1. Jakie dwie domeny zawiera każdy czynnik transkrypcyjny?

• domena wiążąca DNA = aktywująca

• domena oddziaływująca z innymi białkami (aktywatorami HAT, represorami HDAC)

2. Jaką rolę pełni CTD?

• C – terminalna domena największej podjednostki polimerazy II RNA

• koordynuje transkrypcję i dojrzewanie pre-mRNA

• oddziałuje zarówno z wyżej położonymi specyficznymi sekwencjami regulatorowymi (UP) w DNA, jak i z białkowymi aktywatorami (CRP)

• ufosforylowany przez czynnik TFIIH umożliwia wyjście polimerazy z promotora i rozpoczęcie syntezy RNA

3. Wymień znane Ci typy zależności między modyfikacjami histonów a aktywnością genów.

• metylacja reszt lizynowych i argininowych, wyciszanie ekspresji genów

• acetylacja reszt lizynowych histonów, zmniejsza ładunek dodatni aminokwasów histonów, co powoduje zmniejszenie powinowactwa histonu do (-) DNA, przyłączenie grupy acetylowej. Może prowadzić do rozpadu struktury nukleosomów poprzez osłabienie oddziaływań między poszczególnymi nukleosomami.

• ubikwitynacja – kowalencyjne wiązanie ubikwityny do H2A i H2B, modyfikacje histonów w rejonach aktywnych transkrypcji

• fosforylacja reszt serynowych w N-końcowych fragmentach histonów, powstawanie chromosomów metafazowych

• deacetylacja – usuwają grupy acetylowe z ogonów histonowych, dezaktywują aktywne rejony genomu, wyciszanie genów.

4. Opisz proces wycinania intronów.

• Są wycinane w splicingu. Proces ma dwa etapy, występują 2 reakcje transestryfikacji.

• I: Wiązanie fosfodiestrowe przed 5’ – G – 3’ (miejsce splicingowe 5’) jest atakowane przez 2’-hydroksy A z sekwencji rozgałęzienia. Tworzy się cząsteczka w kształcie lassa, intron 1 jest wygięty. Tworzy się nowe wiązanie 5’-2’ fosfodiestrowe pomiędzy pierwszym nukleotydem intronu z wewenętrzną adenozyną.

5’--------------GU--------A---------AG-----------------

• II: Rozcięcie w miejscu spilingowym 3’ po G, za sprawą grupą 3’-OH. Przecina wiązanie fosfodiestrowe, uwalnia się intron w postaci lassa i jest degradowany, łączenie dwóch eksonów.

-------------- A----------------AG-----------------

-------------- A----------------AG

• W procesie biorą udział snRNP:

  • U1 przyłącza się do miejsca splicingowego 5’

  • U2 przyłącza się do A

  • U4,U5 i U6 – kompleks przyłącza się do wszystkiego, powoduje zbliżenie końców 5’ i 3’, uwalnia ligazę i powoduje wycinanie (wypętlenie)

5. Argumenty przeciwko stwierdzeniu: 1gen – 1 peptyd.

• dojrzewanie alternatywne pre-mRNA powoduje tworzenie więcej niż 1 rodzaj dojrzałego mRNA

6. Wiele białek regulatorowych (czynników transkrypcyjnych) wiąże się z DNA w postaci dimerów. Dlaczego to jest korzystne?

• czynniki transkrypcyjne wykazują dużo różne aktywności: wiązanie specyficzne z DNA, aktywacja transkrypcji.

• aktywności te można przypisać odrębnym domenom (aktywacyjna i wiążąca DNA)

7. Wymień, które procesy wymagają zajścia rekombinacji.

• replikacja

• mejotyczna losowa segregacja chromosomów

• crossing-over

• naprawa DNA

• konwersja

8. W jaki sposób synteza nieciągła nici opóźnionej nadążą za syntezą nici wiodącej ?

• początek syntezy nici, gdy rozpleciony odcinek osiągnie długość około 1000-2000 nk (100-200 u eukariota) i przebiega 5’ do 3’.

