Wykład VIII
Zniszczenie struktury II rzędowej helisy jest odwracalne.
Topienie helis - rozrywanie się helis na pojedyncze nici i powrót do stanu helikalnego. Odbywa się w wąskim zakresie temperatur.
Najpowszechniej stosowaną metodą śledzenie procesu topienia jest absorpcja światła UV.
Jeżeli popatrzymy na ekstynkcję molową, czyli absorpcję odniesioną do stężenia molowego, to jest ona różna jeśli kwas tworzy strukturę heliakalną lub nie. Dla struktury heliakalnej absorpcja jest niższa niż dla dwóch niezależnych nici. To zjawisko nazywa się hypochromazją.
Zmieniając więc stabilność przez zmianę temp i śledząc zależność ekstynkcji molowej absorpcji od temp otrzymujemy określoną krzywą topnienia, gdzie w poszczególnych punktach inny jest stosunek procentowy struktury helikalnej i wolnych nici. Temp dla punktu przegięcia krzywej - temp topnienia helisy. Jeżeli helisy są w miarę krótkie z równomiernie ułożoną sekwencją zasad, mamy do czynienia z przejściem „wszystko albo nic”, bez etapów pośrednich, albo helisa albo dwie niezależne nici. Temp topnienia charakteryzuje stabilność helisy. Na podstawie tej temp można wyznaczyć wszystkie parametry termodynamiczne charakteryzujące helisę: entalpię, entropię, itd. Temp zależy od stężenia soli. Im wyższe stężenie soli, tym wyższa temp topnienia. pH podobnie wpływa na struktury heliakalne i sekwencja zasad; wiadomo że temp topnienia jest mniej więcej liniową funkcją procentowej zawartości par GC. W miarę wzrostu ilości par GC, wzrasta temp topnienia.
Śledzenie topnienia może też odbywać się przy zastosowaniu typowych metod kalorymetrycznych:
- do układu dostarczamy ciepło i obserwujemy jak to ciepło jest absorbowane w wyniku przejścia tzw. fazowego.
- różniczkowa kalorymetria przemiatania DSC - mierzy się zależność pojemności cieplnej układu od temp.
Proces topnienia jest procesem kooperatywnym.
Kooperatywność - utworzenie pewnego fragmentu helikalnego sprzyja tworzeniu dalszej części sekwencji. To samo dotyczy rozrywania.
Miarą kooperatywności tego procesu jest rozmycie profilu topnienia. Jeśli proces jest silnie kooperatywny, to topnienie odbywa się w bardzo wąskim przedziale temperatur, z dobrze zdefiniowaną temperaturą topnienia, wtedy mamy „wszystko albo nic”, w całym obszarze jednocześnie zachodzi błyskawiczne rozchodzenie się obu nici, bądź schodzenie. W przypadku mniejszej kooperatywności obszary mniej stabilne (bardziej bogate w pary AT) będą topniały wcześniej, a pary bardziej stabilne później. Wpłynie to na rozmycie topnienia. Temperatura topnienia nie będzie jedną wartością, tylko ciągłym rozkładem temp w pewnym zakresie lub kilka wyraźnych temp topnienia. Można też podać średnie długości odcinków, które topią się jednocześnie. Podobnie jak topnienie, zmiana warunków środowiska może powodować przechodzenie z jednych typów helis w inne, a także w inne typy struktur II rzędowych poza helikalnymi.
Obserwujemy przechodzenie helisy typu B w typ Z stosując 31P NMR. Oligo- lub polinukleotydy w strukturze B będzie się charakteryzować jednym stosunkowo szerokim sygnałem pochodzącym od P. Mimo wszelkich nieregularność struktury typu B, otoczenie chemiczne fosforów w grupach fosforanowych jest podobne, a więc przesunięcia chemiczne tych wszystkich P będą leżały w dość wąskim zakresie. Gdy będziemy zwiększali stężenie soli LiCl przejście do Z będzie jeszcze łatwiejsze. Dodawanie chlorku litu spowoduje powstanie dwóch sygnałów - od fosforów nie równoważnych. Struktura Z DNA ma łamany przebieg łańcucha fosfocukrowego, co oznacza, że F pomiędzy G i C i pomiędzy C i G nie są równoważne. Otoczenia chemiczne nie są takie same. Konformacje G i C w strukturze Z DNA są wyraźnie inne. Usunięcie nadmiaru soli spowoduje powrót do typu B.
Inne struktury II rzędowe
M DNA; w pH ok. 8; jeśli do roztworu B DNA dodamy cynku albo kobaltu (dwudodatnie) wtedy niektóre protony wiązań wodorowych mogą zostać podmienione przez jony metali. Utworzy się struktura dość podobna do B DNA, ale o ciekawych właściwościach - zachowuje się jak przewodzący drut molekularny. Płynie po nim prąd elektronowy.
