• Enzymy stosowane w technologii rekombinacji DNA (TR DNA); sondy molekularne.

Enzymy stosowane w rekombinacji DNA:

- endonukleazy restrykcyjne - nacinają określone sekwencje, generując lepkie końce, nacinają te fragmenty DNA , które są palindromowi (czytane od 5' do 3' na każdej nici są takie same)

BAM HI	GGATCC CCTAGG	Baccilus amyloliquae faciens H
Eco RI	GAATTC CTTAAG	E.coli RY13
HpaI	GTTAAC CAATTG	Haemophilus parainfluenca
Taq	TCGA AGCT

- fosfataza alkoholanowa - odpowiada za defosforylację końca 5`DNA i RNA, zastosowanie : usuwanie grup 5`P przed znakowaniem dla uniknięcia samospecyficzności

- nukleaza BAL3 - degradauje końce 3`, 5`, zastosowanie : progresywne skracanie cząsteczki DNA

- polimeraza DNAI(fragment Klebnowa)- Synteza dwuniciowego DNA

Sondy molekularne

• Sonda molekularna - segment 1-niciowego DNA lub RNA uprzednio wyznakowany znacznikiem radioaktywnym (³²P-nick translation) lub biochemicznym (biotyna).

Sonda wykrywa sekwencje komplementarne w obecności dużej ilości niekomplementarnego DNA

2. Wektory w TR DNA, zastosowanie, przykłady.

Wektory

1. Wektorem może być zdolna do autonomicznej replikacji, niewielka cząsteczka dobrze scharakteryzowana fizycznie i genetycznie.

2. Wektor powinien zawierać markery pozwalające na wyróżnienie komórek, w których się znajduje.

3. Cząsteczka DNA stanowiąca wektor powinna mieć miejsce rozpoznania i nacinania przez co najmniej 1 z enzymów restrykcyjnych.

4. Wektory replikujące się niezależnie od organizmu gospodarza nazywane są replikonami.

Zrekombinowane wektory DNA

WEKTOR	POCHODZENIE	WIELKOŚĆ INSERTU [kpz]
Plazmid wielokopiowy	różne plazmidy wielokopiowe	20+
Wektor fagowy λ	bakteriofag λ	30
Kosmid	bakteriofag λ	40
Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC)	duży plazmid bakteryjny	100-300
Sztuczny chromosom drożdżowy	chromosom drożdżowy	100-1000+

Wykorzystanie wektora

W wyniku nacięcia kolistego plazmidu przez endonukleazy np. EcoRI generowane są fragmenty z lepkimi końcami. Nacięci ludzkiego DNA np. również przez EcoRI generuje fragmenty z lepkimi końcami komplementarne do tych bakteryjnych. Są one łączone przez ligazy.

3. Metody wprowadzania DNA do komórki, klonowanie.

Metody wprowadzania transgenu

1. metody fizyczne

• iniekcje bezpośrednie

• `gene gun'

• elektroporacja

• immunoporacja

• transfekcja ultradźwiękowa

1. metody chemiczne

• DEAE-dekstran

• Precypitaty P-Ca

• Lipofekcja

1. metody fizykochemiczne

• transfekcja fotochemiczna

Klonowanie

Klonowanie pozwala na wyprodukowanie dużej liczby identycznych cząsteczek DNA, które następnie mogą być scharakteryzowane bądź użyte do innych celów. Ponieważ większość obcego DNA nie może w komórce ulegać samodzielnie replikacji, dlatego muszą być połączone z wektorem (plazmidowy lub wirusowy DNA), zdolnym do autonomicznej replikacji. Połączone z wektorem cząsteczki DNA wprowadzane są do komórek gospodarza.

Klonowanie w plazmidowym wektorze wymaga tego aby plazmidowy i obcy DNA były rozcięte tym samym enzymem restrykcyjnym. ETAPY:

• rozcięcie kolistego plazmidu za pomocą enzymu restrykcyjnego

• powstaje liniowa cząsteczka plazmidu z kohezyjnymi końcami

• rozcięcie obcego DNA (ten sam enzym, lub różny jeśli powstaną takie same końce kohezyjne)

• zmieszać DNA obcy i plazmidowy

• końce kohezyjne ulegają sparowaniu, połączenie kowalencyjnie za pomocą ligazy DNA

• powstał zrekombinowany DNA plazmidowy,

• wprowadzenie do komórki gospodarza

4. Sekwencjonowanie DNA.

Sekwencjonowanie

1. Przygotowanie określonych fragmentów DNA lub RNA mających znacznik na określonym końcu, tym samym dla wszystkich fragmentów.

2. Drugi koniec również winien zawierać 1 z 4 nukleotydów

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów pozwala na odczytanie sekwencji

4. Fragment o długości 47 pz kończy się G

48 pz kończy się A

49 pz kończy się T

Sekwencja ………GAT…

Podstawowe metody sekwencjonowania

TECHNIKA	WSPÓLNY KONIEC	ZNACZNIK	SPECYFICZNY NUKLEOTYDOWY KONIEC
DNA Maxim&Gilbert	Restrykcyjna endonukleaza	^32P	Specyficzne zasadowo nacinanie chemiczne
DNA Singer	Primer dla polimerazy DNA	^32P lub fluorescencyjne	Zakończenie łańcucha przez dideoksynukleotyd
RNA........	Naturalny koniec RNA	^32P	Nacinanie specyficzne nukleotydowo

5. cDNA - otrzymywanie, zastosowanie.

cDNA - komplementarne DNA, nie zawiera intronów, DNA uzyskany poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA uzyskanego z komórki, jest jednoniciowy. Jednoniciowy jest przekształcany w dwuniciowy i wprowadzany do wektora

6. Organizacja genomu u Eukariota.

Organizacja genomu u Eucaryota

• Sekwencje kodujące stanowią tylko ok. 2% genomu

• Sekwencje powtórzone - satelitarny DNA - mogą być rozproszone lub występować w blokach (tandemowo) ułożonych jeden za drugim.

Podział

• Makrosatelity i midisatelity - zawierają ok. 40 - 5000 par zasad ułożonych tandemowo

• Minisatelity - 9 - 80 par zasad

• Mikrosatelity - 1- 8 par zasad, zwykle ułożonych tandemowo.

Mikro- i mini- satelity charakteryzują się dużą zmiennością osobniczą, polimorfizm pod względem liczby kopii i sekwencji

Klasyfikacja wg Singera

1. SINES - krótkie 130 - 300 par zasad, powtarzające się z reguły tandemowo sekwencje rozproszone

2. LINES - długie 60 - 7000 par zasad, powtarzające się sekwencje rozproszone

Genom mitochondrialny

• Kolisty

• Brak histonów

• Koduje białka mitochondrialne (reduktaza NADH, cyt b)

• Podatny na mutacje

7. Fazy i regulacja cyklu komórkowego: rola cyklin oraz kinaz białowych zależnych od cyklin (cdk); mechanizmy regulujące ich aktywność; substraty białkowe cdk i inhibitory (białka p16, p21,p27); rola białka p110 Rb w regulacji cyklu komórkowego.

CYKL KOMÓRKOWY

składa się z

interfazy okres miedzy podziałami komórki

mitozy okres podziału komórki (faza M)

W interfazie wyróżnia się fazy cyklu

G1 - między końcem mitozy a rozpoczęciem syntezy DNA

S - synteza DNA

G2 - między końcem syntezy DNA a początkiem mitozy

Prawidłowe komórki ludzkie wykazują stałą zawartość DNA związaną z diploidalną liczbą chromosomów (2x23) jedynie w fazie mitozy

• Komórki nowopowstałe po podziale wchodzą w fazę wzrostu zwaną G1, którą cechuje:

• powiększenie jądra komórkowego - przemieszczenie białek z cytoplazmy

• wzrost zawartości RNA - wysoki poziom utrzymuje się w następnych fazach cyklu

• wzrost zawartości białek różnych klas

• synteza cyklin A, C, D i E

• długość fazy decyduje o długości całego cyklu

• w późnej fazie G1 zlokalizowany jest punkt restrykcyjny R

• trwa 6-12 godzin

• Fazę S cechuje synteza DNA chromatyny

• wzrasta masa komórki w stosunku do masy w fazie G1

• rozpoczyna się synteza cykliny B

• odbywa się synteza histonów

• trwa 6 - 8 godzin

• Fazę G2 charakteryzuje tetraploidalna liczba chromosomów

• służy przygotowaniu komórki do mitozy

• syntetyzowane są niezbędne białka wrzeciona podziałowego (tubulina), cyklina B (składnik kinazy fazy M) oraz składniki błony komórkowej

• w późnej fazie G2 następuje aktywacja kinazy białkowej CDK oraz kondensacja materiału genetycznego

• trwa 3 - 4 godziny

REGULACJA CYKLU KOMÓRKOWEGO

W zachowaniu prawidłowości cyklu komórkowego uczestniczą dwa tzw. punkty restrykcyjne

• Pierwszy punkt na granicy faz G1/S

• Kontrola integralności materiału genetycznego

• Wykrycie uszkodzenia w cząsteczce DNA powoduje:

• uruchomienie systemów naprawczych

• zatrzymanie cyklu komórkowego przed przejściem w fazę S

• skierowanie do apoptozy

• Drugi punkt restrykcyjny na granicy faz G2/M

• Kontrola prawidłowej kondensacji i segregacji materiału genetycznego

• Tworzenie wrzeciona podziałowego przed mitozą

Regulacja cyklu komórkowego odbywa się przez uruchomienie kaskady reakcji fosforylacji i defosforylacji białek

• fosforylację bialek katalizują kinazy białkowe

• defosforylację fosfatazy

• substratami kinaz są białka jądrowe i cytoplazmatyczne

• fosforylacji podlegają aminokwasy tyrozyna, treonina i seryna

• aktywacja kinaz zachodzi w obu punktach restrykcyjnych

ROLA CYKLIN I KINAZ

Cykliny, kinazy cdk i ich funkcje

rodziny cyklin	kinaza	funkcja kompleksu
cykliny D1, D2, D3	cdk4, cdk6	fosforylacja w fazie G1
cyklina E	cdk2	fosforylacja na granicy faz G1/S
cyklina A	cdk2	fosforylacja w fazie S/G2
cykliny A i B cyklina B	cdk1 (p34)	fosforylacja na granicy faz G1/S, S/G2 i G2/M
	cdk1 (p34)	fosforylacja na granicy faz G2/M i M

MECHANIZMY REGULUJĄCE AKTYWNOŚC CYKLIN

Aktywacja	Hamowanie
Dołączenie cykliny	Degradacja cykliny
Defosforylacja Tyr14 i Tyr15 przez fosfatazę cdc25	Fosforylacja Tyr14 i Tyr15 przez kinazy wee1 oraz mik1 - hamowanie przejścia domitozy
Fosforylacja Tyr160 przez cdk7-cyklina H	Defosforylacja Tyr160
Odłączenie jednego z endogennych inhibitorów białkowych	Utworzenie kompleksu z jednym z endogennych inhibitorów białkowych

SUBSTRATY BIAŁKOWE

Faza cyklu	Substrat
G1	Czynniki transkrypcyjne: E2F, Sic1, Far1 Produkty genów supresorowych: p53, p105Rb Enzymy: fosfataza cdc25A, polimeraza RNA II
S	Czynniki transkrypcyjne: E2F-1, Swi5 Białko wiążące się z pojedynczą nicią DNA; RPA Duży antygen T wirusa SV40
G2	Czynniki transkrypcyjne : Swi5 Enzymy: fosfataza cdc25C
M	Białka cytoplazmatyczne i jądrowe: lekki łańcuch miozyny, kaldesmon, wimentyna, laminy, histon H1,nukleolina Czynniki transkrypcyjne: EF1, TFIIIB, c-myb Enzymy: fosfataza PP1, kinazy tyrozynowe c-ab1, c-src, kinazy MAP4/MAP1-B Białka pęcherzyków endocytarnych

INHIBITORY CDK

Inhibitory	Białko docelowe inhibitora
Rodzina INK4: p16, p15, p18, p19	Kinazy cdk4 i cdk6
Rodzina Cip/ Kip p21, p27, p57	Wszystkie kompleksy cyklina-cdk
p40, Far1	kinazy cdk2 cdk8

BIAŁKO PRB (P110)

*ulega fosforylacji w czasie cyklu komórkowego

*w formie częściowo ufosforylowanej posiada zdolność łączenia się z czynnikiem transkrypcyjnym E2F, kompleks ten jest stabilizowany przez białka z rodziny DP

*defosforylacja odbywa się w końcowym etapie mitozy i prowadzi do uwolnienia z kompleksu czynników transkrypcyjnych z rodziny E2F co prowadzi do aktywacji transkrypcji

*od wejścia w fazę S aż do późnego okresu fazy G2 białko PRB jest ufosforylowane czyli czynniki transkrypcyjne z rodziny E2F są związane w kompleksie

*zdefosforylowane białko PRB zatrzymuje cykl komórkowy w fazie G1 a ufosforylowane znosi to hamowanie

*białka wirusowe łączą się przede wszystkim

z nieufosforylowaną formą PRB, utworzenie takiego kompleksu hamuje zdolność regulacyjną PRB

8. Kontrola cyklu komórkowego w wyniku procesu transkrypcji i sprzężenia zwrotnego

• Transkrypcja - patrz białko p110 w pytaniu 7

• Sprzężenie zwrotne - patrz białko p53 z mdm w pytaniu 9

9. Znaczenie białka p53 w procesie wzrostu, różnicowania i śmierci komórek

• jest kluczowym regulatorem cyklu komórkowego

• uczestniczy w kontroli integralności genomu

• aktywność biologiczną wykazuje tetramer ufosforylowany, który rozpoznaje ściśle określoną sekwencję DNA czyli zachowuje się jak czynnik transkrypcyjny

• pod koniec fazy G 1 ilość białka P53 rośnie

• przedostaje się do jądra komórkowego

• gdy w DNA pojawia się uszkodzenie ilość P53 w jądrze rośnie powodując zatrzymanie cyklu komórkowego

• maksymalny poziom fosforylacji białka P53 osiągany jest w fazie M cyklu

• 20 min - okres półtrwania prawidłowego białka

• zmutowane białko P53 nie traci zdolności do tworzenia tetrameru z prawidłowym P53, ale traci zdolność do wiązania z DNA czyli nie spełnia roli regulatora transkrypcji

• Niektóre białka kodowane przez onkogeny wirusowe np. antygen T wirusa SV40 wiążą się z domeną oligomeryzującą prawidłowego białka P53 co powoduje obniżenie jego poziomu i przedwczesnego zwolnienia bloku prolifereacyjnego. Rozpoczyna się wtedy replikacja DNA mimo, że nie został jeszcze zakończony proces naprawy DNA, co może prowadzić do powstania mutacji.

Białko P53 w prawidłowej komórce obecne jest w niewielkiej ilości ponieważ ulega gwałtownej degradacji w procesie ubikwitylacji z udziałem białka MDM2 (właściwości ligazy ubikwitynowej)

Aktywność p53 podlega precyzyjnej kontroli z udziałem białka MDM2 na drodze ujemnego sprzężenia zwrotnego

Białko p53 nasila ekspresję genu mdm2, a białko mdm2 tworzy dimer z białkiem p53. Wynikiem jest utrata zdolności indukcji genów przez białko p53 a białko mdm2 wykazując aktywność ligazy ubikwitylowej odpowiada za degradację białka p53.

10. Koncepcja śmierci komórki (nekroza, apoptoza).

Nekroza - proces bierny; następuje w wyniku zakażenia komórki patogenem lub na skutek niedotlenienia, braku substancji odżywczych albo innego rodzaju stresu działającego na komórkę.

Charakteryzuje się stopniową degradacją struktur komórkowych i dezintegracją błony komórkowej, a także pęcznieniem komórki (na skutek dostawania się wody do komórki). W odróżnieniu od apoptozy, nekrozie towarzyszy wydostanie się zawartości komórki do otaczającej ją przestrzeni międzykomórkowej. Powoduje to reakcję zapalną, która może mieć znaczenie patologiczne (nie występuje to na ogół w przypadku apoptozy).

Apoptoza - Programowana śmierć komórki

• jest aktywnym procesem hamowanym przez inhibitory syntezy mRNA (aktynomycyna D) i białek (cykloheksoimid)

• jest następstwem indukcji genów i sekwencji zdarzeń biochemicznych

• odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym organizmu, w odpowiedzi immunologicznej, w hemopoezie, w rozwoju nowotworowym komórek czy wzroście i różnicowaniu

• jest niezbędnym procesem dla utrzymania homeostazy, w którym usuwane są komórki uszkodzone i stare

MORFOLOGICZNE CECHY APOPTOZY

Zmiany w jądrze komórkowym

kondensacja chromatyny

Zerwanie połączeń ze sąsiednimi komórkami

zamknięcie połączeń szczelinowych

przesunięcie chromatyny w kierunku błony jądrowej, która rozpada się, zamyka chromatynę - jądra apoptotyczne

Zmiana w strukturze błony komórkowej

utrata równowagi jonowej - ucieczka wody

zagęszczenie cytoplazmy - kształt kulisty

błona wytwarza pęcherze

Fragmentacja komórki na mniejsze jednostki

powstają ciałka apoptotyczne - ulegają fagocytozie przez makrofagi lub sąsiadujące komórki

• Błona komórkowa

• utrata reszt kwasu sialowego glikoprotein i glikolipidów

• przemieszczenie fosfatydyloseryny

• degradacja białek środbłonowych integryn - odłączenie komórek od macierzy międzykomórkowej

• poprzez receptory integrynowe uruchomiony jest system proteinaz - degradacja filamentów aktynowych wchodzących w skład błony i jej wygładzenie

Wystąpienie apoptozy zależy od:

• sensora wrażliwego na pojawienie się w komórce tzw. sygnału śmierci

• transdukcji sygnału śmierci

• systemu uczestniczącego w dokonaniu się tego procesu

O tym czy komórka uruchamia programowaną śmierć decyduje:

• rodzaj czynnika indukującego

• długość ekspozycji i dawka czynnika stymulującego

• typ komórek stymulowanych do śmierci

• 
  Czynniki wywołujące apoptotyczną śmierć komórki

• czynniki uszkadzające DNA

• czynniki zakłócające cykl komórkowy

• niedobór lub brak czynników wzrostowych

• hipoksja

• hipertermia

• promieniowanie jonizujące

• reaktywne formy tlenu

11. Czynniki uczestniczące w programowanej śmierci: geny śmierci, receptory błonowe oraz ich ligandy, czynniki transkrypcyjne, białka antyapoptotyczne i proapoptotyczne, kaspazy, tyrozynowe kinazy białkowe.