• syntetyzowana w postaci fragmentów Okazaki

• fizyczna orientacja obu nici jest taka sama – nić opóźniona jest zwinięta w pętle w widełkach i odwrócona o 180stopni

• dimer holoenzymu polimerazy DNA III wydłuża obie nici (jedna część syntetyzuje nić wiodąca, druga opóźnioną)

• obecność dwóch polimeraz w jednym kompleksie daje pewność, że nici syntetyzowane są z tą samą szybkością

9. Wymień typy rekombinacji w kolejności od wymagającej najmniejszej do największej homologii rekombinacyjnych sekwencji.

• TRANSPOZYCJA (rekombinacja nieuprawniona, niehomologiczna)

  • proces przemieszczania się transpozonu na inną pozycje w genomie tej samej komórki

  • transpozony – krótkie sekwencje DNA mogące się przemieszczać w każdą pozycję genomu, oskrzydlona sekwencjami powtórzeń prostych na końcach

  • nie wymaga homologii

  • najprostsze są elementy IS (sekwencje insercyjne)

  • transpozaza rozcina na ukos chromosomy DNA i transpozon wbudowuje się w miejsce docelowe, luki uzupełnione przez polimerazę DNA

  • może prowadzić do inaktywacji, delecji, inwersji i innych

• REKOMBINACJA ZLOKALIZOWANA

  • wymiana niehomologicznych, ale specyficznych fragmentów DNA

  • integrazy + IMF – czynnik integracji gospodarza

  • wymaga jedynie krótkich obszarów homologii

  • odpowiedzialna za włączenie faga do chromosomu bakteryjnego katalizowana jest przez białka rozpoznające specyficzne sekwencje DNA

  • nie uczestniczy białko RecA, nie jest potrzebny jednoniciowy DNA

• REKOMBINACJA HOMOLOGICZNA

  • wymiana regionów homologicznych między dwiema cząsteczkami DNA

  • głownie podczas mejozy – crossing over

  • wysoka homologia

  • białko RecA - aktywowane przez ATP, ułatwia jednoniciowemu DNA szybkie przeszukiwanie dupleksu w celu znalezienia identycznych lub podobnych sekwencji, katalizuje wymianę nici w miejscu największej homologii

  • może być zachowana integralność DNA

  • model Robina Hollidaya - rekombinacja ogólna. Dwa homologiczne dupleksy ustawiają się względem siebie w odpowiedni sposób. W każdym z dupleksów jeden łańcuch jest przecinany przez enzym endonukleazę. Powstałe wolne końce opuszczają swój wyjściowy dupleks i łączą się z homologicznymi fragmentami drugiego dupleksu DNA, tworzą intermediat rekombinacyjny. Następnie proces przemieszczania się ramion i przesunięcie punktu krzyżowania się nici. Powstały produkt pośredni tzw. figura krzyżowa Robina Hollidaya może być przycinany i ponownie łączony na dwa sposoby. Przecięcie nici niedokonujących inwazji prowadzi do powstania produktów, których jedna połowa pochodzi z jednego rodzicielskiego dupleksu DNA, a druga z drugiego. Jeżeli przecięciu ulegną dwie, dokonujące inwazji nici, tworzą się cząsteczki różniące się od rodzicielskich jedynie wymienionymi regionami.

  • model Meselsona-Raddinga / model Aviemore - rozpoczyna się od nacięcia pojedynczej nici jednego z homologów, synteza DNA z końca 3^’ odsuwająca koniec 5^’ przerwanej nici. Dokonuje on inwazji nici homologicznej i odsuwa swój nukleolitycznie degradowany odpowiednik tworząc przy tym pętlę D. Ligacja - wytworzenie genetycznie niesymetrycznego połączenia Hollidaya, w którym tylko jedna z podwójnych nici zawiera region heterodupleksowy.

  • model Szostaka - model przerywania obu nici, rozpoczyna się dwuniciowym pęknięciem jednego z homologów. Następnie w wyniku działalności egzonukleazy 5^’ -> 3^’ powstają 3^’ wystające końce, z których jeden dokonuje inwazji homologicznego dupleksu, a następnie odsuwa swój odpowiednik wytwarzając pętlę D. Do końców 3^’ dołącza się polimeraza DNA, która prowadzi syntezę łańcucha, a ligaza odtwarza dwuniciowe struktury, tworząc w ten sposób połączenia Hollidaya.

