IG.3 - Indukcja i detekcja uszkodzeń oksydacyjnych w komórkach eukariotycznych HPLC-ECD, Genetyka, Inżynieria genetyczna


Ćwiczenie 3 (12.03.2010)

,,Indukcja i detekcja uszkodzeń oksydacyjnych w komórkach eukariotycznych (HPLC-ECD)"

Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:

- wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC);

- detekcja UV-ViS i elektrochemiczna (ECD);

- modyfikacje zasad azotowych w kwasach nukleinowych (8-OH-dG i 8-OH-G);

- uszkodzenia oksydacyjne w DNA komórek nowotworowych po UV.

W trakcie ekspozycji komórek na promieniowanie UV dochodzi do zmian strukturalnych w obrębie DNA/RNA. Modyfikacjom ulęgają głównie zasady azotowe, w sąsiadujących nukleotydach mogą wytworzyć się wiązania, które są następnie usuwane przez kompleksy enzymatyczne fotoliaz. Zmiany mogą powstawać w obrębie samego pierścienia purynowego/pirymidynowego zasady azotowej, poprzez przyłączenie powstałego rodnika hydroksylowego. Poziom 8-OH-dG w wyizolowanym DNA może być markerem stresu oksydacyjnego w komórkach.

W trakcie ćwiczeń do identyfikacji oksydowanych pochodnych nukleozydowych wykorzystany zostanie system HPLC-High Performance Liquid Chromatography firmy ESA z detektorem elektrochemicznym Coulochem III, połączony z detektorem UV firmy WATERS.

MATERIAŁY I METODY:

- linie komórkowe (komórki kontrolne i traktowane promieniowaniem UV) HBL-100 (nowotwór piersi) i Me45 (czerniak);

- urządzenie emitujące promieniowanie UV z możliwością regulacji dawki [J/m2], w celu indukcji uszkodzeń w DNA;

- zestaw do izolacji DNA firmy A&A Biotechnology (izolacja wg protokołu B z ćwiczeń 1);

- bufor octanowy 40 mmol/l zawierający 0,1 mmol/l ZnCl2, pH=5.1;

- bufor Tris-HCl 1 mol/l, pH=8.5;

- nukleaza P1 (Sigma) z Penicillum Citrinum;

- fosfataza alkaliczna z E. Coli (Sigma);

- eluent do HPLC: octan sodu (100 mmol/l), metanol 5 % (v/v), pH=5.0;

- roztwory wzorcowe 8-hydroksy-2'deoksyguanozyny (8-OH-dG);

- roztwory wzorcowe 2'-deoksyguanozyny (dG).

WYKONANIE:

  1. Indukcja uszkodzeń oksydacyjnych promieniowaniem UV:

- otrzymane szalki z komórkami opisać wg wzoru: K-kontrola; UV-0h; UV-1h;

- komórki, poza kontrolnymi, poddać napromienieniu dawką 2000J/m2;

- poprzez trypsynizację zebrać komórki z odpowiednich punktów czasowych, pozostałe inkubować w ciemności w 37ºC.

2. Izolacja DNA (wg protokołu B z ćwiczeń 1). Zebrane z kolumny DNA oznaczyć spektrofotometrycznie, przechowywać w -20 ºC do następnych ćwiczeń.

  1. Przygotowanie wzorców.

- z otrzymanych roztworów wyjściowych 8-OH-dG i dG sporządzić po 500 µl mieszaniny dwóch wzorców o następujących stężeniach molowych:

8-OH-dG [nM]

dG [µM]

objętość końcowa

33.3

100

500 µl

16.15

50

500 µl

8.3

25

500 µl

4.02

12.5

500 µl

  1. Detekcja wzorców w przygotowanych mieszaninach za pomocą HPLC-ECD (krzywa kalibracyjna):

- po uruchomieniu i zaprogramowaniu zestawu do detekcji przystąpić do nastrzykiwania mieszanin na kolumnę (jednorazowo po 20µl).

UWAGA: przed nastrzyknięciem każda próbka powinna być przefiltrowana przez filtr o średnicy porów 22 µm, w celu uniknięcia zanieczyszczenia kolumny!!!

4. Analiza wyników pochodzących z detektorów UV-VIS oraz EC.

5. W wolnym czasie należy przygotować świeży eluent (1 litr na grupę, ustalić pH 5.0).

KONTYNUACJA NA KOLEJNYCH ĆWICZENIACH

  1. Do wyizolowanego DNA dodać podwójną objętość 70% EtOH.

  2. 30 min wytrącać w -20 ºC.

  3. Zwirować prze 30 min na max. obrotach w +4ºC.

  4. Odrzucić alkohol, a osad suszyć na wolnym powietrzu.

  5. Dodać ogrzanego do 37oC buforu octanowego dla nukleazy (48μl).

  6. Inkubować 15 min. na termo mikserze.

  7. Dodać 2μl nukleazy P1.

  8. Wymieszać.

  9. Inkubować 1h w 37oC, z wytrząsaniem.

  10. Dodać Tris 1M o pH 8,5 (15μl), całość zworteksować.

  11. Dodać fosfatazy alkalicznej (5,3μl).

  12. Inkubować jak w pkt.9.

  13. Wirować 1h, 12500rpm. (wirówka wcześniej schłodzona temp. 4oC)

  14. Na kolumnę HPLC podawać po 20 μl ultrafiltratu, detekcje prowadzić przy ustawieniach aparatu:

Detektor ECD (Coulochem III):

-czułość 20nA,

-elektrolit (5% metanol, 100mM octan sodu, pH=5,0)

-prędkość przepływu 1 ml/min

Detektor UV:



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
IG.7 - Detekcja zakażeń w hodowlach komórkowych techniką PCR, Genetyka, Inżynieria genetyczna
Budowa komorki eukariotycznej czesc VI mitochondrium i jadro komorkowe
Biologia część I, Budowa komórki Eukariotycznej i funkcje jej organelli
Budowa komórki eukariotycznej
Cytozol komórki eukariotycznej
Komórka Eukariotyczna
Organizacja komórki eukariotycznej(1)
Budowa komórki eukariotycznej część II
Budowa Komórki Eukariotycznej cz I
komorka eukariotyczna
Biologia część I Budowa komórki Eukariotycznej i funkcje jej organelli
KOMORKA EUKARIOTYCZNA
Wyjaśnij dlaczego w komórkach eukariotycznych wykorzystywany jest tak często mechanizm śmierci apopt
lab 3 Budowa komorki eukariotycznej
Budowa komórki eukariotycznej część III
IG.6 - Oznaczanie aktywności enzymatycznej metaloproteinaz komórkowych, Genetyka, Inżynieria genetyc
KOMÓRKA EUKARIOTYCZNA wyklad 5
KOMÓRKA EUKARIOTYCZNA, biologia- studia, Operon - biologia - notatki (jamjesttys)
Komórki eukariotyczne i prokariotyczne, Notatki(1)

więcej podobnych podstron