Morfologia bakterii (formy kuliste)
Kształty bakterii i sposób barwienia metodą Grama.
Budowa ściany komórkowej bakterii.
Technika wykonywania preparatów mikroskopowych.
Metody barwienia stosowane w mikrobiologii.
Budowa ściany komórkowej.
Ściana wraz z błoną kom. stanowi 25% masy bakterii (Procaryota). Ściana komórkowa nie występuje jedynie u mykoplazm (Mycoplasmatales), bakteryjnych form L oraz w protoplastach. Ściana jest sztywna, porowata, nadaje komórce kształt, ochrania. U bakterii bez otoczek styka się bezpośrednio ze środowiskiem zewnętrznym. Niektóre jej struktury pełnia funkcje receptorów dla bakteriofagów lub antygenów stymulujących mikroorganizm do wytwarzania swoistych przeciwciał. Ściana komórkowa zbudowana jest z heteropolimerów wspólnych dla bakterii g+ i g- oraz oczywiście ze składników charakterystycznych wyłącznie dla jednej z tych grup.
Peptydoglikan -mureina, glikopeptyd, mukopeptyd, muropeptyd. Występuje u g+ i g- brak go u form L, Archeabacteriae, Mycoplasmatales. Tworzy on warstwę sztywną ściany kom. (R-rigid layer). Jego głównymi składnikami są N-acetyloglukozamina i kwas N-acetylomuraminowy. Połączone one są wiązaniem glikozydowym β-1,4. Liczba podjednostek cukrowych powyższych związków jest różna u różnych gatunków drobnoustrojów. Przez wolną grupę karboksylową reszty kwasu mlekowego kwas N-acetylomuraminowy łańcuch wielocukrowy łączy się z pentapeptydem o składzie aminokwasów charakterystycznym dla gatunku bakterii. Wyróżniamy 5 typów pentapeptydów oznaczonych A-E. W pozycji 3 pentapeptydu zawsze występuje aminokwas zasadowy (lub DAP) z wolną grupą aminową dzięki której tworzą się krzyżowe wiązania międzypeptydowe lub mostki międzypeptydowe pomiędzy poszczególnymi łańcuchami peptydoglikanu. Połączenia krzyżowe mają charakter mostków peptydowych składających się z jednego rodzaju aminokwasu. Obecność mostków międzypeptydowych lub krzyżowych wiązań bezpośrednich w peptydoglikanie warunkuje stopień jego usieciowania, u g- 20-30%, u g+ 100%. U g- występuje od jednej do trzech warstw peptydoglikanu i nie przekracza on 10% ich ściany kom. A jego grubość mieści się w granicach 20-30 angstremów. U g+ występuje do kilkudziesięciu warstw peptydoglikanu, jego grubość sięga 100 angstremów. W peptydoglikanie oprócz aminokwasów L występują tez D sprawia to iż jest on oporniejszy na działanie enzymów proteolitycznych, wytwarzanych przez organizmy wyższe. Najbardziej znanym enzymem hydrolizującym wiązanie glikozydowe między kwasem N-acetylomuraminowym a N-acetyloglukozaminą do muropeptydów jest lizozym. Peptydoglikan pełni wiele funkcji w komórce bakteryjnej: chroni bakterie przed skutkami zmian ciśnienia osmotycznego środowiska, czynnikami fizykochemicznymi i urazami mechanicznymi. Pełni rolę sita molekularnego, ma zdolność do wiązania kationów metali ciężkich (rtęć, ołów) oraz jonów magnezu, stabilizujących strukturę komórek bakteryjnych. Peptydoglikan otacza szczelnie komórkę tworząc rodzaj woreczka warunkującego kształt bakterii. Właściwości biologiczne mureiny to aktywność adjuwantowa- zdolność do wzmagania odpowiedzi immunologicznej w postaci syntezy przeciwciał odpornościowych, po immunizacji makroorganizmu antygenem. Mureina jest immunogenem, wywołującym syntezę przeciwciał u ludzi lub zwierząt. Może on działać toksycznie i ma to miejsce w przypadku pałeczki krztuśca. Mureina posiada również właściwości immunomodulacyjne - zmienia reakcje odpornościowe makroorganizmu. Peptydoglikan jest samnogenem wywołującym u ludzi i zwierząt stan senności, oraz pirogenem wywołującym podniesienie temperatury ciała. Działa tez przeciwnowotworowo, wywołuje artretyzm.
