4. Bakteriofagi - charakterystyka i cykle rozwojowe
Bakteriofagi są to wirusy bakteryjne.
Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą się replikować same, niezbędna jest im w tym celu komórka gospodarza. Wirusy wpływają na maszynerię komórkową, korzystają z aparatu genetycznego gospodarza, by wyprodukować swoje cząstki potomne, które przenoszą się do nowego gospodarza inicjując następny cykl infekcyjny. Wirusy nie mają struktur koniecznych do syntezy białek, ani do wytwarzania energii. Nie mogą się namnażać poza komórką.
Materiałem genetycznym wirusa może być RNA (retrowirusy) lub DNA, jedno lub dwuniciowe. Żaden wirus nie zawiera jednocześnie i DNA i RNA.
Budowa wirusów
Cząstka wirusowa (wirion) składa się z :
kwasu nukleinowego (DNA lub RNA)
Okrywy (płaszcza) białkowego - kapsydu.
Kapsyd może być nagi lub pokryty osłonką złożoną z lipidów, glikoproteidów i innych substancji. Do wirusów posiadających osłonkę należą np.: wirus grypy, Herpesvirus.
Kapsyd składa się z podjednostek zwanych kapsomerami. Kapsomery najczęściej są zbudowane z 5 - 6 cząsteczek białka na kapsomer. Kapsyd może zawierać jeden rodzaj białka, ale zazwyczaj jest zbudowany z dwóch lub więcej rodzajów.
Morfologiczne klasy wirusów wyodrębnia się przede wszystkim w oparciu o kształt kapsydu:
wirusy o kapsydzie helikalnym
wirusy o kapsydzie kubicznym - wielościennym, wirion ma kształ bryły foremnej, najczęściej spotykane w tym typie są formy dwudziestościenne (ikozaedralne)
wirusy o kapsydzie mieszanym - ikozaedralna główka i helikalny ogonek
wirusy złożone
Kapsyd wraz z kwasem nukleinowym można nazwać nukleokapsydem.
U niektórych fagów ogonek ma zdolność kurczenia się, co ułatwia wstrzykiwanie kwasu nukleinowego do wnętrza komórki bakteryjnej. DNA znajduje się w główce faga. Ogonek kończy się czymś w rodzaju płytki, gdzie u niektórych fagów mieści się białko o charakterze enzymu rozpuszczającego bakteryjną ścianę komórkową. Do końca ogonka często doczepiane są włókna białkowe, którymi fag adsorbuje się na powierzchni komórki.
Cykl lityczny
Adsorpcja
Białka na powierzchni wirusa łączą się specyficznie do receptorów na powierzchni komórki gospodarza. Fagi z ogonkiem adsorbują się częścią ogonkową. Adsorpcja - zakładając, że jest możliwa, tzn. że komórka docelowa posiada odpowiednie receptory, zależna jest od:
stężenia komórek gospodarza w stosunku do stężenia wolnych cząstek fagowych
temperatury
pH podłoża
stanu fizjologicznego bakterii (starsze bakterie trudniej ulegają zakażeniu)
obecności jonów - adsorpcja nie zachodzi w czystej wodzie ani w wodzie o stężeniu jednowartościowych jonów K+ lub Na+ = 10-4M. Często potrzebne są inne jony, np. Ca2+, Mg2+, w stężeniach różnych dla różnych bakteriofagów.
w niektórych przypadkach - obecności innych substancji, np. tryptofanu.
Penetracja
Materiał genetyczny faga przechodzi przez błonę do wnętrza komórki gospodarza. Fag T2 po zakotwiczeniu się na komórce, kurczy nóżkę, dzięki czemu rdzeń, przez który przechodzi materiał genetyczny, przebija się do wnętrza komórki. Do komórki przechodzi zwykle sam materiał genetyczny (czasem z białkami związanymi z DNA), a kapsyd zazwyczaj pozostaje na zewnątrz.