10. Rola białka RecA w rekombinacji.

• opłaszcza jednoniciowy DNA (ssDNA) niosący końce 5’ nacięć

• ułatwia jednoniciowemu DNA szybkie przeszukiwanie dupleksu w celu znalezienia identycznych lub podobnych sekwencji, katalizuje wymianę nici w miejscu największej homologii

• tworzą się filamenty RecA-ssDNA. Filamenty pochodzące z dwóch dwuniciowych cząsteczek DNA wymieniają się miejscami (crossing-over) i odszukują rejony komplementarne (dokonują inicjacji) w ułożonym obok dwuniciowym DNA

11. Wymień eukariotyczne polimerazy RNA i ich role.

• I – transkrybuje większość genów i rRNA (18S; 5,8S; 28S), występuje w jąderku

• II – transkrybuje wszystkie geny kodujące białka, większość genów snRNA i miRNA

• III – transkrybuje geny tRNA, 5S rRNA, U6 snRNA, snoRNA

12. Które z ogólnych czynników transkrypcyjnych są potrzebne do budowania kompleksów wszystkich trzech eukariotycznych polimeraz RNA?

• TBP – wiąże się z ze specyficzną sekwencją DNA, główna rola w inicjacji transkrypcji

13. Wymień znane Ci rybozymy i podaj ich funkcje.

• samowycinające się introny – z grupy I, II i III wycinają się same w procesie autokatalitycznym

• rRNa – ma aktywność transferazy peptydylowej , tworzy wiązania peptydowe

• snRNA – wycinanie intronów z pre-mRNA

• self-splicing RNA – cięcie i ligacja RNA

• rybonukleaza P – wytwarza końce 5’ bakteryjnych tRNA, pomaga katalizować u prokariota tworzenie tRNa

14. Krótko omów mechanizmy, które kontrolują, żeby dane miejsca startu replikacji zostało użyto raz w każdej fazie S.

• replikacja jądrowego eukariotycznego DNA rozpoczyna się z wielu miejsc startu replikacji jednocześnie - istnieją dwa mechanizmy: pozytywny i negatywny, kontrolujące, które z nich już zostały zreplikowane, a które oczekują na replikację

• mechanizm pozytywny:

  • do każdego m-sca startu replikacji jest stale przyłączony funkcjonalny analog DnaA kompleks białek ORC

  • w fazie G1 w jądrze kumulują się białka Cdc-6 i Cdt-1 (czynniki licencyjne), które wiążą się do ORC i są istotne dla opłaszczenia DNA białkami MCM2-7 o aktywności helikazy

  • tylko DNA pokryte białkami MCM może zostać zreplikowane

  • gdy replikacja się rozpoczyna Cdc-6 i Cdt-1 opuszczają ORC (Cdt-1 ulega ubikwitynacji i rozpadowi w proteosomie), białka MCM rozpraszają się tuż przed postępującymi widełkami replikacyjnymi

• mechanizm negatywny – jądra G2 zawierają przynajmniej jedno białko zw. gemininą, które uniemożliwia (prawdopodobnie przez blokowanie działania Cdt-1) wiązanie się białek MCM do świeżo zreplikowanego DNA; gdy komórka kończy proces mitozy geminina jest degradowana i obie komórki potomne są zdolne do reakcji na czynniki licencyjne i do replikacji swojego DNA w następnej fazie S

15. Opisz wydarzenia poprzedzające u procariota inicjację translacji.

• naładowanie tRNA – dwie reakcje przeprowadzone przez syntetazy aatRNA ( 20 różnych + po jednej na każdy aminokwas – katalizują 2 reakcje i determinują ich specyficzność)

  • aktywacja aminokwasu przez energię pochodzącą z ATP z utworzeniem aaAMP i pirofosforanu