Ściana komórkowa bakterii g+
Warstwę sztywną tworzy tu peptydoglikan zaś warstwę plastyczną hetero polimery kwasów: teichojowe, teichouronowe, lipoteichojowe. Kwasy teichojowe są polimerami fosforanu glicerolu, lub rybitolu podstawionymi resztami aminokwasów (najczęściej D-alaniny) i czasami zawierającymi łańcuchy boczne złożone z mono- i oligosacharydów. U niektórych g+ występują kwasy teichouronowe. Są one obecne obok kwasów teichojowych lub występują wyłącznie u niektórych gatunków. Kwasy teichouronowe stanowią długie polimery kwasu uronowego i reszty innego cukru. Mostek kotwiczący kwas teichouronowy zbudowany jest z kwasu N-acetylomannozouronowy i N-acetyloglukozoaniny połączonej wiązaniami fosfodiestrowymi z mureiną. Kwasy lipoteichojowe obecne osobno lub z kwasami teichojowymi. Łączą się przez ścianę komórkową z błoną cytoplazmatyczną gdzie są zakotwiczone. Są one zbudowane z fosforanu glicerolu połączonego wiązaniami fosfodiestrowymi i podstawionego kwasami tłuszczowymi. Kwasy teichojowe nadają swoistość immunologiczną bakteriom g+ i są wykorzystywane do ich klasyfikacji serologicznej. Posiadają tez zdolność do modulacji odpowiedzi immunologicznej, wywołują aktywacje limfocytów B, makrofagów, są toksyczne, indukują artretyzm. Kwasy lipoteichojowe przenikają mureinę i sięgają aż na zewnątrz komórki gdzie stanowią główny antygen powierzchniowy. Wraz z kwasami teichojowymi biorą udział w wymianie jonowej. Kwasy lipoteichojowe aktywują dopełniacz, monocyty i makrofagi, pobudzają litogenezę limfocytów, pośredniczą w adhezji bakterii do komórek eukariotycznych.
W ścianie kom. występują również białka A- wiążące przeciwciała IgG, M- -swoisty serologicznie, G- wiążące przeciwciała IgG.
ściana komórkowa g-
Dominuje tu warstwa plastyczna-błona zewnętrzna (OM- błona zewnętrzna) składająca się z fosfolipidów, białek, lipoproteidu Brauna, lipo polisacharydu (LPS- antygen O, endotoksyna) oraz antygenu wspólnego (antygen Kunina, ECA). Wstępuje tu od 1 do 3 warstw peptydoglikanu który oddziela od warstwy plastycznej przestrzeń peryplazmatyczną. Fosfolipidy tworzą wraz z białkami i LPS zrąb błony zewnętrznej. Występują wśród nich fosfatydyloglicerol , kardiolipina oraz w największej ilości fosfatydyloetanolamina. Błona zewnętrzna wykazuje zjawisko zmiany fazy (tranzycji) w temperaturze fizjologicznej (optymalne dla wzrostu drobnoustrojów), jest płynna lub prawie płynna w temperaturze niższej przechodzi w fazę stałą (bardziej stałą). Błona zewnętrzna stanowi barierę przepuszczalności dla wielu substancji o charakterze hydrofobowym, co ma związek z brakiem obecności fosfolipidów w zewnętrznej warstwie błony i występowaniem tam LPS którego część wielocukrowa przyczynia się do słabej przepuszczalności OM. Białka błony zewnętrznej należą do nich białka główne I rzędowe- Major proteins, i białka poboczne II rzędowe- Minor proteins. Pod względem pełnionych ról- wyróżniamy białka strukturalne (matrycowe) występujące w całej objętości błony zewnętrznej i białka funkcjonalne związane z transportem komórkowym- białka tworzące kanały dyfuzyjne (porynowe, poryny). Niektóre białka pełnią obie te funkcje naraz. W błonie zewnętrznej obecne są również enzymy np. fosfolipaza A, hydrolaza UDP-glukozy, proteazy, lipazy, nukleazy, oksydazy. Najbardziej znane białka strukturalne to OmpA oraz lipo proteina Brauna, OmpA to białko śródbłonowe. Sześć α spirali lipoproteiny Brauna tworzy w błonie zewnętrznej i przestrzeni peryplazmatycznej superspiralę z wewnętrznym kanałem hydrofilowym oraz hydrofobową stroną zewnętrzną. Lipoproteina Brauna może występować w komórce w postaci wolnej, dimeru, lub trimeru. W błonie zewnętrznej bakterii g- oprócz lipoproteiny Brauna występują także inne np. PAL-niekowalencyjne białko związane z mureiną. Białka porynowe dzielimy na