Temat I: Mikrobiologiczne przemiany związków azotu
Temat II: Mikrobiologiczne przemiany związków fosforu

Temat I: Mikrobiologiczne przemiany związków azotu

Cykl krążenia azotu w przyrodzie składa się z kilku wzajemnie ze sobą powiązanych ogniw.

Ogniwo pierwsze to symbiotyczne i niesymbiotyczne wiązanie azotu atmosferycznego przez drobnoustroje, w wyniku którego tworzy się białko. Substancja białkowa i inne organiczne połączenia azotu ulegają rozkładowi mikrobiologicznemu tak, że w procesie amonifikacji uwalnia się amoniak. Związek ten jest z kolei pobierany przez drobnoustroje i rośliny jako pokarm azotowy. W tym przypadku azot zostaje ponownie wbudowany w białko. Nie zużyty przez żywe organizmy amoniak powstały w wyniku rozkładu organicznej substancji azotowej ulega nitryfikacji. Poprzez azotyny tworzą się azotany, które podobnie jak amoniak są wyśmienitym pokarmem dla roślin wyższych. Mogą one też w pewnych okolicznościach być pobierane jako pokarm przez niektóre drobnoustroje. W tym przypadku dochodzi do tzw. zbiałczania azotanów przez mikroorganizmy. W warunkach beztlenowych mogą one ulegać częściowej lub całkowitej redukcji, czyli denitryfikacji. W wyniku częściowej denitryfikacji powstają azotyny, lub amoniak, w przypadku denitryfikacji całkowitej uwalnia się azot cząsteczkowy. Jak z tego wynika, drobnoustroje odgrywają tu decydującą rolą, czynnie uczestnicząc w krążeniu azotu w przyrodzie.

Rozkład mocznika 

Hydroliza mocznika jest uważana za przykład deaminacji hydrolitycznej. Wiele bakterii  tzw. mocznikowych przy udziale enzymu ureazy ma zdolność wykorzystania mocznika jako źródła azotu. Bakterie te hydrolizują cały dostępny mocznik do amoniaku, podwyższając przy tym pH do wartości 9-10, do jakiej są przystosowane. 

NH₂ - CO - NH₂ + 2H₂O ----> 2NH₃ + CO₂ + H₂O

Bakterie rozszczepiające mocznik - Bacillus pasteurii, Sporosarcina ureae, Proteus vulgaris.

Część praktyczna

a). obserwacja hodowli naturalnej drobnoustrojów hydrolizujących mocznik.

Obserwujemy zmianę zabarwienia papierka lakmusowego i wyciągamy wnioski.

b). obserwacja hodowli drobnoustrojów proteolitycznych - rozkład kazeiny mleka.

Gotowe hodowle organizmów proteolitycznych na podłożu stałym, do których dodano mleko (mleko spowodowało zmętnienie podłoża). Wokół wyrosłych na płytkach kolonii zaobserwowano strefy przejaśnień, które świadczą o rozłożeniu w tych miejscach kazeiny - białka zawartego w mleku; a to z kolei świadczy o tym, że kolonie wyrosłe na płytkach są koloniami drobnoustrojów proteolitycznych.

Studenci obserwują kolonie wyrosłe na podłożu stałym z mlekiem oraz oceniają kolonie drobnoustrojów proteolitycznych na podstawie obecności strefy przejaśnienia spowodowanej rozkładem kazeiny.

c). amonifikacja - wykonanie reakcji barwnej z odczynnikiem Nesslera na obecność jonów NH₄⁺ w hodowli z asparaginą oraz z asparaginą i glukozą

W celu uzyskania hodowli drobnoustrojów amonifikacyjnych stosuje się pożywkę zawierającą roztwór soli mineralnych (bez związków azotu) i asparaginę, która stanowi jedyne źródło węgla, azotu i substrat energetyczny.

