LABORATORIUM POMIARÓW I KONTROLI W BIOTECHNOLOGII

SPRAWOZDANIE

TEMAT: HPLC

WYDZIAŁ: BIOTECHNOLOGII I NAUK O ŻYWNOŚCI

KIERUNEK: BIOTECHNOLOGIA -stopień II

ROK AKADEMICKI: 2010/2011

DZIEŃ TYGODNIA :Poniedziałek

GRUPA : L2

1. CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest poznanie techniki chromatograficznej HPLC.

2. CZĘŚĆ TEORETYCZNA

Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych

mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu

chromatograficznego.

Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub płyn w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą

(stacjonarną) ciało stałe lub ciecz.

Chromatografia, początkowo niedoceniana, należy obecnie do najbardziej rozpowszechnionych

metod instrumentalnych w chemii analitycznej, a w analizie związków organicznych

zajmuje pozycję lidera (minimum 100 000 związków organicznych). Znanych jest wiele jej

wariantów, a bardzo istotne jest to, że jako nieliczna metoda, umożliwia uzyskanie wyników

jakościowych i ilościowych dla wielu oznaczanych substancji w jednym cyklu pomiarowym, nawet

przy niskich stężeniach i w obecności innych związków.

Klasyfikacji metod chromatograficznych można dokonać według kilku kryteriów. Jednym z

nich jest:

a) Stan skupienia fazy ruchomej

W ten sposób wyróżnić można chromatografię:

 gazową (ang. gas chromatography, GC),

 cieczową (ang. liquid chromatography, LC),

 w fazie nadkrytycznej (ang. supercritical fluid chromatography, SFC).

b) Stan skupienia fazy stacjonarnej

Fazą stacjonarną może być ciecz na nośniku lub ciało stałe. Stąd otrzymujemy następujące

układy chromatograficzne:

Faza ruchoma faza stacjonarna

 gaz ciecz (ang. gas-liquid chromatography, GLC)

 ciecz ciecz (ang. liquid-liquid chromatography, LLC)

 gaz ciało stałe (ang. gas-solid chromatography, GSC)

 ciecz ciało stałe (ang. liquid-solid chromatography, LSC).

Ciało stałe może mieć równy charakter (być adsorbentem, nośnikiem modyfikatora

chemicznego, wymieniaczem jonowym lub sitem molekularnym). Wynikają z tego nowe podziały

związane z naturą zjawisk stanowiących podstawę procesu chromatograficznego.

c) Natura zjawisk będących podstawą procesu chromatograficznego

Chromatografię dzielimy na :

 adsorpcyjną, w której rozdzielanie odbywa się w wyniku różnego powinowactwa

adsorpcyjnego składników mieszaniny do odpowiednio dobranej powierzchni fazy

stacjonarnej, zwanej adsorbentem,

 podziałową, w której rozdzielanie związane jest z różnymi wartościami współczynnika

podziału składników mieszaniny między dwie nie mieszające się fazy, z których jedną

jest faza stacjonarna (ciecz na nośniku), a drugą faza ruchoma (gaz, ciecz lub płyn w

stanie nadkrytycznym),

 jonowymienną, w której podstawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań

międzycząsteczkowych pomiędzy jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą

stacjonarną (zwaną jonitem

 sitową, zwaną inaczej chromatografią żelową, sączeniem molekularnym lub

chromatografią wykluczania, w której o rozdzielaniu składników mieszaniny decydują

rozmiary cząsteczek.

d) Techniki eksperymentalne

Proces chromatografowania prowadzić można techniką:

 kolumnową, stosowaną we wszystkich metodach chromatograficznych,

 planarną, możliwą jedynie w chromatografii cieczowej, którą podzielić można

dodatkowo na chromatografię bibułową i cienkowarstwową.

W zależności od celu przeprowadzanej analizy, wymienione techniki eksperymentalne można

dodatkowo podzielić na: analityczne (identyfikacja analitów, „mała” ilość próbki) i

preparatywne (wyodrębnianie poszczególnych składników).

HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography - wysokosprawna chromatografia cieczowa) - to technika analityczna a także preparatywna, stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych.

Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku, zależnym od właściwości substancji i zastosowanego układu (czasem stosuje się fazę ruchomą) i w formie roztworu o znanym stężeniu i objętości jest kierowana na kolumnę, która wypełniona jest specjalnym złożem porowatym lub żelowym. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej) pełni odpowiednio dobrana mieszanina (tzw. eluent). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. W zależności od zastosowanego układu można wyróżnić kilka mechanizmów retencji, np. te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) a słabiej z fazą ruchomą, przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej ze złożem a silniej z fazą ruchomą przepływają szybciej. W pewnych specyficznych układach HPLC mechanizmy retencji są jednak bardziej złożone.

Całkowitym czasem retencji tR nazywamy czas jaki upływa między wprowadzeniem

próbki a pojawieniem się maksimum piku rozpatrywanego składnika próbki Całkowity

czas retencji jest sumą czasu, w którym substancja oddziałuje z wypełnieniem kolumny i czasu potrzebnego do przejścia tej substancji od dozownika do detektora, gdyby takiego oddziaływania nie było.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. Wysokie ciśnienie w układzie HPLC wynika z budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar), uziarnienia wypełnienia kolumn (kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej stosowanego w aplikacji(od ułamków ml/min do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii preparatywnej). Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC dzięki czemu uzyskujemy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eluenta i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczesnych aparatów i kolumn HPLC są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

Aparaty HPLC składają się zwykle z:

• zbiornika na eluenty, bufory, odpowiednie roztwory płuczące itp.

• automatycznego odgazowywacza, który usuwa gazy rozpuszczone w eluentach (przy chromatografii gradientowej po zmieszaniu składników często następuje samorzutne odgazowanie, przez co w strumieniu eluenta pojawiają się pęcherzyki powietrza mogące silnie zakłócać proces rozdziału na kolumnie i detekcji wymywanych składników)

• zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany skład, co ma szczególne znaczenie w analizach gradientowych (tzw. gradient niskociśnieniowy, gdyż mieszanie składników eluenta następuje przed pompą, czyli w obszarze niskiego ciśnienia). Drugim typem jest tzw. gradient wysokociśnieniowy, gdzie najczęściej stosuje się dwie identyczne pompy dla obu mieszanych składników eluentu (obie pompy zintegrowane są w jednej obudowie), mieszanie następuje za pompami, czyli w obszarze wysokiego ciśnienia. Układ z zaworami proporcjonującymi zazwyczaj umożliwia mieszanie większej ilości roztworów (najczęściej 4, podczas gdy układ wysokociśnieniowy najczęściej 2), w zamian układ wysokociśnieniowy umożliwia znacznie szybszą zmianę składu eluenta (dzięki znacznie mniejszej objętości układu między mieszaczem a kolumną).

• pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluenta w układzie. Pompa zazwyczaj zintegrowana jest w jednej obudowie z mieszaczem (wspomniany wcześniej układ nisko, lub wysokociśnieniowy).

• nastrzykiwacza (iniektora) umożliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu (często zautomatyzowany autosampler)

• odpowiednich filtrów, jeśli aplikacja tego wymaga

• prekolumny, która usuwa z eluenta zanieczyszczenie mechaniczne, które mogłyby zniszczyć wypełnienie kolumn.

• najczęściej stosuje się wypełnienie identyczne lub porównywalne z właściwą kolumną do rozdziału

• kolumny (kolumn) z odpowiednim wypełnieniem

• żel krzemionkowy lub jego modyfikację polarnymi grupami (faza normalna, NP)

• żel krzemionkowy modyfikowany grupami o niskiej polarności (faza odwrócona, RP), najczęściej grupami oktadecylowymi, C18

• wypełnienia polimerowe - bardzo odporne chemicznie, umożliwiają prace w całym zakresie pH, ale ustępują jak na razie możliwościom rozdzielczym wypełnień opartych na żelu krzemionkowym

• termostatu kolumn (pracującego w zakresie najczęściej od 5 do 80 °C)

• detektora - którym może być przepływowy spektrofotometr UV-VIS lub fluorescencyjny, spektrometr mas, laserowy spektrometr rozproszeniowy lub amperometr

• zbiornika na zużyty eluent lub - w przypadku aparatów preparatywnych - kolektora frakcji (systemu naczyń zmienianych automatycznie po upływie zadanego czasu lub sterowanego sygnałami z detektora).

---