dwie grupy - poryny ogólnej(nieswoistej) dyfuzji związane z mureiną, oraz poryny swoiste. Poryny swoiste powstają w wyniku indukcji wywołanej obecnością substratu. Wiele bakterii posiada skomplikowane systemy pozyskiwania żelaza, w ich skład wchodzą siderofory (niskocząsteczkowe związki wiążące żelazo) oraz białka w błonie zewnętrznej służące jako receptory dla sideroforów. Lipopolisacharyd- jest najważniejszym pod względem funkcji biologicznym składnikiem błony zewnętrznej g- , posiada wspólny plan budowy oraz i składa się z trzech różniących się pod względem budowy chemicznej oraz funkcji biologicznej regionów: części O-swoistej, rdzenia oraz lipidu A. Część O-swoista to powtarzające się podjednostki oligosacharydowe, determinujące swoistość antygenową LPS. Region rdzeniowy LPS charakteryzuje się mniejszym zróżnicowaniem struktury chemicznej. Lipopolisacharyd chemicznie i biologicznie odpowiada endotoksynie , poszczególne regiony LPS odpowiedzialne są za jej różne funkcje biologiczne. LPS jest immunogenny-(posiadający zdolność do wywoływania reakcji obronnej organizmu), jego część wielocukrowa PS nadaje mu swoistość antygenową. Część wielocukrowa LPS warunkuje jego rozpuszczalność, może być receptorem dla fagów i będąc najbardziej wysuniętym na zewnątrz fragmentem endotoksyny wchodzi we wzajemne interakcje bakterii ze środowiskiem. Region Kdo stanowi łącznik pomiędzy częścią wielocukrową a lipidem A, centrum aktywności biologicznej endotoksyny. Lipid A oraz endotoksyna wywołuje podwyższenie temp. ciała (efekt pirogenny), stan zapalny, leukopenię (zmniejszenie liczby leukocytów) a potem leukocytozę, hipoglikemię (niedocukrzenie krwi), wewnątrznaczyniowe wykrzepianie, szok septyczny, zapaść, zgon. Lipid A jest somnogenem- zaburza sen, indukuje wydzielanie mediatorów komórkowych. LPS zlokalizowany jest w zewnętrznej warstwie błony zewnętrznej, fosfolipidy występują w warstwie głębokiej jest więc asymetryczna. Częścią LPS tkwiącą w błonie zewnętrznej jest lipid A którego nasycone kwasy tłuszczowe tworzą uporządkowaną sztywną warstwę- barierę dla penetracji substancji hydrofobowych do komórki. Występująca na zewnątrz hydrofilowa część polisacharydowa LPS chroni bakterie przed składnikami układu immunologicznego. LPS PS i lipid A wzajemnie się uzupełniają. Część cukrowa LPS czyni go bardziej rozpuszczalnym, zapewnia utrzymanie odpowiedniej konformacji przestrzennej aktywnego biologicznie lipidu A. Jego funkcja biologiczne jest determinowana przez czynniki utrzymujące równowagę pomiędzy oddziaływaniami hydrofobowymi a hydrofilowymi- powstaje tu układ fizykochemiczny w którym lipid A rozpuszczalny, toksyczny oraz dostępny biologicznie. ECA to antygen Kunina (wspólny) występuje w błonie zewnętrznej i jest podobny budową chemiczną do LPS. Może on występować w trzech formach wolnej, związanej z LPS oraz cyklicznej. Forma cykliczna składa się z trzech trój-cukrowych podjednostek połączonych w pierścień. Antygen ten wiąże jony wapnia, ma ogromny udział w patogenezie. Przestrzeń peryplazmatyczna to przestrzeń pomiędzy błoną cytoplazmatyczną (błoną wewnętrzna CM, błoną zewnętrzna OM) g-. Występują tu 1-3 warstwy peptydoglikanu, pomiędzy nimi występują białka i oligosacharydy całość ma charakter żelu. Łączenie się błony zewnętrznej z błoną cytoplazmatyczną w przestrzeni peryplazmatycznej w złączach Bayera odbywa się za pośrednictwem mureiny. Białka występujące w przestrzeni peryplazmatycznej to: białka unieczynniające antybiotyki β-laktamowe-penicylina i aminoglikozydowe-streptomycyna; enzymy degradujące polimery związków chemicznych o znaczeniu biologicznym (α-amylaza, nukleazy); białka wiążące aminokwasy, cukry, peptydy, witaminy oraz jony. Oligosacharydy stanowią barierę ochronną na wypadek zmian ciśnienia osmotycznego w środowisku wzrostu.