CZYNNIKI UCZESTNICZĄCE W PROCESIE APOPTOZY

• geny śmierci

• receptory błonowe oraz ich ligandy

• CD95-R (FAS-R), TNF-R, TNF-R2, DR3, DR4, DR5 po wewnętrznej stronie błony posiadają domeny śmierci (DD)

• czynniki transkrypcyjne

• NF-κB, E2F, AP-1 (białka Fos i Jun tworzą dimery)

• czynnik transkrypcyjny E2F odpowiada za ekspresję genów uczestniczących w fazie S cyklu komórkowego

• sekwencję rozpoznającą E2F wykazano np. w polimerazie DNA, oraz cdk1

• AP-1 wykazuje silne powinowactwo do sekwencji specyficznej dla receptorów glikokortykoidowych  

• Białka

• antyapoptotyczne: BCL2, BCL-XL

• proapoptotyczne: BAX, BCL-XS, BAK, AIF, APAF  

• endonukleazy : NUC-18, DNaza I aktywowane jonami Ca²⁺, Mg²⁺ oraz DNaza II

• transglutaminazy

• usieciowanie ciałek apoptotycznych z udziałem

ε(γ-glutamylo)lizyny

• γ-glutamylotranspeptydazy, rybonukleazy , calpainy

• calmodulina - Ca²⁺ aktywuje kinazy białkowe, fosfatazy, endonukleazy, transglutaminazy i proteazy

• Ceramidy - powstałe w wyniku hydrolizy sfingolipidów

• Granzym B (proteaza)

• penetruje do komórki poprzez pory utworzone w błonie przez perforynę

• uwalniane z ziarnistości cytolitycznych limfocytów cytotoksycznych po reakcji limfocytów z komórką docelową

• Kaspazy

• enzymy cytosolowe

• proteinazy cysteinowe

• proteoliza - kwas asparaginowy

• egzekutory sygnału śmierci

• degradacja białkowej kinazy DNA (DNA-PK) oraz polimerazy poli-ADP-rybozy (PARP) - uniemożliwia naprawę uszkodzonego DNA

• białko PARP (113 kDa) → 24 kDa oraz 89 kDa

• białko 89 kDa - inhibitor procesów naprawczych, stymulowanych przez białko p53

• Tyrozynowe kinazy białkowe ( Jak,Src)

Flipazy, flopazy

12. Mechanizmy apoptotycznej śmierci komórki: apoptoza wywołana sygnałem wewnątrz komórkowym (z udziałem mitochondrium), czynnikiem zewnętrznym oraz z udziałem czynnika indukującego apoptozę (ApopIF) bez udziału Kaspar

1. Sygnał wewnątrzkomórkowy (z udziałem mitochondrium) :

• Apoptoza indukowana niedoborem czynników wzrostu i regulowana przez rodzinę białek BCL-2

• białka z rodziny BCL-2 mają konserwatywną budowę końca C

• wykazują zdolność do wzajemnego oddziaływania oraz tworzenia homo- i heterodimerów

• umiejscowione są w zewnętrznej błonie mitochondrium, błonie jądrowej, retikulum endoplazmatycznego

• białko BCL-2 współdziała z białkiem BAX w regulacji apoptozy

• białko BCL-2 hamuje apoptozę poprzez

• hamowanie aktywacji proteaz serynowych

• aktywację kinazy Raf, która fosforyluje w blonie mitochondrialnej proapoptotyczny Bad . Fosforylowany Bad nie łączy się z BCL2 i w ten sposób promuje przeżycie

• uczestniczą w budowie porów

• zmiany konformacyjne białek tworzących pory, w tym BCL2 oraz BAX powodują:

• zmiany przepuszczalności błony

• zmiany potencjału transbłonowego

• uwolnienie do cytoplazmy cytochromu c

• cytochrom c łączy się z aktywatorem proteaz APAF1 indukując aktywację prokaspazy 9

• aktywacja kaskady kaspaz

BCL-2 związuje całą pulę BAX

• pozostałe białko BCL-2 ulega dimeryzacji- komórka przeżywa

• nadmiar homodimerów białka BAX - komórka jest kierowana do apoptozy

• białko BCL-X występuje w dwóch formach

• dłuższa - chroni komórkę przed śmiercią

• krótsza - stymuluje do apoptozy

1. Sygnał zewnątzrkomorkowy:

Apoptoza zależna od obecności na powierzchni błony komórkowej receptorów dla TNF, IGF1, a także antygenów dla FAS /APO-1

Mechanizm:

• związanie liganda (trimer) z receptorem zakotwiczonym w błonie, agregacja, internalizacja kompleksu

• oddziaływanie fragmentu receptora przez domenę śmierci (DD) z białkami adaptorowymi

• przekazywanie sygnału decydującego o śmierci komórki lub przeżyciu z białek adaptorowych do białek efektorowych (kaspazy, czynniki transkrypcyjne a także synteza ceramidu)

• TNF-α działa plejotropowo, generuje wolne rodniki w tym podtlnek azotu i indukuje hydrolizę fosfolipidów

• FAS receptor i FAS-L na powierzchni komórek ale rzadko tych samych

• w ekspresji genu kodującego FAS- R i/lub FAS-L uczestniczą białka m.in. interferon γ, NFκ-B oraz białko supresorowe P53

• indukcja ekspresji genów kodujących FAS- R i/lub FAS-L cytostatykami - doksorubidyna, bleomycyna, metotreksat, fluorouracyl, kamptotecyna , cis- platyna - wywołuje apoptozę komórek nowotworowych

• po połączeniu receptora z odpowiednim ligandem sygnał proapoptotyczny jest przekazany do wnętrza komórki, zaangażowane jest białko adaptorowe FADD a efektorem szlaku, w którym uczestniczy FADD jest prokaspaza 8

13. Mikroprocesory DNA- budowa mikroprocesorów, przygotowanie próbek, hybrydyzacja, analiza danych. Zastosowanie mikroprocesorów w medycynie.

Chipy (mikroprocesory) DNA

• Opierają się na hybrydyzacji fragmentów DNA z tysiącami sond umieszczonymi na stałym podłożu (płytka szklana, nylonowa)

Zastosowanie:

• Analiza ekspresji genów (jednoczesna analiza setek a nawet tysięcy genów)

• Genotypowanie, określenie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów

• Sekwencjonowanie DNA

Przygotowanie próbek:

1. Izolujacja mRNA osobnika zdrowego i chorego i przyłączenie do nich znaczników fluoryzujących w odmienny sposób (różne długości fali)

2. Hybrydyzacja z sondami w temp ok. 50^oC - naniesienie na płytkę z setkami sąd

3. Wizualizacja

4. Analiza - dowiadujemy się jakie geny ulegają ekspresji u osoby zdrowej i chorej, a jakie tylko w zdrowego lub tylko u chorego; inrensywność fluorescencji świadczy o stopniu ekspresji danego genu

Praktyczne zastosowanie chipów DNA

• Identyfikacja czynników związanych z patogenezą chorób

• Diagnostyka:

• Poznanie czynników wpływających na skuteczność leków

• Dobór właściwej terapii

Zalety stosowanie chipów DNA

• Umożliwiają określenie ekspresji wielu genów jednocześnie

• Szybko uzyskuje się dużo wyników

• Istnieje możliwość bezpośredniego porównania ekspresji tych samych genów w 2 populacjach komórek (np. chorobowo zmienione - zdrowe)

• Pozwala na identyfikacje podgrup o określonych właściwościach (np. wrażliwość/niewrażliwość na dany lek)

Wady

• Zbyt wiele danych - trudności w interpretacji

• Trudna i żmudna analiza danych

• Niższa niż w innych metodach powtarzalność wyników

• Wysoki koszt

14. Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR) i jej modyfikacje. Zastosowanie PCR do analizy metylacji DNA.

Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction)

• Metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki

• Do reakcji wprowadza się:

• Matrycowy DNA

• Trifosforany deoksyrybonukleotydów

• Startery (primery) oskrzydlające naszą sekwencję DNA

• Termostabilną polimerazę np. Taq wyizolowaną z bakterii Termophilus aquaticus lub polimerazę Pfu z bakterii Pyrococcus furisus

• 3 Etapy, powtarzane 20 - 40 razy

• 95⁰C - denaturacja, pękają wiązania wodorowe, i helisa DNA rozdziela się na 2 pojedyncze łańcuchy

• 50⁰ - 65⁰C - hybrydyzacja starterów

• 72⁰C - synteza komplementarnych nici przez polimerazę Taq

• W I cyklu powstają 2 nici potomne, w II cyklu powstają pierwsze nici o długości odpowiadającej sekwencji oskrzydlanej przez startery. Przy 100% wydajności po n-cyklach reakcji z 1 cząsteczki matrycy otrzymujemy 2ⁿ kopii

Modyfikacje podstawowej PCR

1. Hot start PCR

2. Nested PCR

3. Reverse transcription PCR

4. Real time PCR

5. Multiplex PCR

1. Hot start PCR

• Pozwala na uniknięcie niespecyficznej amplifikacji fragmentów DNA

• Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się nieaktywną polimerazę typu Hot-start, która ulega uaktywnieniu bezpośrednio przed właściwą amplifikacją (najczęściej 15 min inkubacja w temp. 95⁰C przed I cyklem PCR)

• Szczególnie przydatne przy amplifikacji krótkich fragmentów

2. Nested PCR

Zwiększono specyficzność amplifikacji dzięki zastoaowaniu 2 par starterów dla 1 sekwencji DNA

3. Reverse transcription PCR - PCR poprzedzony odwrotną transkrypcją

• Służy do badania ekspresji genów

• Całkowity mRNA przepisywany jest na cDNA, który poddawany jest tradycyjnej reakcji PCR

4. Real time PCR

• Metoda ilościowa, PCR w czasie rzeczywistym

• Detekcja powstałych produktów w czasie trwania reakcji, brak konieczności elektroforezy

• Stosuje się znakowane fluorescencyjnie startery

• Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do ilości produktu w próbie

5. Multiplex PCR

• Jednoczesna amplifikacja kilku różnych fragmentów DNA

• Do jednej mieszaniny reakcyjnej dodaje się kilku par starterów

Zastosowanie PCR do analizy metylacji DNA. - MSP - PCR wrażliwa na metylację

• Rozróżnienie sekwencji zmetylowanej od niezmetylowanej dokonuje się dzięki początkowemu etapowi chemicznej modyfikacji (konwersji) DNA i zaprojektowaniu dwóch par specyficznych starterów.

• Inkubacja r-u DNA w obecności NaHSO₃ prowadzi do konwersji niezmetylowanej cytozyny w uracyl, nie naruszając zmetylowanych cytozyn - powstają dwie sekwencje różniące się obecnością cytozyny (w zmetylowanym DNA) lub uracylu (niezmetylowane DNA) w tych samych pozycjach.

• Zaprojektowanie 2 par starterów -(1) zmetylowane - z guaniną, (2) niezmetylowane - z adeniną.

• Wykonanie 2 różnych PCR z użyciem tego samego, wcześniej zmodyfikowanego DNA

• Uzyskanie produktu tylko w pierwszej reakcji - gen w DNA jest zmetylowany, tylko w drugiej reakcji - gen w DNA nie jest zmetylowany. Uzyskanie produktu w obu reakcjach może świadczyć, że tylko jeden z alleli genu jest zmetylowany.

15. Ocena jakościowa i ilościowa DNA (analiza spektroskopowa). Elektroforeza kwasów nukleinowych.

Jakościowa : chipy (mikroprocesory) DNA

Metody izolacji DNA z materiału biologicznego

1. Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (mieszanina fenol/chloroform/alkohol izoamylowy)

2. Wysalanie

Etapy izolacji DNA

1. Homogenizacja tkanki, rozkład błon przy użyciu detergentów

2. Rozkład białek (polimerazaK)

3. Usunięcie RNA (trawienie nukleazą A)

4. Kilkukrotna ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym

5. Wytrącanie zimnym etanolem/izopropanolem w obecności Na⁺

6. Rozpuszczanie DNA w jałowej wodzie lub buforze TRIS-EDTA

. Właściwości spektroskopowe kwasów nukleinowych

• Zasady purynowe i pirymidynowe absorbują prom. UV

• Max absorpcji przy 260nm

• Efekt hipochromiczny: dwuniciowe kwasy nukleinowe wykazują niższą wartość absorpcji niż odpowiadające im stężenie kwasu jednoniciowego

Spektroskopowe oznaczanie stęż kwasów nukleinowych w roztworach

• Wartość A₂₆₀ jest proporcjonalna do zawartości DNA w roztworze

• Dla 2-niciowego DNA o stężeniu 1 mg/ml A₂₆₀ = 20

• Miarą czystości roztworu DNA jest stosunek A260/A280. Optymalnie powinien wynosić 1,8 - 2,0

• Wartość A₂₈₀ wskazuje na stan zanieczyszczenia białkami, fenolem.

. Elektroforeza DNA

• Rozdział fragmentów DNA zachodzi pod wpływem przyłożonego napięcia

• Dna jest polianionem, wędruje w kierunku elektrody +

• Ruchliwość fragmentów DNA zależy głównie od ich wielkości

• Do rozdziału stosuje się żele agarozowe lub poliakryloamidowe (większa rozdzielczość)

Etapy elektroforezy

1. Przygotowanie żelu (rozpuszczenie agarozy, wylanie na płytkę)

2. Przygotowanie próbek DNA

3. Naniesienie próbek DNA

4. Przyłożenie napięcia - migracja

5. Wizualizacja - bromek etydyny (interkaluje DNA)

Nakładanie badanych próbek DNA

• Każdą z prób miesza się z barwnym buforem obciążającym, który zapobiega wyciekaniu prób ze studzienek i umożliwia wzrokową obserwację przebiegu elektroforezy.

• Wizualizacja:

• Bromek etydyny - interkaluje DNA, wbudowuje się między sąsiadujące płasczyzny dwuniciowego DNA, wykrywa nanogramy DNA

• AgNO3 - bardzij czuły, wykrywa pikogramy DNA

• Znakowanie izotopami lub luminoforami

16. Techniki elektroforetyczne stosowane w analizie białek; znaczniki białkowe

Elektroforetyczne metody analizy białek

• należą do najpowszechniej stosowanych metod biologii molekularnej, z uwagi na ich wysoką rozdzielczość, krótki czas wykonywania analizy, prostotę i niskie koszty

• wykorzystują zdolność białek do migracji w polu elektrycznym z różną prędkością, zależną od masy cząsteczkowej rozdzielanego białka i jego ładunku

• jako podłoża wykorzystuje się żele agarozowe, poliakryloamidowe i skrobiowe

Elekroforeza w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących (z SDS)

• mieszaninę białek rozpuszcza się w siarczanie dodecylu (SDS); ten anionowy detergent niszczy niemal wszystkie oddziaływania niekowalencyjne w natywnych białkach

• w celu zredukowania wiązań disiarczkowych dodaje się także merkaptoetanol lub ditiotreitol

• aniony SDS wiążą się z łańcuchami głównymi w stosunku 1 anion na 2 reszty aminokwasowe, nadając powstałemu kompleksowi ze zdenaturowanym białkiem ujemny ładunek wypadkowy, w przybliżeniu proporcjonalny do masy cząsteczkowej białka

• kompleksy SDS ze zdenaturowanym białkiem poddaje się elektroforezie, na ogół na pionowo ustawionych płytach z żelem poliakryloamidowym (kierunek: od góry do dołu)

• małe białka poruszają się w żelu szybko, natomiast duże zatrzymują się na górze, blisko miejsca nałożenia mieszaniny na żel

• rozdzielone białka można wybarwić srebrem lub barwnikiem typu błękit Commassiego, natomiast znakowane radioaktywnie białko można zlokalizować metodą autoradiografii, umieszczając na żelu błonę rentgenowską

Zastosowanie elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS

• do analizy mas cząsteczkowych białek i liczby polipeptydowych podjednostek w obrębie białka

• do oszacowania stopnia czystości badanej próby

• metoda szybka, czuła i o dużej rozdzielczości

Ogniskowanie izoelektryczne

• jest techniką o wysokiej rozdzielczości, pozwalającą na rozdział białek o bardzo złożonej budowie

• wykorzystuje zjawisko punktu izoelektrycznego, tj. takiej wartości pH, przy którym wypadkowy ładunek białka wynosi zero; z chwilą znalezienia się w takim pH cząsteczki białka zatrzymują się

• technikę tę można prowadzić na żelach agarozowych jak i poliakryloamidowych

• pozwala na rozdział białek różniących się pI o 0.01, tzn. tylko jednym ładunkiem wypadkowym

Elektroforeza dwukierunkowa

• polega na rozdziale cząsteczek z zastosowaniem dwóch metod rozdziału

• żel rozdzielamy wg jednej z metod np. ogniskowania izoelektrycznego, obracamy o 90^o i prowadzimy rozdział w drugim kierunku z zastosowaniem np. elektroforezy z SDS

• w pierwszym przypadku rozdzielamy białka w oparciu o ich punkt izoelektryczny, a w drugim o ich masę cząsteczkową

ZNACZNIKI BIAŁKOWE

• biotyna - posiada wysokie powinowactwo do białek: streptawidyny i awidyny, łącząc się z nimi z wysoką stałą wiązania

• znaczniki enzymatyczne - najczęściej w ich skład wchodzą enzymy katalizujące reakcję przejścia bezbarwnego substratu w barwny produkt absorbujący światło, np. fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa i β-galaktozydaza; enzymy do przeciwciał mogą być przyłączane w sposób bezpośredni jak i pośrednio, np. za pośrednictwem biotyny i streptawidyny

• radioizotopy - najczęściej izotopy fosforu, siarki i jodu

• fluorochromy - kumaryna, fluoresceina, rodamina

Zastosowanie znaczników białkowych

• w zależności od tego w jakim celu chcemy znakować białka należy dobrać odpowiedni znacznik

• znaczniki enzymatyczne - badania immunohistochemiczne, testy ElISA i Western blot

• radioizotopy - testy RIA

• znaczniki fluorescencyjne - wysokorozdzielcze testy immunocytochemiczne

17. Immunoprecypitacja

Proces, w wyniku którego peptydy lub białka oddziaływujące specyficznie z przeciwciałem są usuwane z roztworu i badane w kierunku ich cech fizycznych (pI, masa cząsteczkowa).