Pożywka z asparginą zawiera: 

36,36 % C (węgla) i 21,2 % N (azotu)

0,2 g asparginy zawiera: 0,0727 g C i 0,0424 g N

C:N = 0,0727:0,0424 czyli stosunek węgla do azotu w pożywce z asparginą wynosi 1,71: 1

 

Pożywka z asparginą i glukozą zawiera: 

0,2 g asparginy zawiera: 0,0727 g C i 0,0424 g N

10 g glukozy zawiera 40 % C co równa się 4 g C

suma C w pożywce z asparginą i glukozą równa się 4,0727

stosunek C:N = 4,0272:0,0424 czyli 96,7:1

 

• opisać wygląd hodowli amonifikatorów (zwrócić uwagę na zmętnienie, kożuszek, osad)

• ocenić przebieg amonifikacji w obu wariantach hodowli (efekt amoniakalny ujemny lub dodatni), studenci wykonują reakcję barwną na obecność amoniaku w płynach pohodowlanych.

W celu stwierdzenia amonifikacji przeprowadzamy reakcję barwną na amoniak z odczynnikiem Nesslera. Do obu probówek dodaje się po kilka kropli odczynnika Nesslera. 

Odczynnik Nesslera jest to alkaliczny roztwór zespolonego związku - jodków rtęciowego i potasowego - K₂HgJ. Związek ten tworzy amoniakiem połączenie NH₄Hg₂J₃, dające zabarwienie żółte lub pomarańczowe.

W probówce z asparaginą pojawia się zabarwienie (mamy do czynienia z dodatnim efektem amonifikalnym związanym z wydzielaniem NH₃ do środowiska (z wodą daje jony NH₄⁺) - jest to wywołane zbyt małym stosunkiem węgla do azotu), natomiast hodowla w probówce z asparaginą i glukozą nie zmienia barwy (wydzielanie amoniaku nie nastąpiło - ujemny efekt amoniakalny. Przy odpowiednim stosunku C do N azot zostanie wbudowany w komórki bakteryjne). O obecności jonów amonowych świadczy pojawienie się zabarwienia od żółtego do pomarańczowego.

d). nitryfikacja - wykonanie reakcji barwnej z odczynnikiem Griessa na obecność jonów NO₂ w hodowlach autotroficznych bakterii nitryfikacyjnych.

Po 14 dniach inkubacji z hodowli przenosimy do probówek niewielką ilość płynu i dodajemy kilka kropli odczynnika Griessa. Probówki wstrząsamy. Odczynnik Griessa powoduje zabarwienie roztworów zawierających azotyny na kolor od różowego do czerwonego. Na podstawie dokonanych obserwacji studenci wyciągają wnioski.

W przypadku zmiany barwy w reakcji z odczynnikiem Griessa możemy stwierdzić, że w glebie występują nitryfikatory, które w czasie inkubacji namnażają się w pożywce i utleniają jony amonowe do azotynów.

e). denitryfikacja - opis hodowli (gaz, odczyn, zmętnienie) i reakcja barwna na obecność NO₃^¯.

Po okresie inkubacji hodowli zwracamy uwagę na obecność lub brak gazu w rurkach Durchama. Mierzymy za pomocą papierka wskaźnikowego odczyn pożywki. Następnie należy przeprowadzić reakcję barwną na obecność azotanów. 

W celu wykonania reakcji do małej probówki odlewamy trochę zaszczepionej pożywki i dodaje się mocznik w substancji (dodatek mocznika eliminuje azotyny, które również dają reakcję barwną z dwufenyloaminą). Następnie dodajemy po kilka kropli stężonego H₂SO₄ i roztworu dwufenyloaminy w kwasie siarkowym. W obecności azotanów występuje niebieskie zabarwienie. 

Obecność gazu (N₂) w rurkach Durhama, alkalizacja i brak reakcji barwnej (zanik jonów NO₃) w pożywce szczepionej glebą świadczą o rozwoju denitryfikatorów wprowadzonych do pożywki z glebą.

f). obserwacja hodowli denitryfikatorów autotroficznych.

