Slajd
Mikromacierz DNA to płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnych pozycjach mikroskopowej wielkości polami (ang. spots), zawierającymi różniące się od siebie sekwencją fragmenty DNA. Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA.
Slajd
Zastosowanie mikromacierzy DNA:
Analiza jednonukleotydowych polimorfizmów DNA,
Określenie zmian w poziomie ekspresji genów,
Wykrywanie nowych transkryptów,
Określanie rejonów oddziaływań białko-DNA,
W medycynie(Użycie ich do identyfikacji szlaków metabolicznych, do nowoczesnych terapii molekularnych, do identyfikacji molekularnych mechanizmów toksyczności, do zrozumienia i przewidywania indywidualnej wrażliwości i oporności, do poznawania mechanizmów chorobotwórczych, identyfikacji wskaźników pozwalających na ocenę ryzyka rozwoju chorób oraz określenia nowych obiektów, na których powinno koncentrować się działanie leków)
W farmaceutyce,
W diagnostyce chorób zakaźnych. (wykorzystywane są do detekcji i identyfikacji rodzaju wirusa, a także wykrywania genów odporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych)
Slajd – Nic
Slajd
Mikromacierze cDNA
W mikromacierzach cDNA rolę sond odgrywają fragmenty cDNA , zwykle o długości 0,5-2,0 kbp, będące najczęściej produktami amplifikacji PCR, uzyskanymi z bibliotek cDNA lub zbioru klonów, w reakcji ze starterami specyficznymi dla wektora lub genu. W mikromacierzach cDNA jeden gen na płytce jest reprezentowany przez jeden rodzaj sond naniesionych w formie kropelki – „spotu”, w ściśle określonym miejscu , zdefiniowanym współrzędnymi. Typowa wielkość średnicy spotów wynosi 100-150 μm.
wykorzystują jako sondy długie fragmenty cDNA (od 200 do 600 nuklozydów). Są to najczęściej tzw. krótkie sekwencje ekspresyjne ESTs . Sekwencje takie powstają poprzez izolację odpowiednich transkryptów, syntezę na ich bazie cDNA, a następnie zsekwencjonowaniu końców 3’ i 5’ otrzymanego cDNA.
Sondy stosowane w mikromacierzach cDNA syntezowane są najczęściej poza płytką, a następnie nanoszone na nią w ściśle określonej ilości i stężeniu.
Slajd
Zalety stosowania cDNA:
niekonieczna znajomość sekwencji całego genomu,
niski koszt eksperymentu,
możliwa równoległa analiza dwóch próbek (badanej i kontrolnej) na jednej macierzy,
prosta procedura znakowania i odmywania,
duża elastyczność,
możliwość własnoręcznego zaprojektowania i przygotowania mikromacierzy,
Slajd
Wady stosowania cDNA
prawdopodobieństwo wystąpienia hybrydyzacji krzyżowej,
niezbędna matryca biologiczna do syntezy sond,
czasochłonne przygotowanie sond,
więcej możliwości wprowadzenia błędów (PCR),
problemy z powtarzalnością,
dwuniciowe sondy (konieczność denaturacji, kompetycja wiązania).
Slajd
Mikromacierze cDNA dzielimy na:
Mikromacierze cDNA drukowane na mikropłytkach szklanych
Mikromacierze cDNA drukowane na filtrach nylonowych
Slajd
Mikromacierze oligonukleotydowe
W mikromacierzach oligonukleotydowych sondy stanowią krótkie oligonukleotydy, zazwyczaj o długości 10-25 bp, otrzymane na drodze syntezy fotolitograficznej in situ na powierzchni płytki. W chipach DNA jeden gen jest reprezentowany przez kilkanaście par różnych oligonukleotydów. W tym przypadku wielkość średnicy „spotów” mieści się w granicach 2-20μm. W zależności od ilości spotów występujących na powierzchni, wyróżnia się mikromacierze oligonukleotydowe wysokiej (>10 tys.), średniej (1-10tys.) i niskiej gęstości.
krótkie fragmenty DNA o długości od 20 do 70 nukleozydów. Sondy te syntetyzowane są najczęściej in situ (bezpośrednio na płytce), co zapewnia wysoką gęstość mikromacierzy i umożliwia umieszczenie na niewielkiej powierzchni nawet kilkudziesięciu tysięcy sond
Slajd
Zalety
wysoka specyficzność,
prosta synteza (chemiczna) sond i ich oczyszczanie,
duża powtarzalność,
jednoniciowe sondy (zbędna denaturacja, ograniczenie tworzenia struktur drugorzędowych),
dostępność wielu komercyjnych mikromacierzy, zwłaszcza dla znanych genomów (organizmów modelowych).
