BIOCHEMIA

Skrypt Agi i Iwana

III. Frakcjonowanie i oznaczanie białek w surowicy krwi

Rozpuszczalność - wiązanie się dipoli wody z grupami polarnymi łańcuchów bocznych oraz atomami N i O wiązania peptydowego - cząsteczka białka otacza się płaszczem wodnym. Ilość wody hydratacyjnej może sięgać 0,3-04 g/gb.

Woda hydratacyjna wpływa na właściwości funkcjonalne łańcuchów bocznych, które są schowane między splotami łańcuchów peptydowych.

Białka uwodnione pęcznieją, tworząc żel w niewielkiej ilości wody. W miarę wzrostu fazy objętości wody tworzą hydrofilowe roztwory koloidalne ulegające rozpuszczeniu.

Niewielkie stężenie soli wpływa + na rozpuszczalność białek, w punkcie izoelektrycznym (wartość pH roztworu, przy której stężenie jonu obojnaczego osiąga maksymalną wartość, natomiast stężenia form: anionowej i kationowej mają,

jednakową, minimalną wartość) rozpuszczalność jest najmniejsza.

Wysalanie (metoda wytrącania białka z roztworu niepowodująca jego denaturacji) - wytrącanie białek z roztworu dużym stężeniem soli (które jony łatwo tworzą wodziany) Zjawisku wysalania sprzyjają te jony (anionowe), które tworzą wiązanie wodorowe lub odznaczają się wysoką elektroujemnością. Elektrolity wielowartościowe odznaczają się silniejszym działaniem od jednowartościowych. Sole wiążące wodę pozbawiają cząsteczki białka płaszcza wodnego zmniejszającego ich rozpuszczalność - wytrącanie z roztworu. Stężenie soli zależy od właściwości białek i pH środowiska. Najłatwiej wysolić białko w Punkcie izoelektrycznym. Najczęściej do wysolenia stosuje się (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgSO₄. Jest to proces odwracalny ponieważ nie powoduje denaturacji. Efekt podobny do wysolenia - dodanie do roztworu białka etanolu lub octanu lecz ta metoda prowadzi do nieodwracalnej denaturacji białek. Odwodnienie w punkcie izoelektrycznym zawsze prowadzi do wytrącenia białek.

Denaturacja - zmiana w konformacji łańcucha peptydowego - białko traci swe właściwości. Denaturacja następuje gdy pod wpływem czynników fizycznych lub chemicznych ulegnie zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędowa (zdeformowanie ukształtowania cząsteczki, bez hydrolitycznej degradacji łańcucha polipeptydowego) Czynniki denaturujące działają na wiązania stabilizując przestrzenną strukturę białka.

• Wiązanie wodorowe

• Wiązanie jonowe

• Wiązanie dwusiarczkowi S-S

• Wiązanie koordynacyjne

Wynik denaturacji - powstanie cząsteczek ze zmienionymi właściwościami biologicznymi (np. enzymatycznymi, antygenowymi, hormonalnymi) a niekiedy fizykochemicznymi. Białko zdenaturyzowane w pH ≠ p.izoelektrycznym utrzymuje się w roztworze.

Denaturyzację wydłużają:

- czynniki fizyczne (np. T, wysychanie, ultradźwięki, promieniowanie, krótkofale, wstrząsanie wodnych roztworów białka w atmosferze powietrza)

- czynniki chemiczne: Kwasy, zasady, jony metali ciężkich, chlorowodorek guanidyny, mocznik, detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z wodą (alkohol, aceton)

Metody ilościowego oznaczania białek(potrzebne 2 przykłady):

• Ninhydrynowa (oznaczanie zawartości aminokwasów) - aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu. Kondensacja 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej lub utlenionej z amoniakiem - powstaje fioletowo niebieskie zabarwienie (natężenie koloru jest proporcjonalne do zawartości azotu α-aminowego aminokwasów) Oznaczana próba nie może zawierać soli amonowych, aminocukrów, amoniaku.