ETAPY PRECYPITACJI

• znakowanie białek np. ³H-metioniną (znakowanie metaboliczne), J białek powierzchniowych

• liza komórek w celu uwolnienia badanego antygenu przy wykorzystaniu odpowiedniego buforu lizującego pozwalającego wydajnie uwolnić antygen i rozpoznać go przez przeciwciało

• tworzenie kompleksu przeciwciało-antygen

• precypitacja kompleksu przeciwciało-antygen poprzez dodanie przeciwciała związanego z odpowiednim białkiem (białko G lub A)

• analiza elektroforetyczna

Prawidłowa precypitacja zależy od dwóch czynników:

• wystarczającej ilości antygenu w badanej próbie

• powinowactwa przeciwciała do antygenu

18. Zasada i zastosowanie techniki Western blotu

• jest najprostszą metodą stosowaną w immunodetekcji białek, polegającą na przeniesieniu białek z żelu poliakryloamidowego na stałe podłoże

• umożliwia analizę badanego białka zarówno biochemiczną, jak i immunologiczną

• dzięki wysokiej czułości umożliwia detekcję antygenów w ilości poniżej 1 µg

Technika blottingu składa się z trzech etapów:

• rozdział elektroforetyczny białek w żelu poliakryloamidowym z SDS

• przeniesienie (transfer) białek z żelu na błonę (elektrotransfer)

• wykrywanie utrwalonych na podłożu białek metodami immunoenzymatycznymi

(Zasada testu immunologicznego

• przyłączenie przeciwciała swoistego dla interesującego nas antygenu do płytki z polimeru, takiego jak polichlorek winylu

• nałożenie kropli ekstraktu komórkowego, próbki krwi lub surowicy

• utworzenie kompleksu antygen-przeciwciało i przemycie płytki

• dodanie drugiego przeciwciała znakowanego radioaktywnie lub fluorescencyjnie i ponowne przemycie

• ilość związanego przeciwciała jest proporcjonalna do ilości antygenu w próbie )

19. Metody detekcji kompleksu antygen - przeciwciało

Metody immunoenzymatyczne dzielimy na: jedno- i dwustopniowe

Etapy metody jednostopniowej:

• związanie białka ze specyficznym przeciwciałem I-rzęd., np. mysim

• wykrycie mysich przeciwciał za pomocą II-rzęd. przeciwciała związanego z enzymem katalizującym reakcję barwną np. peroksydazą chrzanową

• dodanie substratu odpowiedniego dla peroksydazy (1-chloro-1-naftolu)

• utworzenie charakterystycznych prążków w miejscu reakcji katalizowanej przez enzym sprzęgnięty z II-rzęd. przeciwciałem

Etapy metody dwustopniowej:

• używamy biotynylowanego II-rzęd. przeciwciała

• inkubacja kompleksu antygen-I-rzęd. przeciwciało-II-rzęd. przeciwciało-biotyna w roztworze streptawidyny lub awidyny sprzężonych z fosfatazą zasadową

• dodanie odpowiednich substratów dla fosfatazy zasadowej

• utworzenie kolorowego precypitatu

20. Chromatografia powinowactwa

• wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne i wykazujące duże powinowactwo wiązanie się białka z inną cząsteczką, nazywaną ligandem

• ligand jest wiązany kowalencyjnie z obojętnym chemicznie i porowatym nośnikiem np. Sepharozą

• mieszaninę białek przepuszcza się przez kolumnę z unieruchomionym ligandem; określone białko wiąże się z ligandem, natomiast pozostałe przechodzą swobodnie przez kolumnę

• kolumnę przemywa się intensywnie buforem, aby usunąć niespecyficznie związane białka

• białko wiążące się z ligandem uwalnia się z kolumny dwoma sposobami: przez przemycie kolumny roztworem zawierającym ligand w wolnej postaci, który współzawodniczy z unieruchomionym ligandem o wiązanie z białkiem, lub zmieniając właściwości buforu (zmiana pH lub stężenia soli)

• chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, często wyjątkowe właściwości białka, umożliwia więc jego wyodrębnienie z mieszaniny kilkuset białek w trakcie pojedynczego etapu chromatograficznego

21. Laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (MALDI) - zasada, etapy i zastosowanie.

• białka wyekstrahowane z komórki lub tkanki rozdziela się za pomocą elektroforezy dwukierunkowej; uzyskuje się dwukierunkową mapę plamek białkowych zawierających kilka tysięcy różnych białek

• pojedyncze plamki wycina się następnie z żelu i trawi proteazami, takimi jak trypsyna, w celu uzyskania zestawu peptydów charakterystycznych dla danego białka

• dokładną masę cząsteczkową każdego peptydu określa się następnie przy użyciu spektrometrii masowej typu MALDI, uzyskując swoisty wzór mas cząsteczkowych peptydów badanego białka

• w metodzie tej próbki, w tym przypadku peptydy i białka, są wspólnie krystalizowane z matrix na płytce MALDI

• płytka po wysuszeniu jest umieszczana w komorze próżniowej spektrometru masowego MALDI

• następnie płytka jest poddawana działaniu pulsującego promienia laserowego, co powoduje transfer matrix do fazy gazowej

• faza gazowa pod wpływem silnego pola elektrycznego, wytworzonego poprzez przyłożenie wysokiego napięcia do płytki MALDI, przenoszona jest z kolei do sprzężonego z MALDI MS, spektrometru masowego (TOF) mierzącego czas przelotu próbki przez wyznaczony odcinek drogi w komorze TOF

• w komorze analizowane cząsteczki rozdzielają się podczas przesuwania się w kierunku detektora; cząsteczki o mniejszej masie osiągają detektor szybciej niż cząsteczki o większej masie

• detektor mierzy docierające do niego w czasie badania jony peptydowe i tworzone jest widmo odzwierciedlające współczynnik masy do ładunku analizowanych peptydów (m/z)

• gdy wielkość masy odpowiada standardom o znanej masie i ładunku, czas przelotu danego jonu może wskazywać jego masę

• następnie masa ta porównywana jest z bazą danych przewidywanych wzorów mas cząsteczkowych peptydów, opracowaną dla wszystkich znanych białek zidentyfikowanych na drodze analizy sekwencji DNA wielu organizmów

• badania te są wysoce zautomatyzowane, co pozwala na możliwość identyfikacji wielu białek proteomu danej komórki i zrozumienie jak funkcjonują komórki oraz jak funkcje te zmieniają się podczas choroby

• są one obiektem olbrzymiego zainteresowania przemysłu farmaceutycznego, związanego z poszukiwaniem nowych białek będących celem działania nowych generacji leków

22. Metody identyfikacji osobniczej (RFLP,VNTR).

Genetyczny odcisk palca (fingerprint) to charakterystyczny obraz genomu indywidualnej osoby

( VNTR i RFLP)

RFLP- polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

VNTR- różna liczba tandemowych powtórzeń =polimorfizm liczby tandemowych powtórzeń -kod paskowy

23. Zastosowanie analizy DNA w poradnictwie genetycznym.

Jedna z możliwości zastosowania analizy DNA w diagnostyce klinicznej jest poradnictwo genetyczne.

Specjalizuje się ono w :

•Diagnostyce prenatalnej i preimplantacyjnej

•Wykrywaniu heterozygot

•Określaniu ryzyka urodzenia dziecka obciążonego genetycznie

•Prognozowaniu przebiegu choroby

•Ustaleniu skutecznej terapii na podstawie diagnozy

24.Diagnostyka molekularna dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) i mukowiscydozy.

MUKOWISCYDOZA:

Model dziedziczenia: autosomalny recesywny

Zmutowany gen: CFTR

Objawy: postępujące uszkodzenie płuc, trzustki i jelit, lepki śluz, podwyższony poziom chlorków w pocie i ślinie

•Zidentyfikowano ponad 200 różnych mutacji prowadzących do mukowiscydozy

•Częstość i rodzaj mutacji są różne w poszczególnych populacjach

•Mutacja delta F 508 (delecja jednego kodonu w genie CFTR) występuje u około 70% pacjentów rasy białej. W Polsce występuje w 50% przypadków mukowiscydozy

Perspektywy terapii genowej w mukowiscydozie:

Komórki docelowe w terapii: komórki nabłonka płucnego

•Stosowane wektory: retrowirusy i adenowirusy

•Sposób podania: inhalacja aerozolu zawierającego zrekombinowane adenowirusy

DMD

Gen DMD jest największym poznanym genem człowieka

•Dziedziczenie sprzężone z płcią (1/3000 noworodków płci męskiej)

•Objawy: postępujący zanik mięśni

•Mutacje (delecje kilku lub kilkunastu eksonów) prowadzące do braku dystrofiny w mięśniach (postać letalna) lub do zmniejszenia ilości dystrofiny (dystrofia Beckera)

• Aktywność każdego z promotorów prowadzi do powstania innej formy dystrofiny. Istnieje więc wiele odmian dystrofiny kodowanych przez gen DMD

•Promotory:

- C; kora mózgowa, hipokamp

- M; mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy

- L; limfocyty

- R; siatkówka oka

- G; większość tkanek oprócz mięśni

•Alternatywne składanie transkryptu

•Kotranskrypcyjne składanie mRNA dystrofiny

25. Czynniki kwalifikujące chorobę genetyczną do terapii genowej; przykłady defektów genetycznych, w których możliwe jest podjęcie prób terapii genowej.

