsyntetyczną penicyliną; α-aminopochodna penicyliny benzylowej; należy do β-laktamów. Synt. enzymat. Enzym pozyskuje się z bakt. Xantomonas citui (b. wydajnie). Można użyć enz. immobiliz. lub całych kom. Zastosow. całych kom. umożliwia uzysk. konwersji kwasu 6AP do amoksycyliny z 95% wyd. Amoksycylinę uzyskuje się w r-cji mieszanego bezwodnika kwasowego z solą potasową kw. 6AP. W czasie r-cji przeprowadza się także maskowanie gr. NH2 zlokalizowanej na dołaczanym do 6AP łańcuchu acylowym. 5. BIOTECHNOLOGIA PENICYLINY (MET.PRZEMYSŁOWA) Gł. źródłem penicylin są grzyby strzępkowe. Penic G i V wytw. są przez P.chrysogenum. Grzyby strz. w czasie rozw. wegetat. tworzą wielokom. rozgałęzioną grzybnię, tworzy się dużo konidiów, które służą jako mat. wyjś. do prowadz. hodowli. Wykorzyst. szczepy nie rozmn. się płciowo. Mogą przez fragmentację strzępek lub cykl paraseks. co wykorzyst. jest do hybrydyzacji szczepów przemysł. Podczas hodowli powierzch. war. zmieniają się - kom. różnicują się. Producent: Penicillum chrysogenum. Szczepy produkcyjne wytwarzają do 70 g z litra hodowli. Wydajność szczepu wyjściowego: 60 mg z litra. Główny sposób konstrukcji szczepów wysokowydajnych: powielenie genów biosyntezy (do 20 kopii). Prekursor: kw. fenylooctowy lub fenoksyoctowy, dzięki niemu zapewniona jest selektywna biosynteza penicyliny G. I etap: Kondensacja 3 prekursorów: L-Cys, L-Val, L-aminoadypinianu. Są one używane podczas syntezy białek, dlatego do podłoża dodaje się subs. hamującą tę syntezę (cykloheksimid). Zapewnia to większą wyd. II etap: Cyklizacja liniowego tripeptydu. Najpierw tworzy się pierścień β-laktamowy. Powstaje izopenicylina N będąca prekursorem wszystkich penicylin. W procesie prowadzi się regulację kataboliczną. Hodowlę prowadzi się w obecności glukozy i laktozy. Początkowo wykorzystywana zostaje gluk. Gdy się ona kończy wykorz. laktoza i następuje produkcja penicyliny (idiofaza). Biosyntezę prowadzi sie w bioreaktorach wyposażonych w mieszadła mechaniczne tarczowo-łopatkowe i bełkotkę, układ regulacji temp., szybkości napowietrzania, natleniania i dozowania. Po procesie syntezy zawiesinę pohodowlaną oczyszcza sie poprzez filtrację, ekstrakcję i wirowanie oraz krystalizację. Bakterie - produkują enzymy przemysł.: amylaza penicylinowa przez Bacillus megaterium używana do przemysł. wytw. penic. półsyntet. 6. ANTYBIOTYKI PRZECIWNOWOTWOROWE Gł. problemem jest działanie cytotoks. także w stosunku do tk. zdrowej. Miejsca działania antybiotyków p/nowotworowych: 1)Procesy replikacji DNA; 2)Podziały kom.; 3)Transkrypcja DNA; 4)Translacja; 5)Synteza prekursorów kw. nukleinowych. ad 1: syntezę hamują: bleomycyna (wolny rodnik nadtlenkowy powod. pęknięcie nici DNA); daunorubicyna (interkalacja DNA); azaseryna; ant. nukleozydowe (zakłócają syntezę prawidłowych nukleotydów). ad 2: etopozyd, winkrystyna, docetaksel. ad4: haringtonia. Źródła antyb: Streptomyces griseus (chronomycyna, daunorubucyna), S. pauceticus (daunorub, doksorub), inne. Otrzymyw.: np. daunorubicyny: Szczep produkc: S. peuceticus, czas: do 10 dób, T= do 30 C, pH: 7,2, wydzielenie: liza kom. i uwolnienie związku, filtracja, chromat, zatężanie, oczyszcz.(ekstrakcja). ZESTAW D 1. BIOGENEZA ANTYBIOTYKÓW I PREKURSORY SYNTEZ. Antybiotyki powstają z prekursorów, którymi mogą być: ■ ufosforylowane cukry, ■ fosfoenylopirogronian, ■ acetylo – CoA, ■ malonylo – CoA, ■ aminokwasy białkowe, ■ enzymatycznie modyfikowane pochodne podstawowych metabolitów pośrednich i prekursorów, ■ L-a-aminokwasy Biosynteza antybiotyków w szlaku poliketydowym. Etapy: 1. Wiązanie reszt acylowych (AcCoA->3 malonyloCoA). 