W celu otrzymania hodowli denitryfikatorów autotroficznych należących do gatunku Thiobacillus denitrificans stosuje się mineralną pożywkę wybiórczą, zawierającą jako substrat energetyczny siarkę i KNO₃ jako akceptor wodoru. Do pożywki dodaje się CaCO₃ dla zobojętnienia powstającego kwasu siarkowego. Pożywkę szczepi się glebą i inkubuje w temp. 28^oC przez kilka tygodni. Po inkubacji możemy zaobserwujemy gromadzące się wokół kryształków siarki pęcherzyki gazu (N₂).

g). zbiałczanie azotanów 

Do kolbek (jedna z KNO₃, druga z KNO₃ i glukozą) dodajemy ³/₄ objętości wody i całość po 5 minutowym wytrząsaniu przesączamy. Przesącz poddajemy reakcji barwnej na wykrycie jonów NO₃¯ (kilka kryształków mocznika + H₂SO₄ + fenyloamina) . 

W przypadku występowania NO₃¯ zachodzi reakcja barwna. W przypadku braku reakcji możemy stwierdzić że zaszedł proces zbiałczania (w probówce z KNO₃ i glukozą zachodzi proces zbiałczania ). Przy wysokim stosunku węgla do azotu, azot zostaje pobierany przez drobnoustroje ze środowiska i wbudowany w ich ciało w postaci aminokwasów.

Temat II: Mikrobiologiczne przemiany związków fosforu

Drobnoustroje odgrywają doniosłą rolę w przemianach związków azotowych w przyrodzie. Dzięki nim azot z nieprzebranego rezerwuaru. W glebie drobnoustroje biorą udział nie tylko w przemianach węgla i azotu, lecz także w przemianach fosforu, potasu, siarki i żelaza, Oddziaływanie drobnoustrojów na krążenie tych pierwiastków polega na mineralizacji związków organicznych lub na przekształcaniu związków mineralnych z form nieprzyswajalnych dla roślin w związki przyswajalne. Drobnoustroje mogą też pobierać z gleby mineralne związki fosforu, potasu, siarki i żelaza i nagromadzać w swoich ciałach.

Przemiany fosforu. Z resztkami roślinnymi i zwierzęcymi dostają się do gleby organiczne związki fosforu, takie jak: fityna, fosfolipidy i fospoproteidy. Drobnoustroje w glebie mineralizują te związki, uwalniając z nich jony fosforanowe. Jony fosforanowe, jako rozpuszczalne w wodzie, mogą być pobierane przez drobnoustroje i rośliny. 

Zdolność do pobierania fosforu mineralnego w formie rozpuszczalnej jest u drobnoustrojów właściwością powszechną. Ponieważ w procesie mineralizacji fosfor uwalniany jest w ilościach przekraczających zapotrzebowania drobnoustrojów, znaczna jego część wykorzystywana jest przez rośliny. Podobnie przy pobieraniu fosforu z nawozów mineralnych drobnoustroje tylko w małym stopniu konkurują z roślinami. 

W odżywianiu roślin duże znaczenie ma też zdolność drobnoustrojów do przeprowadzania trudno rozpuszczalnych mineralnych związków fosforu (np. Ca₃(PO₄)₂) w związki rozpuszczalne w wodzie, jak np. Ca(H₂PO₄)₂, CaHPO₄, których fosfor pobierany jest przez rośliny. Takie przekształcenie mineralnych związków fosforu związane jest w dużym stopniu z wytwarzaniem kwasów organicznych w procesach fermentacji oraz z wytwarzaniem kwasu azotowego w procesie nitryfikacji i kwasu siarkowego w procesach utleniania siarki. Fosforany są też rozpuszczane przez kwas węglowy, który powstaje w glebie w wyniku reakcji z wodą dwutlenku węgla, wydzielanego w procesach mineralizacji przez drobnoustroje i inne organizmy glebowe. 

Występowanie i aktywność drobnoustrojów czynnych w uruchamianiu przyswajalnego dla roślin fosforu stwierdzamy, określając na pożywkach wybiórczych ich liczebność lub śledząc pojawienie się jonów fosforanowych w podłożu.

Część praktyczna

Drobnoustroje rozpuszczające Ca₃(PO₄ )₂ - demonstracja.

Studenci opisują hodowle wyrosłe na stałym podłożu z Ca₃(PO₄)₂ oraz dokonują oceny drobnoustrojów rozpuszczających fosforan na podstawie obecności stref przejaśnienia wokół kolonii produkujących kwasy.

3

---