Ocena funkcji granulocytów i makrofagowa:
Granulocyty, monocyty i makrofagi stanowiła pierwsza linie obrony org. przed ingerencja obcych antygenow. Usuwaja również z org zniszczone i obumierające komorki, a także kom nowotworowe. Do biologicznych funkcji tych kom należy: zdolność do chemotaksji, fagocytozy i wenatrzkom. zabijania. Biora one przede wszystkim udział w odpowiedzi nieswoistej, gdyz same nie maja zdolności do precyzyjnego rozpoznawania antygenow. Scisle współpracują jednak z odpowiedzia
swoista, co umozliwia im np. eliminacje mikroorg. rozpoznawanych przez przeciwciała. Ponadto dysponuja one określonymi receptorami, które nawet bez udzialu przeciwciał umożliwiają im rozpoznawanie drobnoustrojow
Ocena zdolności kom do chemotaksji:
Chemotaksja to ukierunkowany ruch komorek indukowany gradientem substancji chem., określanej jako czynnik chemotaktyczny, chemoatraktant lub chemotaksyna. Zdolnością do takiego przemieszczania się sa obdarzone przede wszystkim granulocyty, monocyty i makrofagi, ale zjawisko to jest również obserwowane w przypadku limfocytow, fibroblastow, kom. niektórych linii nowotworowych oraz u bakterii i pierwotniakow.
Czynniki chemotaktyczne można podzielic na egzo- i endogenne. Do czynnikow egzogennych naleza subst. pochodzenia bakteryjnego szczególnie takich rodz. jak: E.coli, Staphylococcus, Streptococcus. Wymienia się tutaj także kazeinę oraz szereg syntetycznych peptydow (FMLP).Biologicznie sa jednak ważniejsze czynniki endogenne . Można tu wymienic produkty aktywacji dopełniacza- C3a, C5a, C567. W warunkach laboratoryjnych źrodłem ww. peptydow jest swieza surowica lub osocze aktywowane roznymi subst. (cytotaksygenami), wśród których najczęściej wykorzystuje się zymosan, inuline, kompleksy immunologiczne i bakteryjne endotoksyny.
Duza gr stanowia biomolekuly związane z koagulacją: fibrynogen, fibropeptyd B, kallikreina, płytkowy czynnik IV oraz PAF(czynnik aktywujący płytki). Do silnie działających czynnikow chemotaktycznych naleza niektóre limfokiny np. interleukina-1, interleukina-8 i pochodne kw. arachidonowego, w tym szczególnie leukotrien B4.
Do czynnikow chemotaktycznych oddziałujących na granulocyty oraz monocyty naleza:
uwalniane w trakcie aktywacji dopełniacza fr.; C5a, C3a
uwalniane przez bakterie formylowane peptydy np. FMLP
uwalniane przez monocyty i makrofagi: IL-1, TNF-α, TGF-β, a przede wszystkim IL-8 i inne cytokiny z grupy chemokin
uwalniane przez rozne komorki, w tym rozne przez neutrofile, czynniki tj:leukotrien LTB4 i czynnik aktywujący płytki (PAF)
czynniki uwalniane przez limfocyty T, np. TNF-β
Właściwości chemotaktyczne posiada również wiele innych czynnikow: tuftsyna- tetrapeptyd powstaly w wyniku proteolizy łańcucha ciezkiego γ- globulin, bialko C-reaktywne, α-trombina, kalikreina, a także fragmenty włoknika. Niektóre z tych czynnikow działają chemotaktycznie również na eozynofile, np. czynnik aktywujący plytki, a nawet na limfocyty T, np. TGF-β i IL-8
Metody obserwacyjno- mikroskopowe:
Polegaja one na bezpośredniej obserwacji pod mikroskopem ruchu określonych komorek. Nowoczesne modyfikacje tych metod polegaja na wprowadzeniu roznych technik rejestrowania drogi, która pokonuja wybrane kom w określonych jednostkach czasu. Metody te nie sa stosowane w diagnostyce laboratoryjnej
Metoda okienek skórnych Rebucka:
Pozwala ona oceniac sprawność chemotaktyczna kom. in vivo. Polega na nakładaniu szkiełka nakrywkowego, pokrytego czynnikiem chemotaktycznym, na skaryfikowana skore badanego. Po określonym czasie ocenia się liczbe kom. przytwierdzonych do powierzchni szkiełka