Morfologia bakterii (kształty, wielkość)
Bakterie to główni przedstawiciele Królestwa Procaryota. Wymiary bakterii mieszczą się w przedziale od jednego do kilku μm (0,2-2 μm; 2-8 μm, powyżej 8μm). Przekrój najmniejszych z nich wynosi od 0,1-0,2 μm. Największe bakterie osiągają wielkość 40 μm. Bakterie dzieląc się zachowują symetrie względem osi podłużnej lub poprzecznej, co warunkuje tworzenie przez nie ugrupowań. Kształty bakterii:
-kulisty
-cylindryczny
-spiralny
KSZTAŁT KULISTY-ziarniaki (cocci):
Forma pojedyncza-Micrococcus g+
Forma podwójna-Diplococcus (dwoinka) g+, g-
Forma poczwórna-Tetracoccus (czwórniak, ziarniak czworaczy) g+
Paciorkowce-Streptococcus g+
Gronkowce-Staphylococcus g+
Pakietowce-Sarcina sp. (sześcianki) g+
Większość ziarenkowców jest g+. Najbardziej znane chorobotwórcze to Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes (paciorkowiec ropotwórczy), Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) dwoinka zapalenia płuc. Ziarenkowce g- to rodzina Neisseriaceae (Neisseria gonorrhoeae- gonokok, dwoinka rzeżączki; Neisseria meningitidis- meningokok- dwoinka zapalenia opon mózgowo rdzeniowych).
Kształt cylindryczny:
Pałeczki- Bacterium g-
Laseczki- Bacillus g+
Maczugowce- Corynebacterium g+
Wrzecionkowce- Fusobacterium g-
Prątki- Mycobacterium g+
Pałeczki to dość zróżnicowana grupa bakterii. Należą do niej (g-) gram ujemne bakterie: (E.coli-pałeczka okrężnicy występująca w układzie pokarmowym ludzi i zwierząt; Salmonella typhi-pałeczka duru brzusznego; Shigella sonei-pałeczka czerwonki; Proteus mirabilis-pałeczka odmieńca; Pseudominas aeruginosa-pałeczka ropy błękitnej) oraz (g+) gram dodatnie bakterie ( Listeria monocytogenes-patogen względnie wewnątrzkomórkowy ). Bakterie o kształcie laseczek to tlenowce (Bacillus subtilis-laseczka sienna; B.cereus-laseczka woskowa; B.anthracis-laseczka wąglika) lub beztlenowce z rodzaju Clostridium (C.botulinum-laseczka jadu kiełbasianego; C.tetani-laseczka tężca; C.perfringens; C.sporogenes). Laseczki mogą wytwarzać endospory. Wśród form wydłużonych bakterii wystepują Corynebacterium diphtheriae-maczugowiec błonnicy, w obrębie prątków Mycobacterium tuberculosis- prątek gruźlicy i Mycobacterium leprae-prątek trądu. Formy cylindryczne mogą tworzyć układy przestrzenne: łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Lactobacillus g+
Kształty spiralne:
Przecinkowce-Vibrio- (V.cholerae- przecinkowiec cholery;)g-
Śrubowce-Spirillum- (Rhodospirillum rubrum-bakteria fotosyntezująca); g-
Krętki-Spirochetae- (Borrellia, Treponema-T.pallidum-kretek blady, zarazek kiły), Leptospira g-.