P DNA; zaproponowana przez Paulinga; łańcuchy fosfocukrowe nawinięte jeden na drugi i schodzą do środka, zasady wychodzą na zew. Osiągana przez manipulację na pojedynczej cząsteczce DNA. Jeżeli cząsteczka DNA w kropli roztworu ma dodatnią superskrętność, to jeżeli jeden koniec cząsteczki DNA plazmidowego przyczepimy do szklanej powierzchni, a na drugim końcu zamocujemy magnetyczny metalowy paciorek, to można magnesem ciągnąc i kręcąc dokonywać rozciągnięć. Metoda manipulacja za pomocą szczypców magnetycznych. Rozciągnięcie i kręcenie o odpowiedniej sile (0,3 pikoniutona) powoduje przejście ze struktury B do P. Jest ona dłuższa o ok. 75%, ok. 2,6 zasady na jeden skręt helisy.
Podobno taka struktura może się tworzyć In vivo w fagu PF1.
A więc struktura heliakalna jest plastyczna
Modelowanie molekularne
Starano się zaprojektować strukturę DNA o większej stabilności. Zaprojektowano 2 typy zasad: XT i XA (detoksy) - dodatkowy pierścień benzylowy. Jeżeli takie powiększone nukleotydy wprowadzi się do sekwencji DNA, to powoduje to destabilizacje helisy. Jeżeli jednak naprzemiennie jedna nić będzie zawierała zasadę powiększoną, a druga nić będzie normalna, to taka helisa jest stabilniejsza - X DNA
Jeżeli do monotonicznego fragmentu poli-dA i poliT dodamy jonów Mg2+, to z dwóch helis podwójnych można otrzymać helisę potrójna (triplex) i pojedynczą nić -> poliTA x poliT + jedna swobodna nić poli-dA.
To samo obserwujemy dla poli-dG i poli-dC pod wpływem Mg2+.
Możliwe wszelkie kombinacje rybo i deoksyrybo, nici mogą być mieszane.
Przy pH obniżonym do 5-6, obserwujemy struktury innego typu: nici poli-dG, poli-dC, mogą się przekształcić w poli-dC+ (dodatnio naładowana cytozyna) i poli-dG x poli-dC.
Dla nici poli-dA i poli-T + poli-dC i poli-dG, otrzymujemy poli-dA+, poli-dC x poli-dG + poli-T.
Takie przejście dotyczą struktur typu homopurynowego, homopirmidynowego, ale nie tylko. Tworzenie nici potrójnej jest ważnym momentem przy wymienia fragmentu nici DNA w rekombinacji. Odbywa się to z udziałem białek i dotyczy dowolnych sekwencji.
Slajd: podwójna nic helikalna, a w dużą bruzdę wchodzi trzecia nić poli-N. Wszystkie 3 nici są równoważne i nieodróżnialne. Trzecia nić tworzy układ wiązań wodorowych typu hooks-in (???)
Możliwe jest oddysocjowanie jednej z nici normalnej helisy i zostaje tylko parowanie typu hooks-in.
Wiązania wodorowe typu Hooksina są silnymi wiązaniami wodorowymi, odległość donor-akceptor nie przekracza 3A, kąty donor-proton proton-akceptor nie odbiegają od 180st. Wiązani liniowe nie odbiegające od liniowości więcej niż o 20 st.
Struktury tetraplex:
Prawie same doeksypirymidyny. W obniżonym pH środowiska cyzotyzna może się naładować, wtedy dwie nici (na obu są C) mogą utworzyć strukturę podwójnej helisy z trzema wiązaniami wodorowymi, z udziałem protonu z protonacji C na jednej z nici. Ukierunkowanie nici jest takie samo - jest równoległa (w normalnej helisie ukierunkowanie antyrównoległe). Takie dwie równoległe helisy podwójne tworzą w sumie helisę poczwórną, gdzie mamy naprzemienny staking dwóch cytozyn z jednej helisy równoległej i dwóch C z drugiej też równoległej, ale skierowanej przeciwnie w stosunku do tamtej. Parametry są zbliżone do struktury typu B DNA. Ta struktura nie ma znaczenia biologicznego.
Struktury bogate w sekwencje G4, T4, G4 (druga niż C4, A4, C4) oraz sekwecje oraz G3, T4, G3). Z dwóch duplexów powstaje struktura typu (G3 T4 G3)x2 oraz dwie nici niekomplementarne typu C3 A4 C3. Powstaje struktura tetraplexu złożona z dwóch nici G3, T4, G3. Strukturę tą trzyma układ wiązań wodorowych typu Hookskina oraz bardzo silny staking. Dodatkowo przy każdej czwórce pomiędzy wiązaniami Hooksina może znajdować się dodatkowy jon stabilizujący K+ Na+.