Metoda agarozowa:
Na płytke Petriego wylewa się podłoze odzywcze z dodatkiem 0,75% agarowy. Po zestaleniu plynnego podłoza wycina się w zelu serie potrojnych dośrodkowych studzienek.Do studzienki srodkowej nanosi się zawiesine badanych kom., do zewnętrznej czynnik chemotaktyczny, do wewnętrznej medium lokalne. Płytki umieszcza Siena okres ok. 2,5 godz. w temp. 37°C w atmosferze wzbogaconej 5% CO2, po czym utrwala się przez 12 godz. formalina lub glutaraldehydem. Po delikatnym zdjęciu agarowy plytki płucze się woda destylowana i się suszy. Utrwalone kom. pozostaja na powierzchni szkla. Miara chemotaksji jest odległość pokonana przez kom. w kierunku studzienki z czynnikiem chemotaktycznym, a miara migracji spontanicznej jest odległość przebyta w kierunku studzienki z medium kontrolnym. Pomiar jest dokonywany pod lupa przy pomocy zmniejszonej odpowiednio skali milimetrowej. Obok wartości bezwzględnych chemotaksji (A) i migracji spontanicznej(B), często oblicza się tzw. indeks chemotaktyczny(A/B)
Metoda filtrowa Boydena
Do badania wykorzystuje się specjalna komore podzielona na 2 czesci za pomoca filtra miliporowego, oddzielającego zawiesine badanych kom. od czynnika chemotaktycznego. Filtr dobierany jest w ten sposób, aby jego pory były mniejsze od średnicy badanych kom. Po ikresie inkubacji zlicza się pod mikroskopem kom., które przewędrowały przez pory filtra i przytwierdzily się do jego dolnej powierzchni. Ta metoda ma obecnie wiele modyfikacji (m. mikrokomorowa)
Badanie zdolności fagocytarnych
Fagocytoza zdolność pochłaniania i usuwania z org. mikroorganizmow i obcych subst. przez niektóre kom. Zdolność do fagocytozy posiadaja rozne kom. org. (kom. śródbłonków naczyn, fibroblasty), ale za profesjonalne fagocyty zaczeto uważać makrofagi i granulocyty. Wstępny etap fagocytozy związany jest z rozpoznaniem czast. fagocytowanej przez receptory fagocyta grupy FcR i CR. Obca czast. na zasadzie „zamka błyskawicznego” zostaje pochlonieta przez kom. żerną. Powstaly fagosom przylacza lizosomy kom. tworzac fagolizosom. W tym etapie rozpoczyna się wewnatrzkom. zabijanie i degradacja pochłoniętych czast. na drodze niezależnej i zaleznej od tlenu, związanej z pobudzeniem wybuchu oddechowego kom. zernej.
Metoda probówkowa
W I etapie zawiesine mikroorg. poddaje się opsonizacji, inkubujac je z normalna surowica 30 min. w temp. 37ºC. Nastepnie łaczy się ze soba tak przygotowane mikroorg. i zawiesinę badanych fagocytów w okeslonych proporcjach. Zazwyczaj jest to 10 kom. bakteryjnych, lub 2 grzybicze na 1 fagocyta. Probówki inkubujemy przez określony czas, po czym przerywamy fagocytoze poprzez ich schłodzenie. Po odwirowaniu i przepłukaniu , z osadu kom. sporzadza się rozmazy na szkiełkach. Po wysuszeniu i utrwaleniu wybarwia się preparaty metoda Giemzy i analizuje mikroskopowo obliczając odsetek kom. fagocytujacych i indeks fagocytarny( liczba sfagocytowanych czast./ liczba kom. fagocytujacych)
Metoda 1-warstwowa (monolayer)
Rownolegle prowadzi się opsonizacje czast. fagocytowanych i oplaszczanie badanych kom. na powierzchni szkiełka podstawowego lub otworów płytek hodowlanych. Po delikatnym odpłukaniu szkiełka, pozostaja na nm jedyniemwykazujace duza adherencje do szkla kom. żerne. Pokrywa się je zawiesina opsonizowanych drobnoustrojów i inkubuje. Po określonym czasie fagocytozy preparaty obserwuje się i oblicza jak w met. Probówkowej. Mikroorg. mogą być przed wasciwym testem wyznakowane fluorochromami lub wstępnie podbarwione oranżem akrydyny. Takim przypadku ocenia się preparaty pod mikroskopoem fluorescencyjnym.
