NAJWAŻNIEJSZE MECHANIZMY OPORNOŚCI BAKTERII GRAM-DODATNICH
NA ANTYBIOTYKI

MECHANIZMY OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI β-LAKTAMOWE

Rodzaj Staphylococcus

U gronkowców wyróżnia się dwa mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe:

- wytwarzanie β-laktamaz, co skutkuje opornością na penicyliny naturalne, ampicylinę, amoksycylinę i ureidopenicyliny (np. piperacylinę) i tikarcylinę. Produkcja β-laktamaz ma zazwyczaj charakter indukowany, czyli zachodzi w obecności antybiotyku β-laktamowego.

Szczepy wytwarzające β-laktamazę, ale wrażliwe na metycylinę, są wrażliwe na tzw. penicyliny przeciwgronkowcowe, takie jak metycylina (obecnie nie stosowana), nafcylina oraz penicyliny izoksazoliowe (oksacylina, kloksacylina, dikloksacylina, flukloksacylina), a także na cefalosporyny (gł. I i II generacji), penicyliny z inhibitorami i karbapenemy.

- oporność na metycylinę - warunkowana jest obecnością nowego białka wiążącego penicyliny, tzw. PBP2a lub PBP2', o niskim powinowactwie do antybiotyków β-laktamowych, co skutkuje opornością na wszystkie antybiotyki β-laktamowe obecnie stosowane w terapii. Białko PBP2a (PBP2') kodowane jest przez gen mecA zlokalizowany na chromosomie i stanowiący część regionu określanego jako gronkowcowa kaseta chromosomalna (SCCmec).

Szczepy oporne na metycylinę określane są skrótami:

- MRSA - metycylinooporny Staphylococcus aureus,

- MRCNS - metycylinooporne gronkowce koagulazo-ujemne,

- MRSE - metycylinooporny Staphylococcus epidermidis.

Szczepy oporne na metycylinę są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe stosowane w terapii, czyli penicyliny, penicyliny z inhibitorami β-laktamaz, cefalosporyny (wyjątek ceftobiprol - nowa cefalosporyna o aktywności anty-MRSA), cefalosporyny z inhibitorami, karbapenemy, monobaktamy i połączenia z inhibitorami.

Wykrywanie metycylinooporności:

• metoda krążkowo-dyfuzyjna z zastosowaniem cefoksytyny 30µg dla S. aureus
  i gronkowców koagulazoujemnych,

Podłoże MH, zawiesina 0,5 McFarlanda, inkubacja 24h w temp. 33-35°C

Odczyt: pomiar strefy zahamowania wzrostu

	S. aureus i S. lugdunensis		Gronkowce koagulazo-ujemne CNS
Cefoksytyna 30 µg	oporny	wrażliwy	oporny	wrażliwy
		≤21 mm	≥22 mm	≤24 mm	≥25 mm

• metoda przeglądowa z oksacyliną (6µg/mL) w podłożu MH z dodatkiem 4%NaCl tylko S. aureus,

• wykrywanie obecności genu mecA metodą PCR „złoty standard”

• testy lateksowe wykrywające białko PBP2a tylko S. aureus (np. Slidex MRSA Detection - bioMerieux)

• oznaczenie minimalnego stężenia hamującego oksacyliny (MIC):

• metoda mikrorozcieńczeń w bulionie MH, z odpowiednim stężeniem kationów i dodatkiem 2% NaCl

• metoda dyfuzji z paska zawierającego gradient antybiotyku

OPORNOŚĆ S. pneumoniae NA PENICYLINY (PRP)

Oporność na β-laktamy u S. pneumoniae jest wynikiem wytwarzania zmodyfikowanych białek PBP biorących udział w biosyntezie ściany komórkowej i będących celem działania tych leków.

Oznaczanie:

• metoda krążkowo-dyfuzyjna z zastosowaniem oksacyliny 1µg na podłożu MH z dodatkiem krwi

• określanie wartości MIC (minimalnego stężenia hamującego) penicyliny metodą 2-krotnych rozcieńczeń w agarze, bulionie lub za pomocą E-testu

Interpretacja:

Strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z oksacyliną ≥20 mm oznacza wrażliwość na penicylinę, amino penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy. Na podstawie wielkości strefy nie można podać interpretacji średniowrażliwy lub oporny. W tym celu należy oznaczyć MIC penicyliny .

Szczepy oporne na penicylinę są oporne na cefalosporyny I i II generacji, niekiedy też III generacji.

WRAŻLIWOŚĆ S. aureus NA GLIKOPEPTYDY (VISA/VRSA)

Mechanizm oporności na glikopeptydy u S. aureus polega głównie na znacznej nadprodukcji
D-alaniny, co powoduje wiązanie się antybiotyku zarówno z końcami D-alaniny w ścianie komórkowej , jak i z wolną D-alaniną. Aby uzyskać sukces terapeutyczny potrzebne jest zastosowanie znacznie wyższych stężeń leku.

Wszystkie szczepy MRSA powinny być bezwzględnie badane w kierunku zmniejszonej wrażliwości na glikopeptydy. Należy wykonać oznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) wankomycyny.

Szczepy o obniżonej wrażliwości na wankomycynę i teikoplaninę określane są VISA (vancomycin-intermediate S. aureus) lub bardziej prawidłowo GISA (glycopeptide-intermediate
S. aureus). Według najnowszych zaleceń EUCAST, obowiązujących w Polsce od 1 stycznia 2011 szczep S. aureus uznaje się za wrażliwy przy wartościach MIC ≤ 2mg/L dla wankomycyny i teikoplaniny, szczepy o wartościach MIC> 2 mg/L zaliczane są do opornych.