Slajd
Wady:
wysoki koszt,
trudności w znalezieniu unikatowych sekwencji w genomie,
duży wpływ składu nukleotydowego sond na proces hybrydyzacji,
konieczna znajomość sekwencji docelowych,
skomplikowany proces projektowania sond
Slajd – nic
Slajd
Przygotowanie materiału do hybrydyzacji:
(Sposób przygotowania materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową zależny od typu przeprowadzanego eksperymentu. Materiał wyjściowy do eksperymentu, którego celem jest porównanie profilu ekspresji genów pomiędzy tkanką badaną, a tkanką kontrolną jest całkowitym RNA. Na bazie wyizolowanego RNA, w reakcji odwrotnej transkrypcji syntetyzowany jest cDNA)
-syntetyzowanie cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji
- powstanie cRNA w wyniku reakcji transkrypcji in vitro
- wprowadzenie zmodyfikowanych nukleotydów z dołączonymi znacznikami fluorescencyjnymi
- fragmentacja i hybrydyzacja z płytką mikromacierzową
Slajd
Znakowanie:
Znakowanie materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową przebiega najczęściej według jednego z dwóch wariantów. W wariancie pierwszym do badanego materiału, wprowadzane są w trakcie reakcji syntezy nukleotydy dUTP lub dCTP związane ze znacznikiem fluorescencyjnym)
Metoda bezpośrednia polegająca na wprowadzeniu nukleotydów dUTP lub DTP i:
a) jednego znacznika fluoroscencyjnego (i hybrydyzacji materiału kontrolnego oraz materiału badanego na dwóch osobnych płytkach. Rozwiązanie takie stosowane są głównie przez producentów macierzy oligonukleotydowych)
b) dwóch różnych znaczników fluorescencyjnych (umożliwia hybrydyzację materiału kontrolnego i materiału badanego na jednej płytce mikromacierzowej. Metoda ta znalazła zastosowanie zwłaszcza w eksperymentach wykorzystujących mikromacierze cDNA, w których porównywanie danych z dwóch różnych płytek może być utrudnione, choć stosowana jest również w mikromacierzach oligonukleotydowych. )
2) metoda bezpośrednia polegająca na fragmentacji badanego materiału i znakowaniu jego końców (Metoda ta wykazuje największą efektywność znakowania dla jednoniciowego DNA, można ją jednak wykorzystać również do znakowania dwuniciowego DNA oraz RNA.)
Slajd
Opis eksperymentu
Badany RNA poddaje się przepisaniu na cDNA (odwrotna transkrypcja), następnie fluorescencyjnie znakuje, hybrydyzuje z DNA immobilizowanym na płytce po czym następuje skanowanie i zbieranie danych. W technice tej wykorzystuje się dwa barwniki fluorescencyjne, najczęściej są to Cy3 i Cy5. Każdym z barwników znakuje się DNA z innej puli, dzięki czemu na jednej płytce można porównywać ze sobą dwie tkanki i analizować różnice w ekspresji poszczególnych genów. Informacje o hybrydyzacji uzyskuje się za pomocą skanera optycznego zapisującego fluorescencję dla każdego punktu mikromacierzy.
Slajd
Opis c.d.
W kolejnym etapie każdemu punktowi przyporządkowana zostaje liczba określająca natężenie fluorescencji. Uzyskane w ten sposób „surowe” dane liczbowe poddawane są najpierw normalizacji lokalnej (w obrębie pojedynczej płytki), a następnie globalnej
(w obrębie wszystkich mikromacierzy składających się na eksperyment).
Na każdym z etapów sprawdza się jakość mikromacierzy wykluczając takie, które mają poważne defekty techniczne. Następny etap zwany jest filtrowaniem genów i ma na celu wybranie tzw. genów różnicujących, których ekspresja zmienia się istotnie w badanych warunkach, oraz odrzucenie tych, które nie dają żadnego sygnału. Na podstawie tak zredukowanego zestawu genów prowadzi się analizy wyższego rzędu, poszukując grup genów o podobnym/odmiennym profilu ekspresji. Na zakończenie uzyskane wyniki poddawane są interpretacji biologicznej, polegającej na powiązaniu obserwowanych zmian w poziomie ekspresji genów z fizjologicznymi bądź patologicznymi procesami zachodzącymi w badanym organizmie.