Badanie wqewnatrzkomorkowego zabijania (killing)
Polega ono na ocenie zdolności kom. żernych do zabijania pochłoniętych kom. bakteryjnych. W przypadku badania Kiplingu należy używać żywych kultur, najlepiej będących w fazie logarytmicznego wzrostu.
Metoda biologiczna
Polega na ocenie killingu poprzez zliczanie kolonii wyrosłych z niezbitych kom. bakteryjnych na płytkach agarowych. W tym celu leukocyty inkubuje się z zawiesina żywych mikroorg. w podłozu RPMI z dodatkiem 20% surowicy homologicznej lub cielecej. Po inkubacji pobiera się probki zawiesiny i powoduje lizę poprzez dodanie do niej określonych stężeń dezoksycholanu sodu, saponiny lub Trytonu X-100. Z uszkodzonych fagocytów uwolnione zostaja bakterie, które przeżyły wewnątrz Komorek. Próbki wysiewa się ilościowo na podłoza odżywcze dla mikroorg. Po 18 godz inkubacji zlicza się kolonie na plytkach- wyrosłe z żywych mikroorg.; znając liczbe bakterii w wyjściowej zawiesinie ocenia % killingu
Metoda izotopowa
Ta gr metod bazuje na aktywnym wiazaniy tymidyny znakowanej trytem przez bakterie nie pochłonięte przez fagocyty. Mikroorg sfagocytozowane nie mogą związać znaczących aktywności izotopu. W tescie tym można jednoczesnie oceniac fagocytoze i killing. Test jest przeprowadzany w 96 otworach mikropłytkowych. Wstępnie inkubuje się zawiesine opsonizowanych bakterii i fagocytow oraz kontrole- zawiesine samych bakterii. W nastepnym etapie do wszystkich studzienek dodaje się tymidyne znakowana trytem o określonej aktywności, a nastepnie do studzienek przeznaczonych do oznaczania fagocytozy dodaje się podloze, a do studzienek, w których oceniamy Kipling- roztwor detergentu (Tryton X-100 z DNA-za). Po kolejnej inkubacji zawartość studzienek przenosi się na krazki filtrow szklanych metoda „harwesterowania” i po przepłukaniu i wysuszeniu filtrow mierzy się stopien ich radioaktywności w scencylacyjnym liczniku. W metodzie tej oblicza się indeks fagocytarny(PI) i indeks killingu(KI), w przeliczeniu na kom. fagocytujaca wg formuly:
PI lub KI=1- (cpm zawiesinybakterie+ neutrofile/cpm samych bakterii) x stosunek bakterie/neutrofile
% killingu oblicz się na podstawie wzoru: (KI/PI) x 100
Metoda z zastosowaniem wybarwienia kom. oranzem akrydyny
Bazuje ona na obserwacjach , ze bakterie pochłonięte przez leukocyty krwi obwodowej mogą być wykrywane w mikroskopie fluorescencyjnym po przyżyciowym wybarwieniu oranżem akrydyny. Zywe bakterie i jadra fagocytow swieca w kolorze zielonym, a martwe bakterie w kolorze czerwonym. Dodatek do środowiska preparatu roztworu fioletu krystalicznego powoduje wytłumienie swiecenia zewnatrzkom. drobnoustrojów. Stosując te metode można ocenic fagocytoze, licząc wszystkie drobnoustroje, jak również killing znając liczbe martwych bakterii
Ocena wewnątrzkomórkowego metabolizmu fagocytow
Jednym ze wskaźników prawidłowej funkcji fagocytow(neutrofilow) jest ich zdolonosc do generacji rodnikow ponadtlenkowych, zdolnych m.in. do niszczenia pochłoniętych mikroorg. Dooczny tej wewnatrzkom. aktywności metabolicznej wykorzystuje się m.in. pomiar zdolności kom. do wzbudzania chemiluminescencji, do redukcji cytochromu C oraz do redukcji NBT.