Oznaczenie wrażliwości S. aureus na glikopeptydy:

• metoda przeglądowa na podłożu BHI z dodatkiem wankomycyny o stężeniu 6µg/ml zawiesina 0,5 McFarlanda, nanosi się punktowo 10 µl zawiesiny lub rozprowadza się w postaci plamki ok. średnicy 10-15 mm lub na całe płytce, inkubacja 2h w 35°C odczyt: wzrost więcej niż jednej kolonii lub delikatny wzrost - podejrzenie VISA/VRSA

• oznaczenie MIC glikopeptydów:

• Metoda mikrorozcieńczeń w bulionie,

• Metoda dyfuzji w agarze z paska nasączonego gradientem antybiotyku (E-test)

OPORNOŚĆ NA MAKROLIDY, LINKOSAMIDY I STREPTOGRAMINY

OPORNOŚĆ TYPU MLS_B - na makrolidy, linkosamidy oraz streptograminy - gronkowce (zwłaszcza MRSA) oraz paciorkowce β-hemolizujące.

U bakterii Gram (+) występują trzy odrębne mechanizmy oporności:

- modyfikacja miejsca docelowego działania - białka 23S rRNA, związana z obecnością genów erm,

- enzymatyczna modyfikacja antybiotyku,

- aktywne usuwanie antybiotyku z komórki.

Oznaczenie oporności MLS_B wykonuje się metodą dwóch krążków, gdyż tylko metoda dyfuzyjno-krążkowa pozwala wykryć indukcyjny mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy oraz streptograminy B.

Sposób oznaczenia:

Podłoże MH lub MH z 5% krwią baranią (w przypadku Streptococcus), zawiesina 0,5 McFarlanda, krążki z erytromycyną 15 µg i klindamycyną 2 µg układamy w odległości 15-26 mm od krawędzi krążków.

Interpretacja wyników:

• oporność na erytromycynę i wrażliwość na klindamycynę oporność MS_B - nie powinno się stosować makrolitów 14 i 15 członowych oraz streptogramin B

• oporność na erytromycynę i oporność na klindamycynę MLS_B konstytutywny - nie powinno się stosować makrolidów, linkosamidów i streptogramin B

• oporność na erytromycynę i wrażliwość na klindamycynę z jednoczesnym spłaszczeniem strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną MLS_B indukcyjny - nie powinno się stosować makrolidów, linkosamidów i streptogramin B

OPORNOŚĆ Enterococcus NA AMINOGLIKOZYDY

Enterokoki wykazują naturalną oporność na cefalosporyny, niskie stężenia aminoglikozydów, trimetoprim/ sulfametoksazol, linkosamidy, niskie stężenia glikopeptydów u gatunków E. gallinarum, E. casseliflavus (fenotyp VanC) oraz właściwą dla E. faecium obniżoną wrażliwość na penicyliny. Naturalna oporność na niskie stężenia amino glikozydów związana jest ze słabą przepuszczalnością osłon komórkowych bakterii dla cząsteczek antybiotyku.

Wysoki poziom oporności na aminoglikozydy - HLAR (ang. High level aminoglicoside resistance) jest mechanizmem nabytym na skutek rozprzestrzeniania się plazmidów zawierających geny kodujące syntezę kilku enzymów modyfikujących te antybiotyki tzw. AME, o aktywności acetylotransferazy (AAC), fosfotransferazy (APH) lub nukleotydylotransferazy (ANT).

Fenotyp HLGR - high level gentamicin resistance wysoki poziom oporności na gentamycynę, oznacza wysoki poziom oporności na wszystkie aminoglikozydy z wyjątkiem streptomycyny, oraz utratę synergizmu z β-laktamami i glikopeptydami.

Fenotyp HLSR high level streptomycin resistant wysoki poziom oporności tylko na streptomycynę, przy zachowanej wrażliwości na pozostałe aminoglikozydy oraz utratę synergizmu z β-laktamami i glikopeptydami dla streptomycynę.

Metody wykrywania HLAR:

• krążkowo-dyfuzyjna z użyciem krążków z gentamycyną 120 µg i streptomycyną 300 µg

• metoda przeglądowa z antybiotykiem w podłożu - gentamycyną 500µg/mL lub streptomycyną 2000 µg/mL

OPORNOŚĆ Enterococcus NA GLIKOPEPTYDY - VRE (ang. vancomycin resistant enterococci)

Mechanizm oporności na wankomycynę polega na wytwarzaniu przez bakterię zmienionych cząsteczek dipeptydów: D-alanylo-D-mleczanu oraz D-alanylo-D-seryny o niskim powinowactwie do wankomycyny, które włączane są zamiast D-alanylo-D-alaniny w procesie budowy ściany komórkowej.

Fenotyp VanA - indukowana (pojawiająca się w obecności antybiotyku) oporność wysokiego stopnia na wankomycynę i teikoplaninę

Fenotyp VanB - indukowana oporność na wankomycynę, przy zachowanej wrażliwości in vitro na teikoplaninę.

Fenotyp VanC - mechanizm oporności naturalnej, związany z konstytutywnym, niskim poziomem oporności na wankomycynę przy zachowanej wrażliwości na teikoplaninę (gatunki E. casseliflavus czy E. gallinarum).

Oznaczenie:

• metoda krążkowo-dyfuzyjna

• metoda przeglądowa na podłożu BHI z dodatkiem 6µg/mL wankomycyny wzrost co najmniej jednej kolonii może oznaczać oporność

• wynik należy zweryfikować oznaczając wartość najmniejszego stężenia (MIC) wankomycyny

---