Replikacja
DNA wirusowy dostaje się do wnętrza jądra komórkowego, gdzie zaczyna oddziaływać z maszynerią genetyczną gospodarza, zaczyna się replikacja DNA wirusowego. Wirusy DNA mogą wykorzystywać polimerazę DNA gospodarza lub kodować własną. Bakteriofagi DNA replikują kwas nukleinowy w różny sposób. Bakteriofagi o jednoniciowym DNA (ss DNA od ang.: single stranded DNA) oraz małe bakteriofagi o dwuniciowym DNA (ds DNA, od double stranded DNA) korzystają z polimerazy DNA komórki bakteryjnej. Duże bakteriofagi kodują własną polimerazę. Fag ΦX84 replikuje swoje DNA mechanizmem toczącego się koła: pojedyncza, kolisto zamknięta nić DNA o wielkości 5386 nukleotydów, która wnika do komórki oznaczana jest jako nić (+). Jest ona matrycą, na której przy udziale enzymów bakteryjnych tworzona jest komplementarna nić (-). Powstaje zatem struktura dwuniciowa. Następnie następuje przecięcie nici (+) w specyficznym miejscu. Przy udziale enzymu helikazy następuje rozplecenie podwójnej nici, a następnie polimeraza III wydłuża wirusową nić (+) na zasadzie toczącego się koła, prowadząc do wytworzenia bardzo długiej nici, z której odcinane są segmenty po 5386 nukleotydów. Końce każdego segmentu zostają zlepione - powstaje kolista cząsteczka nici (+), która może zostać zapakowana do kapsydu lub stanowić matrycę dla syntezy kolejnych nici (-).
Wirusy RNA replikują swój materiał genetyczny za pomocą polimerazy RNA kodowanej przez siebie. Polimerazy te często są bardzo swoiste, tzn. nie oddziaływują z RNA innych fagów. Wirusy te mogą też kodować odwrotną transkryptazę.
Zachodzi transkrypcja mRNA wirusowego, translacja jego białek.
Dojrzewanie fagów
Po wniknięciu wirusa o komórki gospodarza następuje tkzw. okres latencji (eklipsa). W tym czasie nie znajduje się w zakażonej komórce wirusów, ale można znaleźć wirusowy kwas nukleinowy.
Faza wczesna infekcji - zaburzenia w metabolizmie zakażonej komórki, zatrzymanie replikacji komórkowego DNA, zakłócenia, czasem wstrzymanie syntezy komórkowego RNA i białek. Pojawiają się wczesne białka wirusowe. U wirusów RNA wczesnym białkiem jest np. polimeraza RNA. U fagów posiadających materiał genetyczny w postaci ss DNA są to białka stymulujące replikację, a u fagów posiadających materiał genetyczny w postaci ds DNA są to białka regulacyjne transkrypcji i translacji.
Faza pośrednia infekcji - okres syntezy białek kapsydu i innych białek. Większość produktów białkowych wirusa można zaklasyfikować do jednej z trzech kategorii: (i) enzymy wymagane do syntezy nowych cząstek wirusowych (ii) inhibitory hamujące syntezę DNA, RNA i białek gospodarza (iii)białka używane do konstrukcji nowych wirusów (białka strukturalne)
Faza późna infekcji - następuje tworzenie nowych wirusów poprzez łączenie kapsomerów w kapsydy i włączanie do nich kwasu nukleinowego. Składanie wirusów z gotowych podjednostek może być procesem spontanicznym (nie katalizowanym przez żadne enzymy).
Uwolnienie
Setki - tysiące nowych cząstek wirusowych jest uwalniane przy lizie komórki gospodarza.
Cykl lizogeniczny
Cykl lizogeniczny przeprowadzają niektóre fagi o materiale genetycznym w postaci ds DNA, np. fag lambda (λ). Następuje adsorpcja i penetracja jak w cyklu litycznym, ale wirusowe DNA nie podlega ekspresji, tylko włącza się do genomu gospodarza. Może pozostawać w stanie takiego utajenia (wyciszenia) i być replikowane jako część genomu gospodarza. Stan utajenia może trwać szereg pokoleń gospodarza, zainfekowana komórka przekazuje faga komórkom potomnym. Faga zintegrowanego z chromosomem nazywamy profagiem.
Pod wpływem pewnych warunków profag może ulec aktywacji i wejść na drogę lityczną. Następuje ekspresja materiału genetycznego wirusa, synteza , składanie i uwalnianie nowych cząstek wirusowych.
Regulacja cyklu życiowego bakteriofaga λ
szlak lityczny faga T4:
Po zainfekowaniu E. coli fag ten rozwiją się drogą lityczną. Jego cząstki przyczepiają się do białka receptorowego OmpC, znajdującego się na powierzchni komórki bakteryjnej, a następnie DNA fagowy jest wstrzykiwany do komórki przez ogonek. Wewnątrz komórki rozpoczyna się transkrypcja genów faga, a synteza komórkowego DNA, RNA i białek zostaje zatrzymana. DNA gospodarza jest depolimeryzowany, a powstałe nukleotydy wykorzystane do replikacji fagowego DNA. Nowe cząstki faga są składane po zsyntetyzowaniu białek kapsydu.