• Mikrobiuretowa (zmodyfikowana metoda biuretowa) Zastosowanie spektrofotometrycznego pomiaru absorbancji barwnego kompleksu miedzi z białkiem przy długości światłą 310nm zwiększa ponad 50x czułość metody biuretowej. Absorbancja nie zależy od rodzaju oznaczanego białka a jedynie od jego stężenia w próbie. (szczególnie przydatna przy oznaczaniu białek w płynach biologicznych, homogenatach tkankowych)

• Lowry'ego - wykorzystuje czułą reakcję jaką dają wiązania peptydowe i tyrozyna z odczynnikiem Folina - Ciocoalteu jest kombinacją reakcji biuretowej i reakcji między resztami tyrozyny a tym odczynnikiem. Efekt - powstają barwne (niebieskie) produkty. Absorbancję powstałego zabarwienia odczytuje się przy długości światła 750nm - metoda pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1microgram/ml i jest dokładniejsza od metody spektrofotometrycznej i około 100x czulsza od metody biuretowej, powszechnie używana do oznaczania zawartości białek w płynach biologicznych i homogenezach tkankowych.

• Pomiaru absorbancji w nadfiolecie - większość białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje max absorbancji przy 280nm. Metoda nie nadaje się do oznaczania białka w mieszaninie zawierającej więcej niż 20% kwasów nukleinowych.

• Bradforda - wykorzystanie zdolności wiązania barwnika Coomassie Brillant Blue G-250 z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy i w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny. Efekt - błękitne zabarwienie. (natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białek w roztworze), metoda jest prosta w wykonaniu, bardzo szybka i czuła, można ją wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, Mg²⁺, związków tiulowych, sacharozy, glicerolu.

Krew

Skład:
- woda (90-92%)
- białka (7% np. fibrynogen, albuminy, globuliny)
- inne związki chemiczne (jony sodu, magnezu, wapnia, żelaza, chloru, glukoza, mocznik, hormony, witaminy).

Właściwości fizyko-chemiczne:

- Osmoza - wybiórcze przenikanie cząstek przez błonę półprzepuszczalną, ciśnienie osmotyczna - ciśnienie, które trzeba wywrzeć na swobodną powierzchnię roztworu aby uniemożliwić zwiększenie objętości cieczy [zapobieganie osmozie] ciśnienie osmotyczne jest wprost proporcjonalne do stężenie molowego i temperatury względnej)

- Chemiloza - w roztworze hipotonicznym przekroczenie granicy oporności krwinki na ciśnienie osmotyczne, efektem jest pęknięcie krwinki, wylanie hemoglobiny. W roztworze izotonicznym hemolizę można wywołać środkami chemicznymi np. aceton, eter, kwasy, zasady, jady wężów. Hemolizę można też wywołać zamrażając krew.

Białka surowicy krwi - selekcjonowanie przez wysalanie

Albuminy - wysalające się przy pełnym wysoleniu siarczanem amonu (niskocząsteczkowe, rozpuszczalne w wodzie, wykazują do niej wysokie powinowactwo [koloid ochronny] wpływają znacznie na ciśnienie osmotyczne krwi, p.izoelektryczny przypada na pH=4,9, mają zdolność wiązania i transportu różnych substancji)

Globuliny - wysalające się przy 50% wysoleniu siarczanem amonu (do globulin zaliczamy: białka biorące udział w procesie krzepnięcia krwi, enzymy wędrujące we frakcjach α i β globulin, białka o właściwościach immunologicznych, białka wiążące metale.

Globuliny są białkami często sprzężonymi z cukrowcami lub tłuszczowcami, wykazują mniejsze powinowactwo do wody)

Współczynnik albuminowo-globulinowy ^A/_G=1,5

Absorbancja -logarytm dziesiętny ilorazu natężenia monochromatycznej wiązki wchodzącej do ośrodka absorbującego i natężenia wiązki przepuszczonej przez ten ośrodek (Lamberta-Beera prawo). SAY WHAAAAAT????!

Or

współczynnik absorpcji (pochłaniania) światła, stosowany w spektrofotometrii do oznaczania stężenia substancji w roztworze

Transmitacja -wskazuje, jaka część promieniowania padającego została przepuszczona przez substancję. Wyraża się ona wzorem

Można ją również wyrażać w procentach

Lamberta i Beera prawo, Beera i Waltera prawo, Bouguera i Beera prawo, prawo opisujące ilościowo absorpcję światła przez roztwory substancji barwnych: podczas przechodzenia promieniowania monochromatycznego przez roztwór substancji absorbującej absorbancja A jest proporcjonalna do stężenie c i grubości warstwy absorbującej b roztworu, A = acb, gdzie a jest współczynnikiem proporcjonalności (tzw. współczynnik absorpcji, inaczej współczynnik ekstynkcji).

---