Bakterie nitkowate (Chlamydobacteriales) posiadają niezwykle złożony kształt, bakterie styliskowe (Caulobacteriales), bakterie z wyrostkami (Hyphomicrobium) oraz bakterie pączkujące i tworzące wyrostki (Rhodomicrobium vannielii- bakterie fotosyntezujące).
Metody barwienia i barwniki:
Mała zdolność załamywania promieni świetlnych przez drobnoustroje zwłaszcza bakterie sprawia że są one niewidoczne pod zwykłym mikroskopem świetlnym. Aby je obejrzeć trzeba drobnoustroje wybarwić.
Barwniki- są to związki chemiczne, zdolne do adsorbowania na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe barwne połączenia. W cząsteczkach tych związków wyróżniamy grupę chromoforową (barwna grupy -azo, -nitrozo, -azoksy, tiokarbonylowa) i grupę auksochromową. Zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem. Pod względem chemicznym barwniki dzielimy na: kwaśne-eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna; zasadowe- błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczkowy, fuksyna zasadowa. Ponieważ powierzchnie komórek bakterii naładowane są ujemnie najczęściej stosuje się barwniki zasadowe w roztworach alkoholowych, lub wodnych. Barwniki kwaśne najczęściej używane są do wybarwiania tła preparatu.
-negatywne- metoda negatywna polega na użyciu takiego barwnika dla tła który nie zabarwia elementów strukturalnych drobnoustrojów. Barwniki używane w tej metodzie to: nigrozyna, tusz chiński- barwniki czarne, rzadziej czerwone- czerwień Kongo. Przy tym barwieniu preparaty nie są utrwalane. Z użyciem nigrozyny, na szkiełku umieścić małą kroplę nigrozyny. Do kropli wprowadza się badane drobnoustroje. Za pomocą drugiego szkiełka rozprowadza się kroplę po powierzchni zdecydowanym ruchem, preparat pozostawia się do wyschnięcia. Metoda stosowana do barwienia krętków (Treponema pallidum- krętek blady) oraz otoczek bakterii. Barwniki te posiadają małą zdolność dyspersji.
-negatywno-pozytywne- stosowane do uwidocznienia np. otoczek śluzowych bakterii. Wybarwia się tu zarówno komórkę jak i tło. Do barwienia używa się tu fuksyny. Barwi się tu np. Klebsiella pneumoniae- komórki te posiadają duże otoczki.
-pozytywne (proste i złożone) na szkiełku podstawowym umieścić 1-2 oczka ezy zawiesiny bakteryjnej. Zawiesinę rozprowadzić na szkiełku ezą. Szkiełko pozostawić na powietrzu do wyschnięcia. Preparat utrwalić przesuwając 3-4 razy szkiełko nad płomieniem palnika. W tej metodzie barwienia używane są barwniki zabarwiające drobnoustroje, preparaty są utrwalane.
1. W barwieniu pozytywnym prostym wykorzystywany jest błękit metylenowy Loefflera, lub fuksyna przez 3-5 min., lub safraniną na kolor różowy przez 15-30 sekund. Określamy tu kształt i ugrupowania bakteryjne. Używany jest tu również barwnik Giemsy który wybarwia drobnoustroje na różne kolory.
2. W barwieniu pozytywnym złożonym szereg barwników w ściśle określonej kolejności, odbarwiacze i bejce. Możemy tu również wyróżnić metody specjalne: Shaffer-Fultona, Würtza np. do endospor: barwimy tą metodą otoczki, rzęski-metodą srebrową. Przykładami takiego barwienia jest barwienie metoda gramma, metoda Neissera, metoda Zehl-Neelsena:
a) barwienie metodą Gramma. Jest to barwienie złożone, różnicujące, dzięki niemu dzielimy bakterie na g+ i g-. Bakterie barwiące się w tej metodzie pozytywnie są koloru fioletowego i są to g+. Bakterie nie barwiące się w metodzie gramma są koloru różowego to g- (zatrzymują one barwnik kontrastowy-fuksynę). Grzyby drożdżowe barwią się w tej metodzie pozytywnie są g+. Metoda- zabarwić fioletem krystalicznym 1-3 min, płukanie wodą, płyn Lugola 1-2 min., płukanie wodą, odbarwienie alkoholem-etanolem 30 sek., płukanie wodą, barwienie safraniną lub fuksyną 15-20 sek., płukanie wodą, suszenie bibułą oglądanie pod mikroskopem z immersją (olejkiem immersyjnym). W wyniku działania fioletu krystalicznego i płynu Lugola powstaje kompleks tego barwnika z jodem, usuwany alkoholem u g-, pozostający u g+. U g+ ściana kom. Składa się z wielu warstw peptydoglikanu który odwodniony alkoholem zostaje uszczelniony. U g- jest zbyt mała ilość peptydoglikanu bu zatrzymał on kompleks barwnik-jod w komórce, a jego błona zewnętrzna zostaje zniszczona gdyż dzięki alkoholowi następuje w niej zanik fosfolipidów tak więc w późniejszym stadium komórka zabarwia się na różowo.