Podatne na takie sekwencje są telomery, czyli niesparowane końce chromosomu.
Pętla
Może powstać przy osłabieniu struktury, np. przez wystąpienie niekomplementarnych para zasad (miss match) lub przy naprzemiennym występowaniu T i A.
Pętla wewnętrzna - wybrzuszenie jednej nici, zasady wychodzą ze schematu oddziaływania wodorowego, nie stakingują.
Pętla do włosów. Zasady nie oddziałują wodorowo, ale występuje staking, są oddziaływania warstwowe. Taka struktura często występuje w organizmach.
Stabilność zależy od ilości nukletoydow w pętli. Najstabilniejsze pętle DNA mają od 4 do 5 nukl, a RNA od 6 do 7.
Mamy nić DNA, nasz trzon heliakalny. W pewnym momencie jeżeli urwiemy jedną nić, a drugą będziemy ciągnęli dalej w kierunku 3' (zasada fosforan zasada fosforan, itd.), to okaże się, że najbliższa odległość pomiędzy dwoma grupami fosforanowymi na przeciwległych niciach (ok. 12A) mamy w przypadku kiedy łańcuch powiększyliśmy o 3 nukleotydy. Tą lukę możemy zapełnić 1 lub 2 nukleotydami, otrzymując bardzo stabilną pętlę złożona z 4 lub 5 nukletydów. Stabilną, neinaprężoną strukturę typu pętli można otrzymać w ten sposób, że jedna nić ma w dalszym ciągu charakter typu B DNA, a następnie mamy gwałtowny zwrot i zawiązuje luki przez jeden lub dwa nukleotydy. (?????)
Dla RNA jest trochę inaczej, bo ma strukturę typu A. Jeżeli jedna z nici w kierunku 3' urwiemy, a drugą będziemy w kierunku 5' budowali dalej, to okaże się że musimy dobudować 5 nukleotydów, żeby postała przerwa ok. 13A, którą możemy zapełnić 1 lub 2 nukl. Mamy stabilną pętlę taką jak np. w antykodonie tRNA dla Phe.
Mogą się w pętlach pojawić dodatkowe stabilizujące wiązania wodorowe poprzeczne między zasadą a fosforanem.
Pętla w tRNA często określana jako skręt U albo skręt phi (fi)
Struktury II rzędowe dla RNA i DNA są podobne. Różnice pojawiają się na poziomie struktur III rzędowych i wynikają z odmiennych funkcji obu typów kwasów.
DNA tworzy funkcjonalne struktury w połączeniu z białkami (poza wirusami i plazmidami). Dla eukariontów - chromosom w jądrze kom. RNA funkcjonuje samoistnie i bardziej przypomina struktury charakterystyczne dla białka globularne.
DNA jest mniej różnorodny, ale ma mniej różnorodne funkcje.
Nić DNA nawinięta na białka histonowe - tworzy nukleonom. Długość DNA na jednym histonie - ok. 146, 147 bp. Pomiędzy nimi - linkery, odcinki długości kilkudziesięciu bp łączące nukleosomy. Dalsze zwinięcia aż do struktury chromosomu - przed podziałem.
DNA jest bardzo długi. Genom ludzki - ok. 200cm, a więc rząd upakowania w jądrze to 105 razy. U bakterii - 103 razy.
Rozpracowano już strukturę krystalograficzną nukleosomu.
W swobodnym DNA w roztworze można wyróżnić struktury, które będą miały znaczenie funkcjonalne na poziomie struktury III rzędowej. Są to struktury ułatwiające kontakt pomiędzy odległymi fragmentami DNA. Na slajdzie plazmid, strzałkami zaznaczone tzw. formy krzyżowe DNA. Powstają one dzięki sekwencji odwróconego powtórzenia. Mamy środek inwersji i sekwencja w jedną stronę na jednej nici jest taka sama jak w drugą stronę na drugiej nici. Jeżeli w środku między takimi sekwencjami znajduje się obszar bogaty w pary AT, to może utworzyć się pętelka, a te dwie sekwencje dają 2 trzony helikalne, tworzy się struktura typu krzyżowego. W tej strukturze może nastąpić kontakt pomiędzy odległymi w sekwencji fragmentami DNA. Wykracza to poza strukturę II rzędową, jest to element strukturalny, który może się pojawić w natywnym DNA przy tworzeniu str III rzędowej.
Spotyka się również struktury poślizgowe, jeżeli mamy nie odwrócone, a rzeczywiste powtórzenie pewnej sekwencji, wtedy jenda nić może się poślizgnąć na drugiej, utworzą się 2 pętelki. Ta struktura może prowadzić do mutacji frame ship, jeśli te pętelki są potem wycięte przez systemy naprawcze.