2. Kondensacja kolejnej cząst. malonyloCoA z dekarboksylacją. 3. Redukcja gr. keto do OH. 4. Eliminacja wody. 5. Redukcja podwójnego wiązania. W zależności od prekursora mogą powstawać np.: erytromycyna (z propionyloCoA), tetracykliny (amidomalonyloCoA), antracykliny (acetyloCoA), gryzeofulwina (acetyloCoA). Różnice z biosynt. KT: różny stopnień redukcji grup keto.; różne prekursory; cyklizacje; powst. ukł. sprzężonych wiązań podwójnych. •W niektórych produktach o budowie peptydowej stwierdza się również obecność aminokwasów o konfiguracji D, np. D-alaniny w cyklosporynach. •Reszty β-aminokwasów; edeina zawiera β-serynę i β-tyrozynę. •Pochodne N-metylowe aminokwasów, np. cyklosporyny zawierają N-metyloglicynę. •Duża grupa antybiotyków, zwłaszcza syntezowanych przez promieniowce, zawiera reszty cukrowe. Pochodzą one najczęściej od glukozy. 2. DROBNOUSTROJE WYTWARZAJĄCE ANTYBIOTYKI. Głównym źródłem antyb. są promieniowce. Wytwarzają ponad 6 000 antybiotyków. O wiele mniej grzyby – ponad 2 000 oraz bakterie – ponad 1 000. Prom. są to bakterie, które w postaci cienkich nitek tworzą rozgałęzienia na wzór strzępków grzybni. Ich komórki mają budowę prokariotyczną, ale morfologią, cyklem rozwojowym i sposobem rozmnażania przypominają grzyby. O przynależności do bakterii decyd. cech tj.: brak jądra kom., podobny skład chem. ściany kom. Środowisko w jakim żyją to gleba torfowiska itp. Produkują antyb. tj: winomycyna, streptomycyna (Streptomyces griseus), erytromycyna (S. erythreus), wankomycyna (S. orientalis), tetracykliny, ryfamycyny. Inne bakterie - Bacillus (G+) lub mniej Pseudomonas: Subst. wytwarzane przez bakt. właściwe mają mniejsze znaczenie niż wytw. przez promieniowce. Np. przetrwalnikujące laseczki tlenowe z rodz. Bacillus są producentami antybiotyków peptydowych, a także enzymów przemysłowych (np. acylaza penicylinowa do przemysłowej produkcji kw. AP). Grzyby: głównie strzępkowe (nitkowate). Podczas rozwoju wegetatyw. tworzą one wielokomórk. rozgałęzioną grzybnię. Powstające konidia służą jako mat. wyjściowy do prowadz. hodowli. Niektóre grzyby rozmn. się przez fragm. strzępek. Nie wykorzystuje się grzybów rozmnażających się płciowo, ale może być cykl paraseksualny - do hybrydyzacji szczepów przemysłowych. Podczas hodowli powierzch. zmieniają się war. środow., dzięki czemu następuje morfologiczne i fizjologiczne różnicowanie kom. w kolonii, co konczy się sporulacją. Przykłady antyb.: penicylina G i V (Penicillium chrysogenum), cyklosporyna, cefalosporyna C (Acremonium chrysogenum), gryzeofulwina (P. griseofulvum). 3. TETRACYKLINY. Są antyb. o szerokim spektrum działania, mniej toksyczne np. od streptomycyny, chem. stabilne. Syntetyzowane przez promieniowce. Pierwszą T. wprow. do lecznictwa była tetrachlorocyklina (S. aureofaciens). Kolejnymi były: oksyT. i T. (brak gr. OH przy C5, brak at. Cl przy C7). Przemysłowo otrzymuje sie przez biosyntezę z użyciem wyselekcjonowanych szczepów S. aureofaciens. Budowa: związki 4-pierścieniowe o układzie oktahydrotetracenu. Wszystkie T. mają takie same pierś. A oraz dolna strefę cząst. Różnią się podstawnikami w poz. C5.C6,C7. Aromat. pierścień D, grupa keto. w pier. C oraz podwójne wiąz. w B stanowią ugrup. chromoforowe (barwa żółta). Aktywność: wobec tlenowych G(+) i G(-) oraz Mycoplasma, Chlamydia oraz pierwotniaków. Działają bakteriostatycznie hamując syntezę białka (zablokowanie translacji na rybosomach). T. naturalne mają sporo wad (hepato-, nefrotoksyczność, zaburzenia czynności ukł. pokarm), dlatego modyfikuje się je chem. Otrzymano w ten sposób: matacykliny, doksycykliny (brak nefrotok). Biosynteza: należy do najlepiej poznanych i opracowanych procesów produkcji antybiotyków. Szczepy produkcyjne ulepszano na drodze mutagenezy i selekcji mutantów, a także metodą fuzji protoplastów. Synteza: w szlaku poliketydowym. Szkielet węglowy powstaje podczas kondensacji 1 cząst. amidomalonyloCoA i 8 malonyloCoA. 