BIOTECHNOLOGIA W OCHRONIE ŚRODOWISKA
Ćwiczenie 1 : Bioremediacja gleb skażonych metalami ciężkimi
Bioremediacja - technologia usuwania zanieczyszczeń (głównie substancji ropopochodnych) z gleby i wód podziemnych za pomocą żywych mikroorganizmów w celu katalizowania, destrukcji lub transformacji różnego rodzaju zanieczyszczeń w formy mniej szkodliwe. W bioremediacji metali ciężkich z gleby wykorzystuje się naturalne zdolności mikroorganizmów do powierzchniowego wiązania metali przez polimery i makrocząsteczki występujące w osłonach komórkowych (biosorpcja) oraz wewnątrzkomórkowe wiązanie metali.
Wykorzystywane są mikroorganizmy występujące naturalnie w środowisku. Właściwości degradacyjne posiadają bakterie, grzyby i drożdże dla których naturalnym środowiskiem życia jest gleba. Posiadają one zdolności do wykorzystywania związków ropopochodnych jako jedynego źródła węgla w przemianach metabolicznych. Są to np. n-alkany, alkany rozgałęzione cykliczne alkany, węglowodory aromatyczne, policykliczne węglowodory aromatyczne. Mikroorganizmy degradują je zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych.
Cel ćwiczeń : Zastosowanie grzybów mikoryzowych do oczyszczania gleb skażonych ciężkimi metalami.
Analiza mikrobiologiczna i enzymatyczna badanych gleb:
Do 90 cm3 soli fizjologicznej dodajemy 10g gleby. Wytrząsamy przez 10 min. Po sedymentacji makrocząsteczek sporządzono kolejne rozcieńczenie pobierając po 1 ml i dodając do próbówek z solą fizjologiczną. Wykonano kolejne rozcieńczenia.
Podłoża stałe
Na podłoża stałe wykonano posiew:
- podłoże Chapek-Doxa posiew od 10-1 do 10-4, określenie liczby grzybów pleśniowych
- podłoże ze skrobią od 10-2 do 10-5 , określa liczbę bakterii rozkładających skrobię (wykorzystujących skrobię jako subtancję odżywczą)
- podłoże Fraziera od 10-2 do 10-5, określenie liczebności bakterii proteolitycznych
- podłoże BA od 10-3 do 10-6, określenie liczebności bakterii
- podłoże z fioletem krystalicznym od 10-1 do 10-4, wzrost bakterii Gramm -
Podłoża płynne
Na podłoża płynne wykonano posiew:
- podłoże z KNO3 od 10-2 do 10-8
- podłoże z wodą peptonową od 10-1 do 10-7 Do probówek włożono paski bibuły nasączone octanem ołowiu
- podłoże z argininą (podłoże półpłynne) od 100 do 10-4
- podłoże z mocznikiem od 100 do 10-4
Na wszystkie podłoża stałe naniesiono 0,1 ml próbek glebowych o odpowiednim rozcieńczeniu. Do podłoży płynnych wprowadzono 0,5 ml próbek glebowych o odpowiednim rozcieńczeniu. Natomiast w przypadku podłoża półpłynnego odpowiednie próbki glebowe wprowadzono za pomocą drucika, wbijając go delikatnie w podłoże.
Posiewy inkubowano w temperaturze 28oC przez 7 dni.
Wyniki:
Podłoża stałe
|
Liczebność w 1g s.m. gleby |
||||
|
Bakterie |
Bakterie Gram - |
Bakterie proteolityczne |
Grzyby |
Stosunek B/G |
Gleba skażona metalami |
4,7 x 108 |
5,7 x 106 |
3,33 x 107 |
4,6 x 105 |
23500:23 |
Podłoża płynne i półpłynne:
-miano bakterii rozkładających mocznik wynosi 10-1
- miano bakterii rozkładających argininę wynosi 10-2
- miano bakterii rozkładających aminokwasy zawierające siarkę wynosi 10-4
-miano bakterii redukujących
(przeprowadzających całkowitą denitryfikację) wynosi 10-5
Częściowa denitryfikacja wystąpiła w stężeniu 10-7, lecz była spowodowana zanieczyszczeniem próby przez grzyb.
Czas trwania oczyszczania gleby z metali ciężkich trwał 2 tygodnie, po czym ponownie wykonaliśmy posiewy na wszystkie podłoża hodowlane.
Wyniki
Podłoża stałe
|
Liczebność w 1g s.m. gleby |
||||
|
Bakterie |
Bakterie Gram - |
Bakterie proteolityczne |
Grzyby |
Stosunek B/G |
Gleba po 2 tyg. oczyszczaniu |
4,8 x 106 |
2,6 x 106 |
1,5 x 106 |
2,6 x 106 |
|
Podłoża płynne i półpłynne:
-miano bakterii rozkładających mocznik wynosi 10-2
- miano bakterii rozkładających argininę wynosi 10-3
- miano bakterii rozkładających aminokwasy zawierające siarkę wynosi 10-3
-miano bakterii redukujących
(przeprowadzających całkowitą denitryfikację) wynosi 10-5
Częściowa denitryfikacja wystąpiła w stężeniu 10-6, lecz była spowodowana zanieczyszczeniem próby przez grzyby.