Superskrętność DNA opracowana dla swobodnych plazmidów w roztworze wodnym. Mamy koliste DNA dwuniciowe heliakalne, pojawiają się dodatkowe globalne zapętlenia jednej nici w stosunku do drugiej. Wszystkie funkcjonalne DNA w chromosomach nają ujemną suprskrętność. Nie ma tam wprawdzie jak w plazmidach kowalencyjnego połączenia końców, ale fragmenty DNA są trzymane przez histony; po nawinięciu mamy spiralę unieruchomioną na końcach i takie DNA wykazuje superskrętność.
To ile razy jedna nić owija się wokół drugiej nici jest pewną własnością topologiczną DNA i może być opisana przez podanie wartości L czyli topologiczną ilość skrętów.
Lokalna ilość zapętleń nici jest ściśle określona (uwarunkowana strukturą typu A, B lub Z). Jeżeli nie możemy rozciąć DNA i zmienić całkowitej topologicznej liczby skrętów, a wymusimy przez strukturę daną ilość skrętów, to przy narzuceniu tej wielkości muszą pojawić się dodatkowe zapętlenia, tj. pewna ilość superskrętów.
Gdyby przy tworzeniu widełek replikacyjnych nie byłoby żadnych czynników, które ułatwiałyby rozwijanie DNA, to w wyniku rozwijania w jednym miejscu, w innym następowałoby dodatkowe zapętlenie, bo globalna struktura ilości skrętów jest narzucona przez geometrię.
Topologiczna ilość skrętów którą można zmienić rozwijając DNA
Ilość skrętów t wynikająca ze struktury helisy
Ilość superskrętów
Te trzy wielkości są powiązane zależnością.
L = t + B
Zwykle ponieważ DNA jest nawinięte na nukleonom, ma określoną ilość skrętów wynikającą ze struktury helikalnej i określoną topologiczną ilość skrętów i zwykle określoną superskrętność, która wyraża się liczbą ujemną, bo nawinięcie jest przeciwne do ruchu wskazówek zegara.
Można podać stopień superskrętności czyli swobodną strukturę w roztworze wobec struktury nawiniętej na histon. Natywne DNA ma ujemną superskrętność od 0,03 do 0,09.
Stwarza to pewne problemy w interpretacji replikacji DNA, czy jeśli w jednym miejscu rozcinamy, to w innym powstają superskręty. Okazuje się, że istnieją enzymy regulujące ilość superskrętów, tzw. topoizomerazy. Przejściowo rozcinają jedną nić i mogą zmieniać topologiczną ilość skrętów L. Topoizomerazy I tną tylko jedną nić, a topoizomerazy II, mogą ciąć obie nici. Żeby bezkolizyjnie zaszła replikacja kolistego (kowalencyjnie połączonego na końcach) DNA do dwóch niezapętlonych nici potomnych, to trzeba dwie nici rozciąć.
RNA - duże bogactwo struktur III rzędowych.
Określone są motywy strukturalne II rzędowe, które oddziałując ze sobą na różne sposoby, tworzą strukturę III rzędową.
tRNA
struktura liścia koniczyny: 3 szpilki do włosów, fragment heliakalny oraz zmienną pętlę.
W wyniku oddziaływań pomiędzy strukturami II rzędowymi tworzy się globalna struktura III rzędowa. Mamy tu do czynienia ze strukturą typu L, gdzie dwie pseudociągłe helisy znajdują się na jednym ramieniu, na zawiasie. Pseudociągłe, bo ramię typu T i to ramię, do którego jest przyczepiony aminokwas, tworzą w strukturzę III rzędowej nie do końca ciągłą helisę. Te dwa trzony heliakalne tworzą jedną pseduciąhłą helisę. To sięnazywa złącze dwóch helis (na zasadzie pseudociągłej helisy).
Oddziaływania trzymające tą strukturę III rzędową są:
- interkalacyjny staking
- nietypowe wiązania wodorowe
Cytozyna 13 wchodzi pomiędzy już zestakingowaną parę zasad ósmą U i dziewiątą A. Jeżeli dodatkowy pierścień wchodzi pomiędzy już zestakingowane 2 pierścienie, to nazywamy stakingiem interkalacyjny. Ten staking zwykle pojawia się wtdy, gdy mamy połącznie trzech nici: dwóch z parowania Watsona Cricka i trzeciej nici związanej wiązaniami wodorowymi Hooksina. W tym obszarze wyróżniamy również tripletowy układ wiązań.
Te 2 typy oddziaływń wiąża lokalne struktury II rzędowe w globalną strukturę III rzędową.
Jest to możliwe dzięki temu, że ok. 10% nukleotydów w tRNA jest modyfikowanych, co umożliwia tworzenie nietypowych wiązań wodorowych.