Test pochłaniania i redukcji NBT
Proces chemotaksji i fagocytozy powoduje pobudzenie fagocytow wyrażające się przede wszystkim nasileniem aktywności metabolicznej związanej z konsumpcja tlenu(wybuch tlenowy, oddechowy). W przebiegu tych procesow w fagocytach wzrasta poziom nukleotydow NADH i NADPH. Nukleotydy te wykazuja zdolność redukcji pochłoniętego przez kom roztworu NBT- blekit nitrotetrazoliowy, do formazanu. Formazany związki nierozpuszczalne w wodzie, odkładają się w cytoplazmie kom w postaci ciemnoniebieskich złogów. Stwierdzenie zdolności kom do redukcji NBT jest dowodem ich prawidłowej funkcji metabolicznej, niezbędnej m.in. do wewnatrzkom. zabijania pochłoniętych bakterii
Dla oceny aktywności neutrofilow, a szczególnie ich zdolności do wytwarzania nadtlenkow niezbędnych do zabijania bakterii, często stosuje się test redukcji NBT. Związek ten o barwie żółtej, w obecności nadtlenkow ulega w komorce redukcji do formazanu o ciemnoniebieskim zabarwieniu. Test ten polega na dodaniu do krwi heparynowanej NBT. Po inkubacji w 37ºC wykonuje się rozmaz krwi na szkiełku, barwi i oblicza ilość neutrofilow zawierających złogi formazanu. Wynik odnosi się do ogolnej liczby oglądanych neutrofilow. Odsetek kom metabolicznie czynnych u ludzi zdrowych wynosi 9-15%. Znane sa czynniki zdolne do pobudzenia właściwości redukcyjnych, np. lipopolisacharyd oraz niektóre egzotoksyny bakteryjne. Właściwości redukcyjne sa natomiast hamowane przez niektóre srodki przeciwzapalne, np. kortykosteroidy, aspirynę
Test spontaniczny
Polega on na zawieszeniu określonej objętości heparynizowanej krwi zylnej zawierającej badane granulocyty w rownej ilości roztworu NBT. Po inkubacji (20 min w temp. 37ºC) z zawiesiny wykonuje się rozmazy na szkiełkach i po utrwaleniu wybarwia się je safranina. Odsetek Komorek NBT+ oblicza się mikroskpopwo przy powiekszeniu 1000- krotnym.
Interpretacja testu
Prawidłowe wartości testu spontanicznego - do 8% kom NBT+. Wartości wyższe od 14% pozwalaja podejrzewac aktualne wystepowanie infekcji bakteryjnych związanych z drobnoustrojami, tj. Staphylococcus pneumoniae, H. influenzae, Neisseria menigitidis, E. coli i Candida albicans.
W infekcjach wirusowych odsetek Komorek dodatnich może nie ulec zmianie. Wyniki ujemne mogą występować w przypadku przewleklej choroby ziarniniakowej, wrodzonej agammaglobulinemii, SLE i u pacjentow leczonych kortykosteroidami. W przypadku ujemnych lub bardzo niskich wynikow testu spontanicznego, aby zróżnicować czy sa one związane z dysfunkcja systemunfagocytarnego polecane jest wykonanie testu pobudzonego.
Test pobudzony
Fagocyty wstępnie pobudzone lateksem lub endotoksyna, bardzo intensywnie pochłaniają i redukuja NBT. Na szkiełku pokrytym wysuszona endotoksyna umieszcz się duza krople pelnej krwi. Szkiełko inkubujemy w komorze wilgotnej 45 min w temp 37ºC. Po inkubacji skrzep delikatnie spłukujemy. Pobudzone granulocyty pozostaja na szkiełku. Nakraplamy na nie roztwor NBT i ponownie inkubujemy. Nastepnie preparat pluczemy, utrwalamy i zabarwiamy safranina. Liczymy odsetek dodatnich komorek
Interpretacja testu
Wartości prawidłowe testu pobudzonego- 80-90% kom dodatnich. Wartości nizsze niż 40% wskazuja na defekt metaboliczny ( np granulomatoza, przewlekla choroba ziarniniakowi) lub na obecność zakazenia przebiegającego z uszkodzeniem granulocytow.
Test NBT, szczególnie spontaniczny, ze względu na dosc duzy margines bledow- nie może być stosowany jako glowny, lub jedyny do oceny metabolizmu fagocytow.