Terapia genowa polega na wprowadzeniu do organizmu pacjenta genu prawidłowego w przypadku występowania w organizmie genu o upośledzonej funkcji.

CZYNNIKI KWALIFIKUJĄCE:

•Choroba dziedziczona recesywnie jednogenowo

•Wysoka śmiertelność i częstość występowania

•Brak odpowiedniego skutecznego leczenia

•Zlokalizowanie defektu genetycznego wywołującego chorobę

•Możliwość transferu genu do komórki z defektem

•Ocena ryzyka terapii genowej

PRZYKŁADY CHORÓB:

hemofilia A

hemofilia B

mukowiscydoza

dystrofia mięśniowa Duchenne'a

31. Techniki biologii molekularnej w optymalizacji leczenia nowotworów

A.PCR (i jego liczne warianty)

1) otrzymywanie genów do terapii genowej

2) wykrywanie kwasów nukleinowych; chorobotwórczych wirusów, jako dowód infekcji danym czynnikiem (np. HPV16, prątek gruźlicy);

3 )wykrywanie polimorfizmów genów związanych z konkretną chorobą;

4) wykrywanie mutacji genów (np. BRCA1 w raku sutka, p53 w wielu nowotworach);

5) wykrywanie ekspresji receptorów np. hormonalnych;

ocena poziomu ekspresji genów

(np. odpowiedzialnych za produkcję enzymów biorących udział metabolizmie ksenobiotyków);

7) diagnostyka i ocena ryzyka przerzutu

w materiale biologicznym o bardzo małym stężeniu komórek nowotworowych (np. rak jelita grubego, czerniak złośliwy).

B.Metody immunologiczne

1) lokalizacja genu na chromosomie,

np. hybrydyzacja in situ (wybór markera, prognostyka, leczenie nowotworów);

2) Blotting - wykrywanie obecności i określanie względnej ilości specyficznego DNA, RNA lub białka;

3) Immunohistochemia, np. oznaczanie poziomu białka (produktu ekspresji danego genu) dla znalezienia korelacji poziomów DNA-RNA-białko.

C.Trawienie DNA (restrykcja)

1. otrzymywanie genów do terapii genowej;

2. wybór markera dla danego nowotworu (RFLP).

D. Genotypowanie

(różne metody biologii molekularnej zatrudnine w celu identyfikacji, lokalizacji genów i wariacji w ich obrębie).

E. Inżynieria genetyczna

1. metody transgeniczne - głównie badania naukowe (zwierzęta knock-in/knock-out)

2. terapia genowa

3. terapia rekombinowana

4. wektory ekspresyjne (np. terapia antysensowna, wprowadzanie rybozymów, siRNA do komórek).

1. Szczepionki” w chorobach nowotworowych.

Szczepionki genetyczne

Podawane również po wystąpieniu objawów chorobowych mają na celu wywołanie odpowiedzi immunologicznej na antygeny nowotworowe.

Otrzymywanie:

Szczepionki komórkowe- komórki pobrane z organizmu pacjenta, zmodyfikowane genem immunomodulacyjnym.

Szczepionki przeciwko ściśle zdefiniowanym antygenom nowotworowym. Geny kodujące antygeny nowotworowe lub wirusowe wprowadzane są ex vivo do komórek prezentujących antygen (komórek dendrytycznych) lub in vivo do komórek mięśniowych.

Szczepionki genetyczne mogą być stosowane jedynie we wczesnych stadiach rozwoju nowotworów, w późniejszych etapach mamy bowiem do czynienia z klonami komórek, które nie są rozpoznawane przez układ immunologiczny.

2. Definicje: olignukleotydy antysensowne, olignuklukleotydy antygenowe, rybozymy, deoksyrybozymy, siRNA, aptamery i gapmery.

3. Mechanizmy działania oligonukleotydów antygenowych, oligonukleotydów antysensownych i siRNA rybozymów i aptamerów (podobieństwa i różnice).

Strategia antysensowych oligonukleotydów zakłada hamowanie biosyntezy niechcianych białek na drodze asocjacji antysensowego konstruktu do wybranych i ściśle określonych sekwencji pre-RNA, zaburzając jego składanie. Następuje również hybrydyzacja z wyselekcjonowanym fragmentem dojrzałego mRNA (blokując fizyczny dostęp do rybosomu bądź tworząc heterodupleks rozpoznawany i degradowany przez RNA-zę H - enzym degradujący mRNA skompleksowany z DNA). Antysensowe konstrukty oligonukleotydowe stanowią 12-30-merowe fragmenty DNA bądź ich analogi.

Obecnie sprawdzane możliwości zastosowania terapii antysensowej dotyczą głównie:

∙ onkologii klinicznej,

∙ angioplastyki naczyń wieńcowych,

∙ chorób neurologicznych,

∙ leczenia niektórych chorób wirusowych i pasożytniczych.

Oligonukleotydy są to krótkie fragmenty DNA lub RNA, które można stosować w celu

zahamowania syntezy lub zmiany działania pewnych niepożądanych białek

Oligonukleotydy hamujące syntezę białek podzielić możemy ze względu na ich

specyficzne właściwości na 3 klasy

1 - oligonukleotydy antysensowne wiążące się z komplementarnymi fragmentami mRNA

kodującego sekwencje aminokwasowa tych białek

2 - oligonukleotydy antygenowe - wiążące się z komplementarnymi fragmentami DNA i

tworzą struktury 3-niciowe

3 - oligonukleotydy o właściwościach katalitycznych = tzw. rybozymy - posiadają one

właściwość katalizowania degradacji komplementarnej nici mRNA ( uniemożliwia wiec

wytworzenie mRNA w procesie transkrypcji i tym samym nie pozwala na ekspresje na

białka )

Wspólna cecha tych 3 klas oligonukleotydów to zdolność asocjacji (czyli łączenia się)

z komplementarnymi fragmentami DNA lub RNA i blokowanie ekspresji informacji

genetycznej (czyli po prostu nie pozwalają na wytworzenie białek w procesie

translacji blokując go albo na wczesnym etapie albo nawet jeszcze wcześniej wcale

nie dopuszczając np. do transkrypcji.)

4 - Istnieje jeszcze jedna klasa oligonukleotydów - oligonukleotydy o właściwościach

APTAMERÓW - jedno lub dwuniciowe kwasy nukleinowe, których trojwymiarowa struktura umożliwia selektywne rozpoznanie różnych cząsteczek (białek), wiążą się one bezpośrednio z określonymi białkami hamując ich działanie

( właśnie to odróżnia je od poprzednich klas, które co prawda blokują białka, ale

zwykle po prostu nie pozwalając na ich wytworzenie przy czym blokując transkrypcje

blokują wytworzenie wielu, a nie tylko jednego białka natomiast o. aptameryczne

działają bardzo specyficznie i wybiórczo na określone, konkretne, docelowe białko )

Rybozymy - Katalityczne cząsteczki RNA zdolne do degradacji / ligacji własnego szkieletu fosfodiestrowego.

Mechanizm katalityczny rybozymów:

Rybozym rozpoznaje sekwencję komplementarną docelowego mRNA poprzez hybrydyzację typu Watsona - Cricka. Po przyjęciu aktywnej konformacji w kompleksie dochodzi do degradacji wiązania fosfodiestrowego w nici mRNA. Tworzy się kompleks rybozymu z produktami degradacji. Kompleks ten ulega rozdysocjowaniu, dając produkty reakcji, oraz uwolniony rybozym zdolny do następnego cyklu katalizy.

Rybozymy typu hammerhead:

- małe, specyficzne, prosty mechanizm rozszczepiania

- skuteczniejsze od antysensów

• wydajność (1 cz: kilka cz docelowych)

• stała inaktywacja genu

• teoretycznie niższe stęzenie terapeutyczne

• specyficzność

Wprowadzanie rybozymów do komórki

Egzogenne- elektroporacja, iniekcja, liposomy

Endogenne- wektory ekspresyjne

Rybozymy w lecznictwie :

K-Ras	Rak trzustki (b trudny w diagnozie i leczeniu
BARD 1	Rak piersi
Bcl-2	Proces apoptozy
Her2/Neu	Nowotwory jajnika
IGF II	Rak prostaty

DEOKSYRYBOZYMY

Definicja:

1 niciowe cząsteczki DNA zdolne do samodzielnej katalizy różnych przemian chemicznych

tzw enzymy DNA = DNAzymy

siRNA

najnowsza grupa leków

ok. 22- nukleotydowe odcinki RNA wprowadzone do komórki docelowej

tzw potranskrypcyjne wyciszanie genów = PTGS vs tzw transkrypcyjne wyciszanie genów =TGS

GAPMERY to mieszane oligonukleotydy, w części centralnej mają DNA lub pochodne tiofosforanowe, a końce 3' i 5' zbudowane są z modyfikowanych nukleotydów.

Gapmery łączą zdolność indukcji RNAzy H z podwyższoną opornośćiąna nukleazy i zwiększonym powinowactwem do RNA.

Gapmery - niższe ryzyko indukcji rozkładu mRNA częściowo komplementarnego.