  • energia aaAMP jest zuzywana do przeniesienia aminokwasu na tRNA, powstaje aatRNA i grupa formylowa do fMet-tRNA ( fMet dodawana po naładowaniu)

• dysocjacja rybosomów (dysocjacja po każdej z rundzie translacji), reakcja powolna do asocjacji

  • u E.coli wymaga IF1(promuje dysocjcję) i IF3 ( wiąże się do uwolnionej podjednostki 30S – nie dopuszcza do reasocjacji z 50S)

16. Funkcja mi i siRNA:

• miRNa – jednoniciowa, składnik oparty na RNA, mechanizm regulacji ekspresji genów

  • kodowane przez pol II

  • prekursorem są niewielkie RNA o strukturze sponki do włosów

  • wchodzą w skład kompleksów białkowych (rybonukleinowych) blokujących specjalną translację mRNA

  • nie posiadają 100% identyczności z mRNA

• siRNA – powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji

  • wycinany z dwuniciową dsRNA przez DICER

  • siRNA wiąże się z kompleksem białkowym RISC

  • wiązanie z komplementarnym mRNA

17. W jaki sposób enhancery mogą wpływać na aktywność genów oddalonych o tysiąc zasad?

• do enhancera przyłącza się białko, formacja przestrzenna pozwala na oddziaływanie

18. Czym się charakteryzuje chromatyna genów aktywnych transkrypcyjnych?

• geny te znajdują się w pętlach chromatyny , wrażliwych na DNazę I, dostępnych dla czynników dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii transkrypcyjnej

• obszary mniej upakowane, luźne

• geny aktywne na powierzchni pofałdowanych włókien, które stanowią wyższą strukturę chromatyny

• kompleksy i większe niechromatynowe kompleksy (domeny transkrypcyjne, splicingowe, replikacyjne i naprawy DNA)

• nie występuje metylacja DNA

• pętle łączą się z matriks poprzez rejony bogate w AT (SAR lub MAR)

19. Jakie struktury biorą udział w łączeniu się czynników transkrypcyjnych z DNA?

• czynniki transkrypcyjne są zasocjowane z NM (NM je rekrutuje, ułatwiając ich oddziaływanie z elementami regulatorowymi)

• białka i receptory są związane in situ z MAR

• dynamiczne acetylowane receptory są parowane z transkrypcyjnie aktywnym DNA, enzymy katalizujące acetylację (MAT) i deacetylację (HDAC) są związane z NM

• różne domeny biorą udział w łączeniu się czynników:

  • wyższe (specyficzne): typu helisa-obrót-helisa, palec cynkowy, domeny zasadowe

  • ze względu na domeny dimeryzacji: zamek leucynowy, helisa-pętla-helisa

20. Oprócz parowania zasad z pre-mRNA U6paruje zasady z dwoma snRNA, jakimi?

• U4 i U5 – transkrybowane przez polimerazę II RNA

• dodatkowo U6 przez polimerazę III RNA

• tworzą kompleks i przyłączają się do pre-mRNA przy splicingu

21. Krótko opisz drogi rozpadu RNA

• deadenylacja – utrata końca poliA

• odsunięcie związanych białek

• zniszczenie struktury IIIrzędowej

• cięcia endonukleolityczne

• degradacja z dostępnym końcem przez endonukleazy (5’ do 3’ i 3’ do 5’)

• usunięcie czapeczki

22. Prokariotyczne białka potrzebne do zajścia rekombinacji, podaj ich funkcje.

• RecA – 3 aktywności: wymiany nici, ATPazy, koproteazy (SOS); wymagane do zajścia wszystkich szlaków rekombinacji u E. coli (rekombinacja chromosomów, plazmidów, naprawa rekombinacyjna), wiąże się kooperatywnie do ssDNA – jeden monomer recA na każde 4-6 nt, N-terminalna α helisa monomeru wiąże centralną domenę poprzedniego monomeru, 6 monomerów na jeden skręt filamentu recA promującego wymianę nici

• RecBCD - geny recB, recC i recD kodują 3 podjednostki enzymu RecBCD o 5 aktywnościach: egzonukleazy V, helikazy, endonukleazy, ATPazy, egzonukleazy ssDNA