Porównanie wyników
|
||||
|
Bakterie |
Bakterie Gram - |
Bakterie proteolityczne |
Grzyby |
Gleba po 2 tyg. oczyszczaniu |
4,8 x 106 |
2,6 x 106 |
1,5 x 106 |
2,6 x 106 |
Gleba skażona metalami |
4,7 x 108 |
5,7 x 106 |
3,33 x 107 |
4,6 x 105 |
Po dwu tygodniowym oczyszczaniu gleby z metali ciężkich zaobserwowano spadek ogólnej liczebności gleby. Liczebność bakterii Gram - praktycznie nie zmieniła. Liczebność bakterii proteolitycznych zmalała a liczebność grzybów w glebie po oczyszczaniu wzrosła.
Ćwiczenie 2: Analiza mikrobiologiczna osadu czynnego
Osad czynny to mieszane kultury mikroorganizmów biorące aktywny udział w oczyszczaniu ścieków i zdolne do tworzenia łatwo opadalnych zawiesin.
Najbardziej liczną grupę mikroorganizmów osadu czynnego stanowią bakterie. W skład osadu czynnego wchodzą również grzyby mikroskopowe Ascoidea, Fusarium, Subbaromyces, Sepedonium, Aspergillus, Cladosporium, Mucor, Trichoderma, Trichosporon, Rhizopus, a także liczne osiadłe i wolnopływające pierwotniaki, wrotki, nicienie, larwy owadów oraz pajęczaki. Usuwanie związków organicznych ze ścieków zachodzi z udziałem bakterii heterotroficznych, głównie z rodzaju Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Alcaligenes, Moraxella i Flavobacterium. W ściekach organiczne związki azotu są utleniane do azotanów (III) i azotanów przez bakterie nitryfikacyjne - Nitrosomonas i Nitrobacter. Azotany są usuwane ze ścieków przez bakterie denitryfikacyjne wykorzystujące te związki jako akceptory elektronów w procesach oddychania beztlenowego. W warunkach tlenowych następuje również utlenianie zredukowanych związków siarki do siarczanów z udziałem bakterii z rodzaju Acidithiobacillus. Znaczenie w procesie kształtowania kłaczków o znacznych rozmiarach mają też niektóre bakterie nitkowate, jednak ich nadmierny wzrost może powodować puchnięcie i/lub pienienie osadu. Frakcja mikroorganizmów stanowi od 5 do 20% całości kłaczków, resztę stanowi substancja o charakterze koloidalnym.
Przebieg:
Z kolby stożkowej pobrano próbkę (100 cm3) osadu czynnego i wlano do cylindra miarowego. Następnie pozostawiono próbkę na 30 min i po ustalonym czasie zmierzono ile objętości zajmuje woda a ile osad, który opadł.
Następnie przeprowadzono obserwacje pod mikroskopem aby określić średnią liczbę i wielkość kłaczków oraz mikroorganizmów występujących w osadzie czynnym w 10 polach widzenia. W celu określenia czy kłaczki są natlenowane, naniesiono kroplę osadu czynnego na szkiełko a następnie dodano kroplę błękitu metylenowego.
Wyniki:
Gęsty osad, duża ilość kłaczków po 30 minutach sedymentacji 75cm3zajmował osad, a 25 cm3 woda. Osad miał kolor ciemno brunatny. Nad osadem ciecz miała małą mętność.
Kłaczki rozgałęzione z gąbczastą strukturą, duże i dosyć liczne w polu widzenia. Kłaczki po zabarwieniu błękitem metylenowym są niebieskie co świadczy o dobrym natlenowaniu w osadzie czynnym. W próbkach były widoczne liczne pałeczki, ziarniaki oraz laseczki Gramm + (na preparacie widoczny sznur laseczek G+), oraz pałeczki Gramm -. Zauważalne sporadycznie ameby nagie czyli tzw. Korzenionóżki (organizmy jednokomórkowe pokryte cienka pellikulą, cechuje je duża zmienność kształtów) oraz sporadyczne wrotki (ruchliwe, wielokomórkowe organizmy o podłużnym kształcie).
Ćwiczenie 3: Określenie zawartości kadmu i ołowiu w glebach pochodzących z terenów o różnych stopniu zakażenia
Zawartość metali
- OŁÓW 88,6 MG/KG
- KADM 43,2 MG/KG
Zawartość metali po 2 tygodniach
- OŁÓW 40,3 MG/KG
- KADM 32,2 MG/KG
Dominika Sławacka
Dominika Szewczak
Karolina Sochacka
Izabela Woch