Mechanizm działania antysensów :

-13 pz (RNA) - 17pz DNA (wyst 1x w genomie)

- inhibicja mRNA przez hamowanie transportu mRNA z jądra

-hamowanie splicingu

- zahamowanie translacji

• zawada przestrzenna (nie może się przyłaczyc rybosom)

• aktywacja Rnazy H (-> destrukcja docelowego mRNa )

„Nie-antysensowne” działanie antysensów:

-sekwencyjno specyficzne

silne stymulowanie systemu immunologicznego przez sekwencje typu CpG lub [ggg]n np. spadek ilości płytek, hepatotoksyczność

- sekwencyjno niespecyficzne

tylko przy wysokim stężeniu antysensu

aktywacja układu dopełniacza

trombocytopenia

spadek proliferacji komórek

Aptamery są to cząsteczki kwasów nukleinowych, peptydów wykazujących

wysokie powinowactwo i specyficzność wiązania ze ściśle określonymi biomolekułami

np. białkami

Aptamer

może wiązać się z docelowa cząsteczką ponieważ jego struktura przestrzenna pasuje do

kształtu owej cząsteczki.

Połączenie następuje poprzez stosunkowo słabe wiązania nie kowalencyjne min. wiązania

H-H, siły Van der Waalsa , oddziaływania elektrostatyczne czy tez hydrofobowe.

Aptamery to jednoniciowe oligonukleotydy DNA lub RNA, selekcjonowane in .Pełnią one funkcje nukleinowych ligandów zdolnych rozpoznawać specyficznie i wiązać z wysokim powinowactwem cząsteczki docelowe. Aptamery potrafią rozpoznawać nawet bardzo podobne strukturalnie molekuły. Podlegają również łatwo chemicznym modyfikacjom, jak znakowanie radioaktywnymi izotopami, konjugowanie z barwnikami fluorescencyjnymi i enzymami czy poprawianie biostabilności. Ze względu na swoje właściwości aptamery mogą konkurować z przeciwciałmi o miano uniwersalnych receptorów i być wykorzystywane jako narzędzie rozpoznania molekularnego w metodach diagnostycznych.

Rybozym rozpoznaje sekwencję komplementarną docelowego mRNA poprzez hybrydyzację typu Watsona - Cricka. Po przyjęciu aktywnej konformacji w kompleksie dochodzi do degradacji wiązania fosfodiestrowego w nici mRNA. Tworzy się kompleks rybozymu z produktami degradacji. Kompleks ten ulega rozdysocjowaniu, dając produkty reakcji, oraz uwolniony rybozym zdolny do następnego cyklu katalizy.

siRNA (small interfering RNA) - dwuniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 20-25 par zasad, które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji .Powstają przez pocięcie dwuniciowego RNA (np. wirusowego) w komórce przez enzym Dicer na fragmenty odpowiedniej długości. Krótkie siRNA wiążą sie z kompleksem białkowym o aktywnosci rybonukleazy zwanym RISC. Kompleks ten wiąże się z komplementarną do siRNA cząsteczką mRNA i tnie ją na kawałki, uniemożliwiając w ten sposób powstanie kodowanego przez nią białka. Sekwencja siRNA jest w 100% homologiczna z sekwencją docelowego mRNA

Powstałe siRNA wraz z wyciszającym kompleksem RISC uczestniczą w reakcji degradacji homologicznego mRNA. Kompleks RISC wiąże preferencyjnie jedną z nici siRNA. Jednoniciowy siRNA łączy się na zasadzie komplementarności z docelową sekwencją mRNA. Endonukleaza (wchodząca w skład RISC) przecina powstałe dupleksy mRNA/siRNA, a dalsza degradacja zachodzi pod wpływem działania egzonukleaz . Po zdegradowaniu docelowej cząsteczki RNA, RISC zostaje uwolniony i może być ponownie wykorzystany w procesie RNAi.

32. Kwasy nukleinowe ( przykłady chorób/genów), które potencjalnie mogą być/są stosowane w terapii

pegaptanimb - to aptamer, inhibitor VEGF (czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego), stosowany w zaniku ciała żółtego,

fomivirsen - to antysensowny oligonukleotyd przeciwwirusowy (cytomegalowirusy) zastosowany w zapaleniu siatkówki wywołanym cytomegalowirusem u chorych na AIDS

oblimersen - antysensowny oligonukleotyd, inhibitor białka Bcl-2 stosowany w czerniaku złośliwym, białaczce limfatycznej, szpiczaku mnogim

33. Budowa i właściwości optymalnego oligonukleotydu antysensownego

Idealny antysensowy oligonukleotyd powinien:

∙ przenikać przez błonę komórkową tak, aby dotrzeć do wyselekcjonowanej sekwencji,

∙ selektywnie hybrydyzować do sekwencji RNA, by zminimalizować ewentualne niespecyficzne działanie toksyczne,

∙ być opornym na działanie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów nukleolitycznych,

∙ nie oddziaływać z białkami komórkowymi.

Trwałość antysensowego oligonukleotydu determinowana jest głównie odpornością na działanie endo- i egzonukleaz, które powodują szybką degradację obcego DNA poprzez rozszczepianie wiązań fosfodiestrowych. Cel ten jest realizowany poprzez modyfikacje chemiczne tego wiązania, polegające np. na zastąpieniu atomu tlenu w internukleotydowym wiązaniu fosforanowym atomem siarki lub grupą metylową.

Czynniki warunkujące efektywność:

• zdolność do wnikania do komórki

• oporność na nukleazy

• specyficzność

• stabilność hybryd

• małe powinowactwo do białek

• aktywacja RNazy H1

• brak toksyczności

37. Definicja organizmu transgenicznego. Cechy GMO.

Organizm modyfikowany genetycznie=GMO (ew.GEO) ≈ organizm transgeniczny

Organizm niosący obcy gen lub modyfikacje genetyczną, która w normalnych warunkach nie występuje w danym gatunku i mający zdolność przekazywania tego genu lub modyfikacji następnym pokoleniom.

Organizm transgeniczny- organizm, który dzięki metodom laboratoryjnym wzbogacił się trwale i dziedzicznie w nowy gen lub geny

Cechy organizmu transgenicznego

• Obcy DNA przyłączony w sposób trwały.

• Trwale zmodyfikowany dowolny gen

• Modyfikacja genetyczna powstała w sposób celowy

• Wprowadzony lub zmodyfikowany gen podlega dziedziczeniu

38. Transgeneza a klonowanie - porównanie, wspólne płaszczyzny zastosowań.

Transgeneza a klonowanie

Transgeneza - trwałe umieszczenie nowej informacji genetycznej podlegającej dziedziczeniu. Także modyfikacja genetyczna organizmu.

Klonowanie - uzyskiwanie zespołu komórek identycznych pod względem genetycznym (o identycznym genomie)- może być wykorzystywane w GMO

39. Otrzymywanie organizmów transgenicznych: etapy procesu; pojęcie konstruktu DNA (kasety ekspresyjnej DNA); możliwości włączania się transgenu do genomu (rekombinacja nieuprawniona, rekombinacja homologiczna), selekcja rekombinantów za pomocą markerów pozytywnych i negatywnych; metody wprowadzenia transgenu (przykłady wektorów, plazmid Ti, przykład zastosowania strategii antysensu; mikroinjekcja do przedjądrza, przykłady genów reporterowych, metoda z użyciem „STEM CELLS” - definicja ES, klonowanie somatyczne, transpozomy, biobalistyka )

Otrzymywanie organizmu transgenicznego

Zasadnicze etapy:

• Konstruowanie transgenu

• Połączenie z wektorem naprowadzającym, klonowanie konstruktu DNA

• Ocena ekspresji transgenu i selekcja wektora z włączonym transgenem.

• Integracja transgenu z genomem biorcy

• Transfer do matek zastępczych

• Analiza DNA i selekcja potomstwa.

2 formy transgenu:

- DNA genomowy- introny + egzony (dłuższy)

-cDNA- same egzony

Konstrukt DNA (kaseta ekspresyjna DNA)

______________________________________________












Transgen może się włączać w sposób przypadkowy na zasadzie rekombinacji nieuprawnionej

lub w sposób celowy na zasadzie wymiany odcinków homologicznych występujących w miejscach sobie odpowiadających.(rekombinacja homologiczna)

Tworzymy kasetę ekspresyjną z odcinkiem homologicznym do genu modyfikowanego. Stosuje się geny markerowe: pozytywne - „jak ja ciebie mam to przeżyję” i negatywne - „jak ja ciebie mam to nie przeżyję”. Za pomocą tych markerów można likwidować geny, które nie włączyły odpowiedniego odcinka podczas modyfikacji.