b) barwienie metodą Ziehl-Neelsena (kwasoodporność bakterii)- barwienie specjalne- jest to barwienie złożone i różnicujące. Stosuje się je dla drobnoustrojów kwasoodpornych (prątki, promieniowce, przetrwalniki laseczek). Prątki i promieniowce posiadają odmienną chemicznie ścianę komórkową w porównaniu z bakteriami niekwasoopornymi. Zawierają one dużą ilość lipidów (kwas mykolowy-warunkuje kwasoodporność). Cecha ta może być uwidoczniona dzięki tej metodzie barwienia- wprowadzenie do komórek na gorąco roztworu fuksyny karbolowej. W tej metodzie nie można wypłukać tego barwnika dzięki alkoholowi etylowemu zakwaszonemu kwasem solnym. Dobarwia się tutaj również barwnikiem kontrastowym- błękitem metylenowym co ułatwia rozpoznawanie prątków (czerwone na niebieskim tle preparatu).
c) barwienie metodą Neissera- jest to barwienie złożone wykorzystywane do barwienia w komórkach maczugowców polifosforanów, występujących tam w postaci wtrętów komórkowych (ziarnistości zwykle na końcach komórek). Wtręty te wiążą w większym stopniu barwnik Neissera ( mieszanka fioletu krystalicznego i błękitu metylenowego w alkoholu) niż cytoplazma. Dobarwianie komórki roztworem chryzoidyny powoduje iż staje się ona żółta (chryzoidyna wypiera barwnik główny z cytoplazmy).
-przyżyciowe- barwienie proste-metoda ta polega na działaniu na nieutrwalony preparat żywych drobnoustrojów barwnikiem w dużym rozcieńczeniu, nie niszcząc komórek. Tą metodą można wybarwiać drożdże i grzyby nitkowate, promieniowce błękitem metylenowym w rozcieńczeniu 1:10 000. Zabarwieniu ulegają komórki ze zniszczoną ściana komórkową. U drożdży błękit metylenowy w nietoksycznym stężeniu przechodzi do komórki ulega redukcji w wyniku działania dehydrogenaz i zostaje przekształcony do formy bezbarwnej. Pełni on rolę sztucznego akceptora wodoru i jest nazywany leukobłękitem metylenowym. Przy dostępie tlenu może ulec utlenieniu do formy wyjściowej. Oceniamy to wiek hodowli- komórki martwe zabarwiają się, a żywe nie.
Wykonywanie preparatów-technika.
Mamy do czynienia z preparatami mokrymi i suchymi. Mokre służą do oglądania bakterii przyżyciowo- glonów, drożdży, grzybów nitkowatych, promieniowców. Do ich przygotowania używa się szkiełek podstawowych (umytych chromianką lub detergentem wypłukanych i odtłuszczonych przez przemycie alkoholem etylowym), szkiełek nakrywkowych. Preparaty suche uzyskiwane są po utrwaleniu oraz wybarwieniu drobnoustrojów na szkiełku. Utrwalenia dokonać można dzięki czynnikom fizycznym: (ogrzewanie szkiełka z rozmazem w płomieniu palnika) lub chemicznym (alkohol etylowy, metylowy, formalina, kwas osmowy). Materiał utrwalamy w celu zabicia żyjących tam drobnoustrojów, a co za tym idzie dla ułatwienia wnikania barwników do wnętrza komórek bakteryjnych. Zabieg ten przeciwdziała również usunięciu w sposób mechaniczny drobnoustrojów ze szkiełka podczas płukania preparatu.
1