● Cykl infekcyjny kończy się lizą od wewnątrz (LI), która prowadzi do uwolnienia od 100 do 200 fagów potomnych w 25-30 minucie po infekcji. W procesie tym biorą udział 2 główne białka: holina T umiejscowiona w błonie wewnętrznej oraz endolizyna E o aktywności lizozymu akumulowana w cytoplazmie. Holina T oligomeryzuje tworząc pory, przez które endolizyna E przedostaje się do periplazmy i trawi ścianę kom. Powoduje to lizę komórki gospodarza i uwolnienie potomstwa fagowego.
● Pseudolizogenia - mechanizm umożliwiający opóźnianie i dostosowanie czasu lizy do warunków wzrostu komórek gospodarza (T4 hamuje cykl rozwojowy do momentu aż zakażone komórki zaczną rosnąć).
● Inhibicja lizy (LIN) - jeśli po 3 lub więcej minutach od rozpoczęcia cyklu rozwojowego faga T4 dojdzie do ponownego zakażenia tej samej bakterii innym fagiem T4, następuje przesunięcie momentu lizy nawet o kilka godzin. W tym czasie tworzą się potomne cząstki fagowe co powoduje opóźnienie lizy w czasie i wzrost plonu fagowego nawet do 1000 wirionów. Mechanizm ten chroni potomstwo fagowe przed zakażeniem bakterii już zainfekowanych innym fagiem T4, a zatem przed śmiercią wirionów potomnych, których materiał genetyczny jest degradowany w takich bakteriach i nie dochodzi do powstania jego potomstwa w wyniku mechanizmu wykluczania superinfekującego faga.
Białka biorące udział w inhibicji lizy:
- RI będące antycholiną, które oddziaływuje z holiną T, uniemożliwiając otwarcie porów w błonie wewnętrznej (chroni ścianę komórkową przed trawieniem i blokuje lizę).
- RIII - występuje w cytoplazmie; stabilizuje oddziaływania białka RI z holiną T.
szlak lizogeniczny faga λ:
Bakteria lizogenna jest oporna na ponowne zakażenie takim samym fagiem, jaki został zintegrowany, może jednak być nadal zakażana innym fagiem (nawet lizogenizującym), ale integrującym się w innej części chromosomu bakteryjnego - jest to oporność bakterii na superinfekcję.
cykl lityczny: infekcja → cyrkularyzacja genomu faga → wczesna transkrypcja genów natychmiastowych (N i Cro) inicjowana przez promotor pL(transkrypcja w lewo) i pR (w prawo) → powstają transkrypty mRNA → replikacja DNA prowadzona przez enzymy gospodarza → przejście mechanizmu replikacji na typ toczącego się koła.
Transkrypcja z miejsca pR powoduje zwiększenie ilości białka Cro, które wiąże się do miejsc pL. i pR inhibując transkrypcję z tych promotorów (wyłączenie wczesnej transkrypcji).
Cykl lizogeniczny zależy od syntezy białka (represora λ), które jest produktem genu cI.
Produkt genu cII wiąże się i aktywuje promotor int, odpowiadający za integrację faga λ z chromosomem gospodarza bakteryjnego.
Fag M13 zakaża komórki bakteryjne posiadające pile płciowe kodowane przez czynniki F i Hfr (komórki „męskie”). Fag ten adsorbuje się na końcu pilusa płciowego (w przeciwieństwie do niektórych innych fagów, które mogą adsorbować się na całej długości pilusów) i wnikają weń w postaci nienaruszonej.
Cząstki faga M13 nie są gromadzone wewnątrzkomórkowo, a komórki zakażone fagiem M13 nie są lizowane, ale zahamowany jest ich wzrost. Nowe cząstki fagowe wydobywają się na zewnątrz bez niszczenia komórek gospodarza.
Fag M13 posiada nitkowaty wirion zawierający jednoniciowy, koliście zamknięty DNA [nić (+)].
Seria fagów T
Np. T4, T7. Są to duże lityczne fagi. Zawierają pojedyncza cząsteczkę ds. DNA. Wchodzą do komórki E. Coli przez ogonek. Zbudowane są z ogonka (białko helikalne), przyłączonego do ikozaedralnej główki. W główce znajduje się DA faga. Fagi te produkują około 100 cząstek fagowych w przeciągu 20 minut , a następnie lizują komórkę.
Fagi łagodne, np. λ
Posiadają DNA w postaci ds DNA. Mogą przechodzić cykl lityczny i lizogeniczny. W cyklu lizogenicznym integrują się do chromosomu gospodarza. Pod wpływem pewnych czynników przechodzą w cykl lityczny.