• RuvAB – bakteryjne białko, bierze udział w migracji rozgałęzienia

• RuvC – endonukleaza, do rozdzielenia struktury Hollidaya

23. Wymień i krótko omów procesy zachodzące w trakcie dojrzewania transkryptu pol RNA III.

• transkrybuje geny 5S rRNA, tRNA i U6 snRNA

• odcięcie sekwencji liderowej przez RNazę P

• usunięcie dodatkowych nukleotydów na 3’ końcu

• dodanie do końca 3’ –CCA- przez transferazę

• usunięcie intronu

24. Opisz rolę snoRNA w dojrzewaniu transkryptów pol I RNa.

• pol I RNA – transkrypcja rRNA

• snoRNA jest potrzebne do przeprowadzania modyfikacji

• nukleotydy, które mają zostać zmetylowane są wyznaczane przez tworzenie par z komplementarnymi zasadami

• modyfikacje zachodzą kotranskrypcyjnie, ułatwiają poprawne fałdowanie

• metylacja 2’-O-rybozy z udziałem CID snoRNA

• modyfikacja urydyn do pseudourydyn z udziałem H/ACA snoRNP

25. Do czego prowadzi rekombinacja między dwoma powtórzeniami prostymi i odwróconymi?

• rekombinacja prosta ---- delecja

• rekombinacja odwrócona---- inwersja (pęknięcie chromosomu w dwóch miejscach i odwrócenie o 180stopni)

26. W jakiej kolejności wiążą się do promotorów czynniki transkrypcjne / kompleksy modelujące chromatynę i kompleksy pol II RNA?

• TFIID (TBP + TFII)

• TFIIA

• TFIIB

• polimeraza RNA

• TFIIF

• TFIIE, TFIIH, TFIIJ

27. Rodzaje intronów.

• introny gr. I – często samowycinające się w formie liniowej, nie wymaga wolnego G nukleotydu, w genach jądrowych

• introny gr. II – często samowycinające się, w postaci pętli, konserwowana struktura III rzędowa, w mitochondriach grzybów, organellach roślin, sinice

• introny jądrowe pre-mRNA – konserwowane sekwencje na końcach eksonów, wycięcie wymaga spliceosomu

28. Opisz elongację translacji.

• podobnie u eukariota i prokariota

• cykliczna – każdy cykl ma 3 etapy i wymaga 2 cząsteczek GTP i 3 czynników elongacyjnych (EF-Tu, EF-Ts i EF-G)

• szybkość 15-200 AA na godzinę

• poprawność 1 błąd na 10 000AA

• dostarczenie aatRNA

• tworzenie wiązań peptydowych

• translokacja

29. Wymień mechanizmy zmienności genomów.

30. Czym się charakteryzują geny fazy S?

• aktywacja spowodowana acetylacją histonów na promotorach

• RG i HDAC powodują deacetylację histonów

31. Czy jeden i ten sam czynnik może być aktywatorem?

• pełni obie funkcje – zależnie od obecności białek

32. Jeśli to możliwe, ponumeruj w kolejności od 5’ do 3’.

• 5’ UTR

• promotor

• miejsce przyłączenia się rybosomu

• nukleotyd, gdzie została przyłączona 7-metyloguanozyna

• kodon START

• początek intronu

• miejsce rozgałęzienia

• koniec intronu

• kodon STOP

• 3’ UTR

• sygnał do poliadenylacji - modyfikacja eukariotycznego mRNA dotycząca końca 3' cząsteczki. Jest to dodawanie szeregu nukleotydów adeninowych zwanego fragmentem poliadenylowym lub poli-A. Po zakończeniu syntezy transkryptu mRNA jest przecinane przez specyficzną endonukleazę w pewnej odległości od sygnału poliadenylacji AAUAAA, a następnie poli-A polimeraza (PAP) dołącza (do końca 3') od 50 do 250 nukleotydów adeninowych. Zabieg taki ma na celu zabezpieczenie cząsteczki mRNA eukariontów przed degradacją zanim zdąży opuścić jądro komórkowe.