4. SYNTEZA AZTREONAMU. Jednym ze sposobów wytwarzania antybiotyków monobaktamowych jest ich całkowita synteza, łącznie z wytworzeniem podstawowego układu β-laktamowego. Pierwszym syntetycznym monobaktamem wprowadzonym do lecznictwa był aztreonam, produkowany z dużą wydajnością z L-treoniny (lub L-allo- treoniny) lub jej pochodnych. W wieloetapowym procesie syntezy otrzymuje się kwas 4α-metylo-3-AM. Treonina jest najpierw przekształcana w chlorowodorek estru metylowego treoniny, który po krystalizacji przeprowadza się w chlorowodorek amidu działając amoniakiem w środowisku wodnym (0°C). Kolejne etapy polegają na osłonięciu grupy aminowej podstawnikiem benzylokarbonylowym i grupy OH resztą metylową. Następnie: sulfonowanie grupy NH2 ugrupowania amidowego, ekstrakcja jonowymienna. W końcowym etapie gr. NH2 półproduktu acyluje się wykorzystując jedną z metod z zastosowaniem 1) chlorków kwasowych, 2)bezwodników mieszanych, 3)wolnego kw. karboks. i czynnika dehydratacyjnego – DCCI. 5. OTRZYMYWANIE KWASU 7-AC (kwas 7-aminocefalosporanowy) Uzyskiwany jest z cefalosporyny C przez hydrolizę chemiczną wiązania amidowego. Met. chem: Znanych jest kilka metod odszczepienia łańcucha bocznego od cefalosporyny C. 2 najważniejsze to: 1)z użyciem chlorku nitryzolu, 2)u pentachlorkiem fosforu. Znaczenie praktyczne ma jednak tylko met. iminoeterowa, opracowana do otrzymywania 7AP. Zapewnia ona największą wydajność. Sól sodową cefalosporyny C poddaje się sililowaniu w celu osłonięcia grup karboksylowych. Uzyskany dieter przekształca się pod działaniem pentachlorku fosforu w iminochlorek, a ten następnie pod działaniem metanolu w iminoester. Procesy te przebiegają w obecności zasady, która wiąże wydzielający się w r-cji chlorowodór. Wszystkie operacje są przeprowadzane w środowisku bezwodnym. Po hydrolizie iminoestru wyodrębnia się 7AC w pI=3,5. Met. biolog: Z cefalospor C w wyniku biotransformacji i z użyciem oksydazy D-aminokwasowej (deaminujące utlenienie) i amidazy glutarylowej (dekarboksylacja reszty α-aminoadypinowej w cefalospor. C do r. glutarylowej) 6. ANTYBIOTYKI STOSOWANE W WETERYNARII I OCHRONIE UPRAW ROŚLIN. Zwierzęta podobnie jak ludzie są narażone na infekcje bakteryjne, grzybicze, pierwotniakowe i wirusowe. Podaje im się głównie leki o szerokim spektrum, szybkie i skuteczne. Przykłady antyb: Tetracykliny (infekcje układu moczowego, oddechowego), Makrolidoy (infekcje górnych dróg oddechowych, dyzenteria u świń), B-laktamy , Aminoglikozydy, Ampicyliny (infekcje układu moczowego i oddechowego), Erytromycyna (zakażenia wywołane przez pierwotniaki), Nystatyna (p/ grzybowe). Antybiotyki jonoforowe (polieterowe) - tylko dla zwierząt: wytw. przez Streptomyces; przeciw G(+), pierwotniakom, kokcydiom; jako dodatek do pasz; np. Salinomycyna. W wyniku selektywnego działania antybiotyków polieterowych następuje zmiana mikroflory przewodu pokarm. – obserwuje się korzystne zwiększenie kwasu propionowego w tym układzie, kosztem kwasu octowego i masłowego co sprzyja bardziej wydajnej przemianie energii w pr. metabolicznych. Niestety wykazują tez dużą toksyczność. ANTYB. W OCHR. ROŚLIN: Antyb. nieużywane lecznictwie: blastycyna S (uprawa ryżu), ezomycyna (fasola); a także używane w lecz.: streptomycyna (jabłka, gruszki), chloramfenikol (ryż), nystatyna (tulipany).