Metody wprowadzania transgenu- uzyskiwanie GMO

1. Użycie zrekombinowanych wektorów

• krótkie odcinki DNA:

Przykłady: plazmid wielokopiowy, sztuczny chromosom P1(PAC), plazmid Ti(rośliny), wektor fagowy λ, kosmid, sztuczny chromosom P1(PAC), sztuczny chromosom bakteryjny (BAC), sztuczny chromosom drożdżowy (YAC)]

• blokada ekspresji genu antysensowym cDNA :

stosuje się komplementarny, antysensowy cDNA, powstają dwie nici komplementarnego mRNA, które mogą tworzyć dimer, ale nie mogą podlegać translacji (hybrydyzacja mRNA z antysensownym mRNA=brak syntezy białka) np. wyciszanie genów odpowiedzialnych za produkcję O2 w owocach

• wykorzystuje się głównie w przypadku roślin

2. Mikroiniekcja do przedjądrza

• wymaga przeprowadzenia naturalnego zapłodnienia in vitro, materiał genetyczny wstrzykuje się do komórki (zwykle do przedjądrza męskiego). Nie ma w tej metodzie ograniczeń gatunkowych, duża wydajność, ale brak selekcji wybranych komórek

3. Użycie pierwotnych komórek zarodkowych - Stem Cells - ES

• Możliwość hodowli i selekcji in vitro

• Komórki totipotencjalne

• Można je wprowadzać do jam zarodków myszy

• W warunkach in vitro można selekcjonować komórki

• Powstaje mysz chimeryczna, mająca cechy 2 matek

4. Klonowanie somatyczne

• Jądra komórek somatycznych umieszcza się oocycie pozbawionym własnego jądra

• Może być stosowana u ssaków

5. Transpozony

• Odcinki chromosomów, które potrafią się z nich wycinać i wielokrotnie wstawiać do innych chromosomów

• Stosowana głównie od uzyskiwania transgenicznych owadów, może być stosowana u ssaków

6. Biobalistyka

• Wprowadzanie DNA

• Stosowana głównie do otrzymywania transgenicznych roślin

40. Zastosowania GMO: przykłady poprawy cech użytkowych roślin i zwierząt; pojęcie „pharmingu”, przykłady; owady transgeniczne - idea likwidacji przenosicielstwa chorób zakaźnych; metoda SIT; zastosowania GMO w transplantologii; ksenotransplantacje; jadalne szczepionki

Zastosowanie GMO

• Poprawa niektórych cech użytkowych

• Produkcja pożądanych związków chemicznych (bioreaktory, „pharming”, transgeniczne organizmy probiotyczne)

• Jadalne szczepionki (rośliny)

• Likwidacja przenosicieli chorób zakaźnych (owady)

• Ksenotransplantacje (tworzenie dawców organów)

• Modele badawcze

Biotechnologia.

• Zielona - związana z roślinami

• Biała - związana z przemysłem

• Czerwona - związana z farmacją

• Niebieska - związana z ekologią

Poprawa cech użytkowych roślin i zwierząt - przykłady

• Rośliny asymilujące N2 z powietrza z genem Rhizobium sp.

• Zwierzęta hodowlane ze zmodyfikowanymi genami wzrostu (świnie, karp, łosoś)

• Pomidor o podwyższonej zawartości likopenu

• Rośliny uprawne odporne na wysoką zawartość soli mineralnych w glebie

• Soja z genem orzecha brazylijskiego, o wzbogaconym składzie aminokwasowym

• Kukurydza, soja i bawełna z genem Bt (odporna na szkodniki i owady)

• Kawa bezkofeinowa - wyciszony gen CaMXMT1

Produkcja leczniczych substancji chemicznych przez GMO (Pharming = Pharmaceutical Farming): np. krowa produkująca w mleku leki białkowe( laktoferyna), których nie można otrzymywać syntetycznie;

Produkcja leczniczych substancji chemicznych przez zwierzęta transgeniczne:

ZWIERZĘ	LEK	ZASTOSOWANIE
owca	AAT	Rozedma płuc
koza	tPA	Udar mózgu
owca	czynnik VIII	Hemofilia
owca	czynnik IX	Hemofilia
świnia	hemoglobina	Suplementacja
krowa	laktoferyna	Zaburzenia gospodarki Fe

Owady transgeniczne

Tworzenie transgenicznych owadów wymaga wstawienia genu (niebieski) przenoszonego przez transpozon(czerwony), np. Hermes, do zapłodnionego jaja. Nowy materiał genetyczny jest umieszczany w nukleoplazmie biegunowej, części jaja, z której powstają następne komórki jajowe przyszłej dojrzałej samicy….

Ksenotransplantacje (świnie)

Przeciwciała anty-α Gal. przyłączają się do komórek i uruchamiają kaskadę dopełniacza.

Przeciwdziałanie:

- zmiana białek receptorowych z Galfuksyna

-dodatek inhibitorów kaskady dopełniacza

Jadalne szczepionki

Zalety:

• Możliwość lokalnej i taniej uprawy, dostosowane do profilu gospodarczego regionu

• Możliwość reprodukcji z nasion uzyskiwanych z własnej uprawy

• Ominięcie barier logistycznych, typu transport na długie odległości lub surowe wymagania do przechowywania

• Łatwa droga podania- tańsza i bez ryzyka infekcji w porównaniu do infekcji

• Szczepionki na gruźlicę, polio i ospę, głównie w krajach rozwijających się. Rośliny: ryż, soja, szpinak, sałata.

41. Modele transgeniczne w badaniach naukowych: cele stosowania modeli TG; sposoby wprowadzania transgenów w zależności od rodzaju modelu (modele z nadekspresją, modele typu „knock-out”, modele z genem reporterowym, modele odtwarzające mutacje); przykłady najbardziej popularnych modeli TG („Smart Mouse”, modele do badań metabolizmu ksenobiotyków, „Onco Mouse”, modele do wykrywania mutacji in vivo)

Transgeniczne modele badawcze

• Najczęściej modyfikowane są myszy.

Zalety myszy:

• Małe rozmiary, szybkie, niezależne od sezonu cykle rozwojowe

• Wytrzymałe na krzyżowanie wsobne

• Istnienie i dostępność bardzo licznych odmian genetycznych

• Stosunkowo duża wydajność transgenezy

• Duża plenność

• Długa historia hodowli i dostępność szczegółowych protokołów hodowlanych

Etapy badawcze

Hipotezy oparte na badaniach populacyjnych

Eksperymenty in vitro oraz in vivo

Wyznaczenie celów molekularnych

Badania funkcjonalne

TG

Cele stosowania modeli TG

• Poznanie funkcji genów in vivo

• Poznanie interakcji czynnik chemiczny - gen

• Tworzenie modeli chorób

• Projektowanie modeli do badan farmakologicznych i toksykologicznych

• Uwrażliwienie zwierząt na ksenobiotyk

• Zwiększenie wrażliwość na ksenobiotyk

• Upodobnienie metabolizmu ksenobiotyków zwierząt do ludzkiego.

• Badanie efektów toksycznych, kancerogennych związków chemicznych

Techniki tworzenia modeli TG

• Wprowadzanie nowych genów (głównie metoda mikroiniekcji)

• Osiąganie nadekspresji wybranego genu (głównie metoda mikroiniekcji)

• Homologiczna wymiana lub nokautowanie genów (technika ES)

• Odtwarzanie mutacji występujących u ludzi (technika ES)

• Kierowanie ekspresją transgenu (topograficzne i czasowe)

• Warunkowo indukowana promotorem modyfikacja genu (np. badanie funkcji BRCA)

Przykłady zastosowania w badaniach - modele transgeniczne::

• Geny reporterowe - obrazowanie ekspresji transgenu (fluoryzacja organizmu z genem kodującym GFP meduzy)

• Geny markerowe - informują czy dany gen został włączony do genomu

Pytanie: Co to są geny markerowe i reporterowe? W jakim celu się je stosuje?

• Osiąganie nadekspresji genu (Smart Mouse) - badanie funkcji receptora NMDA u myszy, leczenie stanów otępienia u ludzi

• Modele do wykrywania mutacji in vivo - stosowanie genów reporterowych: Muta Mouse®, Big Blue®

• Modele transgeniczne w badaniach metabolizmu ksenobiotyków (nokautowanie genów).

Modele ze znokautowanymi genami:

• CYP 1A2- wydłużenie okresu półtrwania kofeiny

• CYP 2E1- hepatotoksyczność paracetamolu

• 
  CYP 1B1 proces kancerogenezy skóry

• CYP 1A1

Modele TG w badaniach kancerogenezy:

- Nokautowanie genów supresorowych (np. p53)

- Wstawianie lub aktywacja onkogenów (np. białko RAS)

(onkoMouse- mysz o podwyższonej podatności na indukcję kancerogenezy; aktywowany r-Haras i/lub nokautowany p53)

- Badanie interakcji typu gen - kancerogen

(w przypadku nokautu p53, zarówno myszy homozygotyczne jak i heterozygotyczne wykazują zwiększoną zapadalność na spontaniczny rozwój nowotworu; zastosowanie niektórych kancerogenów przyśpiesza rozwój nowotworów-działają na inne geny, poza p53; działanie niektórych kancerogenów nie przyśpiesza rozwoju nowotworów - w tym modelu działają na p53)

-Badanie interakcji gen - gen

(np. badanie aktywacji czynnika transkrypcyjnego wraz z aktywowanym antygenem)

42. Zagrożenia związane ze stosowaniem GMO.

• Alergeny

• Toksyny

• Obniżona jakość pokarmu

• Rozprzestrzenianie się transgenu w środowisku (Trojane gene)

• Zmniejszenie bioróżnorodności

• „Super chwasty”

• Uzależnienie organizmu od człowieka (rośliny niepotrafiące się rozmnażać)

• Migracja międzygatunkowa wirusów (np. PERV)

Wzrost oporności drobnoustrojów na antybiotyki

19

5`IIII

promotor

sekwencja sygnałowa

gnałowe

sekwencja genu AAA 3'

sekwencja wzmacn.

---